Ce protocole permet les évaluations locales de l’architecture du collagène et des caractéristiques de défaillance mécanique du tissu fibreux de la plaque. Étant donné que les évaluations structurelles et mécaniques ont été effectuées sur le même échantillon de tissu, cette technique permet de démêler le lien fonctionnel entre les évaluations structurelles et mécaniques du tissu. Les connaissances acquises avec ce protocole sur la structure du tissu fibreux de la plaque et les caractéristiques de défaillance sont essentielles pour prévenir et prédire les événements cliniques mortels déclenchés par la rupture de la plaque d’athérosclérose.
Pour commencer, ouvrez la plaque le long de l’axe longitudinal de l’artère à l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler. Découpez des échantillons d’essai rectangulaires à partir des échantillons de plaque, en veillant à ce que les échantillons soient aussi grands que possible tout en évitant les régions tissulaires contenant des déchirures ou des calcifications. Ensuite, prenez un échantillon de test de plaque et fixez ses deux extrémités au silicone en épinglant des aiguilles dans le tissu.
Insérez les aiguilles dans la région de l’échantillon qui seront dans les pinces du dispositif d’essai de traction pendant l’essai mécanique. Mettez des lunettes de sécurité. Utilisez un cutter latéral pour raccourcir les aiguilles afin qu’elles dépassent à moins de quelques millimètres au-dessus de la surface de l’échantillon afin d’éviter qu’elles n’endommagent l’objectif du microscope.
Remplissez la boîte de Petri avec du PBS jusqu’à ce que l’échantillon soit immergé. Ensuite, allumez le système de microscope, tournez la clé multiphotonique et ouvrez le logiciel d’exploitation du microscope. Placez la boîte de Petri contenant l’échantillon d’essai sous l’objectif et abaissez l’objectif du microscope.
Activez le mode d’analyse en direct. Déplacez l’objectif vers un coin de l’échantillon à l’aide des boutons de l’écran dynamique et cliquez sur le symbole de position de marque dans le panneau Mosaïque. Si cette opération est effectuée correctement, une grille avec toutes les vignettes sélectionnées pour l’imagerie apparaîtra en orange.
Ensuite, cliquez sur Démarrer dans le coin inférieur droit de l’écran pour créer une analyse de tuiles de l’ensemble de la surface de l’échantillon afin d’obtenir une vue d’ensemble de la géométrie de l’échantillon. Après l’analyse des mosaïques, observez les coordonnées X et Y du coin supérieur gauche de la vignette supérieure gauche dans le panneau Numérisation des vignettes qui s’affiche automatiquement. Notez ces coordonnées dans une feuille de calcul.
Dans le panneau Numérisation des mosaïques, observez le nombre de vignettes dans les directions X et Y de la zone appelée ScanField. Notez la taille de l’analyse par vignette dans la feuille de calcul. Calculez les coordonnées des autres mosaïques en ajoutant ou en soustrayant la taille de la mosaïque.
À partir de la numérisation de tuiles, sélectionnez les tuiles à imager avec une deuxième génération d’harmoniques, ou imagerie SHG. Pour la sélection, évitez les carreaux dans les pinces et laissez un carreau entre chaque carreau sélectionné dans le sens longitudinal et circonférentiel. Ensuite, identifiez l’emplacement des vignettes à imager à l’aide des coordonnées calculées dans cette feuille de calcul.
Renseignez les coordonnées dans les cases désignées et cliquez sur Entrée pour que l’objectif se déplace vers la vignette de droite. Activez le mode d’analyse en direct. Augmentez la puissance laser multiphotonique, ou MP, en utilisant le curseur dans le panneau supérieur et les paramètres de trajectoire du faisceau pour obtenir la puissance laser la plus élevée possible sans blanchiment important.
Ensuite, réglez le gain du détecteur pour obtenir des images lumineuses sans pixels saturés en utilisant le bouton sur le panneau intelligent ou en cliquant sur le nom du détecteur et les paramètres de trajet du faisceau et des canaux supplémentaires. Les valeurs typiques du gain du détecteur sont comprises entre 500 et 800 volts. Utilisez le bouton de position Z sur le panneau intelligent pour régler le plan de mise au point.
Ensuite, déplacez-vous vers le haut de l’échantillon et définissez les positions du haut de la pile Z en cliquant sur la pointe de flèche dans le panneau Z-stack sous l’onglet Acquisition du troisième panneau. Ensuite, concentrez-vous sur l’échantillon jusqu’à ce que le signal SHG ne soit plus détecté. Encore une fois, cliquez sur la pointe de flèche dans le panneau Z-stack pour définir cette position.
Lorsque vous avez terminé, désactivez le mode d’analyse en direct. Sous l’onglet Acquisition du deuxième panneau, maintenez la vitesse de numérisation à 400 hertz, définissez la moyenne des lignes sur deux et la résolution sur 512 x 512 pixels par image à l’aide des listes déroulantes. Activez le bouton de numérisation bidirectionnel X.
Cliquez sur la taille z-step dans le panneau Z-stack et remplissez une taille z-step de trois microns dans la boîte. Cliquez sur Démarrer dans le coin inférieur droit de l’écran pour créer une pile Z. Lorsque vous avez terminé, enregistrez les coordonnées de la vignette dans le nom de fichier ou attribuez son numéro à chaque vignette.
Après l’imagerie, l’échantillon est exposé à des tests mécaniques. Pour générer un motif de spackle, tenez l’aérographe rempli de colorant tissulaire à environ 30 centimètres de l’échantillon d’essai et vaporisez-le sur la surface lumineuse. Ensuite, pour l’essai de traction uniaxiale, placez l’échantillon dans les pinces de l’essayeur de traction avec la direction circonférentielle de l’échantillon alignée sur la direction d’étirement de traction et le côté lumineux de l’échantillon vers le haut.
Assurez-vous que la longueur initiale de la jauge est réglée de manière à ce que le rapport largeur/longueur de la bande soit inférieur à un. Serrez les vis des poignées en appliquant un couple de 20 centinewton-mètres à l’aide d’un tournevis couple. Ajouter le PBS dans le bain chauffant jusqu’à ce que l’échantillon soit immergé.
Déchirez le capteur de force et commencez à enregistrer les mesures globales de force et de déplacement du capteur de force et de déplacement du capteur de traction. Redresser l’échantillon en appliquant un pré-étirement de 0,05 newton pour éliminer le mou dans l’échantillon. Effectuer 10 cycles de pré-conditionnement, jusqu’à 10% de déformation, en fonction de la mesure de la longueur de la jauge par l’actionneur après l’application du pré-étirement.
Démarrez l’essai de traction uniaxial jusqu’à défaillance complète de l’échantillon tout en enregistrant une vidéo de la déformation de l’échantillon avec la caméra haute vitesse. Après une défaillance, arrêtez d’enregistrer les mesures globales de force et de déplacement. Ouvrez les piles Z obtenues lors de la microscopie multiphotonique, ou MPM, avec SHG dans l’image J et créez des projections d’intensité maximale, ou MIP, de chaque pile Z.
Analysez chaque MIP avec l’outil open source d’analyse de l’orientation des fibres basé sur MATLAB pour mesurer l’angle d’orientation des fibres de collagène individuelles présentes dans les tuiles. Utilisez un autre outil basé sur MATLAB, FibLab, pour ajuster une distribution gaussienne à l’histogramme de distribution angulaire. À partir du diagramme de distribution gaussien, extrayez les paramètres structurels tels que l’angle prédominant de la fibre, qui est le mode de distribution, l’écart-type de la distribution de l’angle de fibre et la fraction anisotrope.
Effectuez une inspection visuelle sur les images de la caméra pour identifier le cadre dans lequel se produit le déclenchement de la rupture. Identifiez visuellement l’emplacement de la rupture. Effectuez l’analyse de corrélation d’images numériques, DIC, avec le logiciel ncorr basé sur MATLAB en utilisant les images de caméra enregistrées lors de l’essai de traction.
Sélectionnez la dernière image avant l’étirement final jusqu’à défaillance comme image de référence. Pour les images actuelles, sélectionnez toutes les images depuis le début de l’étirement final jusqu’à la dernière image avant l’image dans laquelle l’initiation de la rupture s’est produite. Sélectionnez la surface de l’échantillon comme région d’intérêt, ou ROI.
Excluez les zones proches des pinces. Effectuez DIC en définissant le rayon du sous-ensemble du paramètre sur 30 pixels, l’espacement des sous-ensembles sur trois pixels, le seuil d’itération sur 50, la norme de coupure du vecteur de différence sur 10 à la puissance de cinq, le rayon de déformation sur cinq et l’étape d’autopropagation sur cinq. À partir de l’analyse DIC avec ncorr, obtenir les distributions de déformation Green-LaGrange ou eulériennes du ROI.
Utilisez ces distributions de déformation pour calculer la déformation moyenne de Green-LaGrange de toute la surface de l’échantillon de plaque à la dernière image avant la rupture. Calculer la déformation Green-LaGrange à l’emplacement de la rupture. À l’aide des repères naturels de l’échantillon de test, effectuez une superposition de l’image de référence et du balayage des tuiles pour identifier l’emplacement de rupture sur le balayage des carreaux.
Identifiez la vignette MPM-SHG à l’endroit où la rupture s’est produite. Si la rupture ne se trouve pas dans une vignette numérisée avec le MPM-SHG, identifiez la vignette la plus proche de l’emplacement de rupture. Obtenez les paramètres structuraux trouvés au niveau de la tuile où la rupture s’est produite.
Un échantillon de plaque fraîche et intacte avec peu ou pas de déchirures et de macrocalcifications est montré ici. Des échantillons de plaque peuvent être prélevés dans des zones qui ne comprennent pas ces déchirures et calcifications. L’imagerie SHG et le post-traitement des images fournissent des MIP à partir de chaque mosaïque imagée.
Un post-traitement supplémentaire par détection de fibres produit des histogrammes d’orientation des fibres à partir desquels les paramètres structurels du collagène peuvent être extraits. En outre, des cartes de couleurs montrant les paramètres structurels locaux du collagène sur l’ensemble de l’échantillon de plaque sont obtenues pour une analyse visuelle. À partir de ces échantillons d’essai, une grande variation intra-échantillon des paramètres structurels du collagène a été observée.
L’initiation et la propagation de la rupture dans un échantillon de tissu de plaque pendant l’essai de traction sont démontrées ici. L’analyse numérique de corrélation d’images fournit des cartes de déformation tissulaire locale, telles que les cartes de souches Green-LaGrange. À partir de ces cartes de souches, une grande variation intra-échantillon des souches locales a été observée.
Une fois que l’emplacement de rupture est identifié sur les enregistrements de la caméra, il peut être mappé à l’image de la caméra de référence et au balayage des tuiles de microscopie. Cela fournit la tuile MPM-SHG où la rupture s’est produite et les paramètres structurels trouvés sur cette tuile. L’obtention d’échantillons de tissus fibreux exempts de calcifications et d’une taille suffisamment grande pour les essais mécaniques peut être une tâche difficile pour les plaques fortement calcifiées.
Une fois qu’une caractéristique mécanique ou structurelle est identifiée comme prédicteur de l’insuffisance du tissu fibreux de la plaque, un système d’imagerie in vivo mesurant cette caractéristique permettra de prédire le risque de rupture de la plaque chez les patients.
