Este protocolo permite a avaliação local da arquitetura do colágeno e das características de falha mecânica do tecido fibroso da placa. Uma vez que as avaliações estruturais e mecânicas foram realizadas na mesma amostra de tecido, esta técnica permite desvendar a ligação funcional entre as avaliações estruturais e mecânicas do tecido. O conhecimento obtido com este protocolo sobre a estrutura do tecido da placa fibrosa e as características de falha é fundamental para prevenir e predizer eventos clínicos fatais desencadeados pela ruptura da placa aterosclerótica.
Para começar, corte a placa aberta ao longo do eixo longitudinal da artéria usando tesoura cirúrgica e pinça. Recorte amostras de teste retangulares dos corpos de prova de placa, garantindo que as amostras sejam tão grandes quanto possível, evitando regiões de tecido contendo lágrimas ou calcificações. Em seguida, pegue uma amostra de teste de placa e fixe ambas as extremidades no silicone, fixando agulhas no tecido.
Insira as agulhas na região da amostra que estarão nas braçadeiras do dispositivo de ensaio de tração durante o ensaio mecânico. Coloque óculos de segurança. Use um cortador lateral para encurtar as agulhas para que elas fiquem a menos de alguns milímetros acima da superfície da amostra para evitar que danifiquem a objetiva do microscópio.
Encha a placa de Petri com PBS até que a amostra esteja submersa. Em seguida, ligue o sistema de microscópio, gire a chave multifóton e abra o software operacional do microscópio. Coloque a placa de Petri contendo a amostra de teste sob a objetiva e abaixe a objetiva do microscópio.
Ative o modo de varredura ao vivo. Mova a objetiva para um canto da amostra usando os botões no painel inteligente e clique no símbolo de posição da marca no painel Digitalização de blocos. Se executada corretamente, uma grade com todos os blocos selecionados para geração de imagens aparecerá em laranja.
Em seguida, clique em Iniciar no canto inferior direito da tela para criar uma varredura de bloco de toda a superfície de amostra para obter uma visão geral da geometria da amostra. Após a varredura do bloco, observe as coordenadas X e Y do canto superior esquerdo do bloco superior esquerdo no painel Varredura de blocos mostradas automaticamente. Observe essas coordenadas em uma planilha.
No painel Varredura de blocos, observe o número de blocos nas direções X e Y na caixa chamada ScanField. Observe o tamanho da verificação de bloco na planilha. Calcule as coordenadas dos outros blocos adicionando ou subtraindo o tamanho do bloco.
Na varredura de blocos, selecione os blocos a serem fotografados com uma segunda geração harmônica ou imagem SHG. Para a seleção, evite azulejos nas braçadeiras e deixe uma telha entre cada telha selecionada no sentido longitudinal e circunferencial. Em seguida, identifique o local dos blocos a serem visualizados usando as coordenadas calculadas nesta planilha.
Preencha as coordenadas nas caixas designadas e clique em Enter para que o objetivo se mova para o bloco direito. Ative o modo de varredura ao vivo. Aumente a potência do laser multifóton, ou MP, usando o controle deslizante no painel superior e as configurações de caminho do feixe para obter a maior potência de laser possível sem branqueamento significativo.
Em seguida, ajuste o ganho do detector para obter imagens brilhantes sem pixels saturados usando o botão no painel inteligente ou clicando no nome do detector e nas configurações do caminho do feixe e canais adicionais. Os valores típicos para o ganho do detector estão entre 500 e 800 volts. Use o botão de posição Z no painel inteligente para ajustar o plano de foco.
Em seguida, mova para a parte superior da amostra e defina as posições da parte superior da pilha Z clicando na ponta da seta no painel Pilha Z na guia Aquisição do terceiro painel. Em seguida, concentre-se na amostra até que o sinal SHG não seja mais detectado. Novamente, clique na ponta da seta no painel Z-stack para definir essa posição.
Quando terminar, desative o modo de varredura ao vivo. Na guia Aquisição no segundo painel, mantenha a velocidade de digitalização em 400 hertz, defina a média de linhas como duas e a resolução como 512 por 512 pixels por imagem usando as listas suspensas. Ative o botão de varredura X bidirecional.
Clique no tamanho do passo z no painel da pilha Z e preencha um tamanho do passo z de três mícrons na caixa. Clique em Iniciar no canto inferior direito da tela para criar uma pilha Z. Quando terminar, salve as coordenadas do bloco no nome do arquivo ou dê a cada bloco seu número.
Após a imagem, a amostra é exposta a testes mecânicos. Para gerar um padrão de spackle, segure o aerógrafo cheio de corante de tecido a aproximadamente 30 centímetros de distância da amostra de teste e pulverize-o na superfície lúmena. Em seguida, para o ensaio de tração uniaxial, coloque a amostra nas braçadeiras do testador de tração com a direção circunferencial da amostra alinhada com a direção de alongamento da tração e o lado lúmeno da amostra voltado para cima.
Certifique-se de que o comprimento do medidor inicial esteja definido para que a relação largura/comprimento da tira seja menor que um. Aperte os parafusos das alças aplicando um torque de 20 centímetros metros usando uma chave de fenda de torque. Adicionar PBS ao banho de aquecimento até que a amostra esteja submersa.
Rasgue a célula de carga e comece a registrar as medições globais de força e deslocamento da célula de carga e do atuador do testador de tração. Endireitar a amostra aplicando um pré-alongamento de 0,05 newton para se livrar da folga na amostra. Realizar 10 ciclos de pré-condicionamento, até 10% de deformação, com base na medição do comprimento do medidor pelo atuador após a aplicação do pré-alongamento.
Inicie o ensaio de tração uniaxial até a falha completa da amostra durante a gravação de um vídeo da deformação da amostra com a câmera de alta velocidade. Após a falha, pare de registrar as medições globais de força e deslocamento. Abra as pilhas Z obtidas durante a microscopia multifóton, ou MPM, com SHG na Imagem J e crie projeções de intensidade máxima, ou MIPs, de cada pilha Z.
Analise cada MIP com a ferramenta de análise de orientação de fibras baseada em MATLAB de código aberto para medir o ângulo de orientação das fibras de colágeno individuais presentes nas telhas. Use outra ferramenta baseada em MATLAB, FibLab, para ajustar uma distribuição gaussiana ao histograma de distribuição de ângulo. Do gráfico de distribuição gaussiano, extraia os parâmetros estruturais, como o ângulo predominante da fibra, que é o modo de distribuição, o desvio padrão da distribuição do ângulo da fibra e a fração anisotrópica.
Execute a inspeção visual nas imagens da câmera para identificar o quadro no qual ocorre o início da ruptura. Identifique visualmente o local de ruptura. Realizar a correlação digital de imagens, DIC, análise com o software ncorr baseado em MATLAB utilizando as imagens da câmera gravadas durante o ensaio de tração.
Selecione o último quadro antes do alongamento final até a falha como a imagem de referência. Para as imagens atuais, selecione ll imagens desde o início do alongamento final até o último quadro antes do quadro no qual ocorreu o início da ruptura. Selecione a superfície da amostra como a região de interesse ou ROI.
Exclua as áreas que estão perto dos grampos. Execute o DIC definindo o raio do subconjunto do parâmetro como 30 pixels, o espaçamento do subconjunto para três pixels, o ponto de corte da iteração para 50, a norma do ponto de corte do vetor de diferença para 10 para a potência de cinco, o raio de deformação para cinco e a etapa de propagação automática para cinco. A partir da análise DIC com ncorr, obtenha-se as distribuições de cepas Green-LaGrange ou Euleriana do ROI.
Use essas distribuições de deformação para calcular a deformação média de Green-LaGrange de toda a superfície da amostra de placa no último quadro antes da ruptura. Calcule a deformação Green-LaGrange no local da ruptura. Usando os pontos de referência naturais na amostra de teste, faça uma sobreposição da imagem de referência e da varredura do bloco para identificar o local de ruptura na varredura do bloco.
Identifique a telha MPM-SHG onde a ruptura aconteceu. Se a ruptura não estiver em uma telha digitalizada com o MPM-SHG, identifique a telha mais próxima do local de ruptura. Obtenha os parâmetros estruturais encontrados na telha onde ocorreu a ruptura.
Uma amostra de placa fresca e intacta com pouca ou nenhuma lágrima e macrocalcificações é mostrada aqui. Amostras de placas podem ser recuperadas de áreas que não incluem essas lágrimas e calcificações. A imagem SHG e o pós-processamento de imagem fornecem MIPs de cada bloco com imagem.
O pós-processamento adicional por detecção de fibras produz histogramas de orientação de fibra dos quais os parâmetros estruturais do colágeno podem ser extraídos. Além disso, mapas de cores mostrando os parâmetros estruturais locais de colágeno em toda a amostra de placa são obtidos para análise visual. A partir dessas amostras de teste, observou-se uma grande variação intraamostra nos parâmetros estruturais de colágeno.
O início e a propagação da ruptura em uma amostra de tecido em placa durante o teste de tração são demonstrados aqui. A análise de correlação de imagens digitais fornece mapas de deformação tecidual local, como os mapas de deformação Green-LaGrange. A partir desses mapas de deformação, observou-se uma grande variação intraamostra nas cepas locais.
Uma vez que o local de ruptura é identificado nas gravações da câmera, ele pode ser mapeado de volta para a imagem de referência da câmera e a varredura do bloco de microscopia. Isso fornece a telha MPM-SHG onde a ruptura aconteceu e os parâmetros estruturais encontrados nesta telha. Obter amostras de tecido fibroso que são livres de calcificações e são de um tamanho grande o suficiente viável para testes mecânicos pode ser uma tarefa desafiadora para placas fortemente calcificadas.
Uma vez que uma característica mecânica ou estrutural é identificada como preditora de insuficiência tecidual de placa fibrosa, um sistema de imagem in vivo medindo essa característica permitirá prever o risco de ruptura da placa em pacientes.
