Dieses Protokoll ermöglicht die lokale Beurteilung sowohl der Kollagenarchitektur als auch der mechanischen Versagenseigenschaften von fibrösem Plaquegewebe. Da sowohl strukturelle als auch mechanische Beurteilungen an derselben Gewebeprobe durchgeführt wurden, ermöglicht diese Technik die Entschlüsselung der funktionellen Verbindung zwischen der strukturellen und der mechanischen Beurteilung des Gewebes. Die mit diesem Protokoll gewonnenen Erkenntnisse über die Struktur und die Ausfalleigenschaften von fibrösen Plaquegeweben sind der Schlüssel zur Vorbeugung und Vorhersage klinischer tödlicher Ereignisse, die durch atherosklerotische Plaquerupturen ausgelöst werden.
Schneiden Sie zunächst die Plaque entlang der Längsachse der Arterie mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette auf. Schneiden Sie rechteckige Testproben aus den Plaqueproben aus, um sicherzustellen, dass die Proben so groß wie möglich sind, während Geweberegionen mit Rissen oder Verkalkungen vermieden werden. Als nächstes nehmen Sie eine Plaque-Testprobe und befestigen beide Enden am Silikon, indem Sie Nadeln in das Gewebe stecken.
Führen Sie die Nadeln in den Bereich der Probe ein, der sich während der mechanischen Prüfung in den Klemmen des Zugprüfgeräts befindet. Setzen Sie eine Schutzbrille auf. Verwenden Sie einen Seitenschneider, um die Nadeln so zu kürzen, dass sie weniger als ein paar Millimeter über die Probenoberfläche hinausragen, um zu verhindern, dass sie das Mikroskopobjektiv beschädigen.
Füllen Sie die Petrischale mit PBS, bis die Probe untergetaucht ist. Schalten Sie als Nächstes das Mikroskopsystem ein, drehen Sie die Multiphotonentaste und öffnen Sie die Betriebssoftware des Mikroskops. Stellen Sie die Petrischale mit der Testprobe unter das Objektiv und senken Sie das Mikroskopobjektiv ab.
Schalten Sie den Live-Scan-Modus ein. Bewegen Sie das Objektiv mit den Knöpfen auf dem Smart-Panel in eine Ecke der Probe und klicken Sie auf das Markierungspositionssymbol im Kachelscan-Bedienfeld. Bei korrekter Ausführung wird ein Raster mit allen ausgewählten Kacheln für die Bildgebung in Orange angezeigt.
Klicken Sie anschließend in der unteren rechten Ecke des Bildschirms auf Start, um einen Kachelscan der gesamten Probenoberfläche zu erstellen, um einen Überblick über die Probengeometrie zu erhalten. Beobachten Sie nach dem Kachelscan die X- und Y-Koordinaten der oberen linken Ecke der oberen linken Kachel im automatisch angezeigten Kachelscan-Bedienfeld. Notieren Sie sich diese Koordinaten in einer Tabelle.
Beobachten Sie im Bedienfeld "Kachelscan" die Anzahl der Kacheln in X- und Y-Richtung im Feld "ScanField". Notieren Sie sich die Größe des Kachelscans in der Tabelle. Berechnen Sie die Koordinaten der anderen Kacheln, indem Sie die Größe der Kachel addieren oder subtrahieren.
Wählen Sie aus dem Kachelscan die Kacheln aus, die mit einer zweiten harmonischen Generation oder SHG-Bildgebung abgebildet werden sollen. Vermeiden Sie bei der Auswahl Kacheln in den Klammern und lassen Sie eine Kachel zwischen jeder ausgewählten Kachel sowohl in Längs- als auch in Umfangsrichtung. Identifizieren Sie als Nächstes die Position der Kacheln, die abgebildet werden sollen, indem Sie die berechneten Koordinaten in dieser Tabelle verwenden.
Geben Sie die Koordinaten in die dafür vorgesehenen Felder ein und klicken Sie auf die Eingabetaste, damit sich das Ziel auf die rechte Kachel bewegt. Schalten Sie den Live-Scan-Modus ein. Erhöhen Sie die Multiphotonen- oder MP-Laserleistung, indem Sie den Schieberegler im oberen Bereich und die Strahlengangseinstellungen verwenden, um die höchstmögliche Laserleistung ohne nennenswertes Ausbleichen zu erhalten.
Passen Sie dann die Detektorverstärkung an, um helle Bilder ohne gesättigte Pixel zu erhalten, indem Sie den Knopf auf dem Smart Panel verwenden oder auf den Namen des Detektors und die Strahlengangseinstellungen und zusätzlichen Kanäle klicken. Typische Werte für die Detektorverstärkung liegen zwischen 500 und 800 Volt. Verwenden Sie den Z-Positionsknopf auf dem Smart Panel, um die Fokusebene einzustellen.
Bewegen Sie sich dann an den Anfang des Beispiels und legen Sie die Positionen der Oberseite des Z-Stapels fest, indem Sie auf die Pfeilspitze im Z-Stapel-Bedienfeld unter der Registerkarte "Erfassung" im dritten Bereich klicken. Konzentrieren Sie sich dann auf die Probe, bis das SHG-Signal nicht mehr erkannt wird. Klicken Sie erneut auf die Pfeilspitze im Z-Stapel-Bedienfeld, um diese Position festzulegen.
Wenn Sie fertig sind, schalten Sie den Live-Scan-Modus aus. Halten Sie auf der Registerkarte "Aufnahme" im zweiten Bereich die Scangeschwindigkeit bei 400 Hertz, stellen Sie den Liniendurchschnitt auf zwei und die Auflösung auf 512 x 512 Pixel pro Bild ein, indem Sie die Dropdown-Listen verwenden. Schalten Sie die bidirektionale X-Scantaste ein.
Klicken Sie im Z-Stapel-Panel auf die Z-Schritt-Größe und füllen Sie eine Z-Schrittgröße von drei Mikrometern in das Feld ein. Klicken Sie in der unteren rechten Ecke des Bildschirms auf Start, um einen Z-Stapel zu erstellen. Wenn Sie fertig sind, speichern Sie die Koordinaten der Kachel im Dateinamen oder geben Sie jeder Kachel ihre Nummer.
Nach der Bildgebung wird die Probe einer mechanischen Prüfung unterzogen. Um ein Spachtelmuster zu erzeugen, halten Sie die mit Gewebefarbe gefüllte Airbrush etwa 30 Zentimeter von der Testprobe entfernt und sprühen Sie sie auf die Lumenoberfläche. Als nächstes legen Sie für die einachsige Zugprüfung die Probe in die Klemmen des Zugprüfgeräts, wobei die Umfangsrichtung der Probe mit der Zugstreckrichtung ausgerichtet ist und die Lumenalseite der Probe nach oben zeigt.
Stellen Sie sicher, dass die anfängliche Messlänge so eingestellt ist, dass das Verhältnis von Breite zu Länge des Streifens kleiner als eins ist. Ziehen Sie die Schrauben der Griffe fest, indem Sie mit einem Drehmomentschraubendreher ein Drehmoment von 20 Zentinewtonmetern aufbringen. Geben Sie PBS in das Heizbad, bis die Probe eingetaucht ist.
Zerreißen Sie die Wägezelle und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der globalen Kraft- und Wegmessungen von der Wägezelle und dem Aktuator des Zugprüfgeräts. Begradigen Sie die Probe, indem Sie eine Vordehnung von 0,05 Newton anwenden, um den Durchhang in der Probe zu beseitigen. Führen Sie 10 Vorkonditionierungszyklen mit einer Dehnung von bis zu 10 % durch, basierend auf der Messlängenmessung durch den Aktuator nach dem Auftragen der Vordehnung.
Starten Sie den einachsigen Zugversuch bis zum vollständigen Versagen der Probe, während Sie mit der Hochgeschwindigkeitskamera ein Video der Probenverformung aufnehmen. Beenden Sie nach dem Ausfall die Aufzeichnung der globalen Kraft- und Wegmessungen. Öffnen Sie die Z-Stapel, die während der Multiphotonenmikroskopie (MPM) mit SHG in Bild J erhalten wurden, und erstellen Sie Projektionen mit maximaler Intensität (MIPs) für jeden Z-Stapel.
Analysieren Sie jede MIP mit dem Open-Source-Tool zur Analyse der Faserorientierung MATLAB, um den Orientierungswinkel der einzelnen Kollagenfasern in den Kacheln zu messen. Verwenden Sie ein anderes MATLAB-basiertes Tool, FibLab, um eine Gaußsche Verteilung an das Winkelverteilungshistogramm anzupassen. Extrahieren Sie aus dem Gaußschen Verteilungsdiagramm die strukturellen Parameter wie den vorherrschenden Faserwinkel, der die Art der Verteilung ist, die Standardabweichung der Faserwinkelverteilung und den anisotropen Anteil.
Führen Sie eine visuelle Inspektion der Kamerabilder durch, um den Rahmen zu identifizieren, in dem die Bruchinitiierung auftritt. Identifizieren Sie visuell die Bruchstelle. Führen Sie die Analyse der digitalen Bildkorrelation (DIC) mit der MATLAB-basierten Software ncorr unter Verwendung der während des Zugversuchs aufgezeichneten Kamerabilder durch.
Wählen Sie als Referenzbild das letzte Bild vor der endgültigen Dehnung bis zum Versagen aus. Wählen Sie für die aktuellen Bilder alle Bilder vom Beginn der letzten Dehnung bis zum letzten Bild vor dem Bild aus, in dem die Bruchinitiierung aufgetreten ist. Wählen Sie die Probenoberfläche als Region of Interest oder ROI aus.
Schließen Sie die Bereiche aus, die sich in der Nähe der Klemmen befinden. Führen Sie DIC durch, indem Sie den Teilmengenradius des Parameters auf 30 Pixel, den Teilmengenabstand auf drei Pixel, den Iterations-Cutoff auf 50, den Norm-Differenzvektor-Cutoff auf 10 hoch fünf, den Dehnungsradius auf fünf und den Autopropagationsschritt auf fünf festlegen. Aus der DIC-Analyse mit ncorr erhalten Sie die Green-LaGrange- oder Eulerschen Stammverteilungen des ROI.
Verwenden Sie diese Dehnungsverteilungen, um die durchschnittliche Green-LaGrange-Dehnung der gesamten Plaque-Probenoberfläche im letzten Rahmen vor dem Bruch zu berechnen. Berechnen Sie die Green-LaGrange-Dehnung an der Bruchstelle. Erstellen Sie anhand der natürlichen Orientierungspunkte im Testbeispiel eine Überlagerung des Referenzbilds und des Kachelscans, um die Bruchstelle auf dem Kachelscan zu identifizieren.
Identifizieren Sie die MPM-SHG-Kachel, an der der Bruch aufgetreten ist. Wenn sich der Bruch nicht in einer Kachel befindet, die mit dem MPM-SHG gescannt wurde, identifizieren Sie die Kachel, die der Bruchstelle am nächsten liegt. Ermitteln Sie die Strukturparameter, die sich an der Kachel befinden, an der der Bruch aufgetreten ist.
Hier ist eine frische und intakte Plaqueprobe mit wenig bis gar keinen Rissen und Makroverkalkungen zu sehen. Plaqueproben können aus Bereichen entnommen werden, die diese Risse und Verkalkungen nicht enthalten. SHG-Bildgebung und Bildnachbearbeitung liefern MIPs von jeder abgebildeten Kachel.
Die weitere Nachbearbeitung durch Faserdetektion liefert Faserorientierungshistogramme, aus denen Kollagenstrukturparameter extrahiert werden können. Darüber hinaus werden Farbkarten, die die lokalen strukturellen Kollagenparameter über die gesamte Plaqueprobe zeigen, für die visuelle Analyse erstellt. Bei diesen Testproben wurde eine große Variation der strukturellen Kollagenparameter innerhalb der Probe beobachtet.
Die Rupturinitiierung und -ausbreitung in einer Plaque-Gewebeprobe während des Zugversuchs wird hier demonstriert. Die digitale Bildkorrelationsanalyse liefert lokale Gewebedeformationskarten, wie z. B. die Green-LaGrange-Stammkarten. Aus diesen Stammkarten wurde eine große Intrasample-Variation in den lokalen Stämmen beobachtet.
Sobald die Bruchstelle auf den Kameraaufnahmen identifiziert ist, kann sie dem Referenzkamerabild und dem Mikroskopie-Kachelscan zugeordnet werden. Dies liefert die MPM-SHG-Kachel, an der der Bruch stattgefunden hat, und die strukturellen Parameter, die an dieser Kachel gefunden wurden. Die Gewinnung von fibrösen Gewebeproben, die frei von Verkalkungen sind und groß genug sind, um für mechanische Tests geeignet zu sein, kann eine herausfordernde Aufgabe für stark verkalkte Plaques sein.
Sobald ein mechanisches oder strukturelles Merkmal als Prädiktor für das Versagen des fibrösen Plaquegewebes identifiziert wurde, ermöglicht ein In-vivo-Bildgebungssystem, das dieses Merkmal misst, die Vorhersage des Plaquerupturrisikos bei Patienten.
