Gözenek oluşturan toksinlere karşı direnç mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Protokolümüz, genetik olarak izlenebilir ve fizyolojik olarak ilgili bir sistem olan Leishmania major'u kullanarak gözenek oluşturan toksinlere işlev ve mekanizma sağlar. Sitotoksisite testinin temel avantajı, gerçek zamanlı olarak toksinlerle mücadele edildiğinde orta verimli bir tahlilde tek hücre seviyesinde çoklu fenotiplerin hücre canlılığını karşılaştırmaktır.
Amfoterisin B gibi membran pertürbasyon ajanları Leishmania için ön cephe tedavileridir. Bu tahlil, amfoterisin B'yi ve/veya membrana zarar veren yeni ajanları güçlendiren ajanların tanımlanmasını sağlar. Bu tahlil, onarım yanıtlarıyla ilgili onarım yanıtı ve sinyal yolları gibi alanlar hakkında fikir verir.
Bu tahlil, Trypanosoma ve Naegleria fowleri gibi protozoanlara uygulanabilir. İnsanlar toksin seri seyreltme serisini anlamakta zorlanırlar. Bu yüzden verebileceğim en iyi tavsiye, deneyi kurmadan önce seri seyreltme serisinin bir şemasını çizmektir.
Başlamak için, lekesiz kontrol olarak ayrı bir tüpte 0,5 mililitre işlenmiş promastigot ayırın. Kalan promastigotlara mililitre başına 10 mikrogramlık bir son konsantrasyona mililitre propidium iyodür veya PI başına iki miligram ekleyin. Üç saniye boyunca vorteks.
V tabanlı, 96 delikli plaka veya Marsh tüplerinin her bir kuyucuğuna işlenmiş promastigotlar ekleyin ve plakayı veya tüp rafını buzun üzerine yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. Her toksinsiz kontrole propidium iyodür içeren 100 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Renkli olarak daha koyu görünen toplam hacmi 200 mikrolitre olan tüpleri görsel olarak tanımlayarak kontrolün doğru şekilde eklendiğini doğrulayın.
En yüksek seyreltmeye toksin hacmini ekleyin. Ardından, toksini seri olarak seyreltin. Pipet, karıştırmayı sağlamak için en az sekiz kez yukarı ve aşağı pinetleyin.
En düşük toksin konsantrasyonundan başlayarak, doğru sıraya hızlı bir şekilde 100 mikrolitre toksin ekleyin ve tüm toksin hücrelere eklenene kadar devam edin. Plakayı sızdırmazlık bandı ile kapatın. 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, plakayı paketleyin ve akış sitometresine taşıyın.
Veri toplama için, akış sitometresini ve edinme yazılımını üreticinin talimatlarına göre ve tesis politikasına göre kurmakla başlayın. Lekesiz L.major promastigot numunesini kullanarak, ileri ve yan saçılma için kapıları ve seçilen boyalara göre ilk floresan parametrelerini ayarlayın. Tek lekeli kontrolleri kullanarak, canlılık boyası ve floresan olarak etiketlenmiş toksinler için kapıları ayarlayın.
Mikrotıklar için zamana karşı ileri saçılımı izleyin ve sitometredeki her örnek için 10.000'den fazla kapılı olay elde edin. Veri analizi için, toplam tek hücreli L.major promastigotları, gerektiğinde ileri ve yan saçılma ve zamana geçit vererek kapılayın. Akış sitometresi için önerilen yükseklik veya alanı kullanın.
Ölü hücreleri PI yüksekliğinde tanımlayın ve kapılayın. Analiz için Excel'de doz-yanıt eğrisini düzenleyin. İki teknik çoğaltma arasındaki her koşul için ortalama PI yüksek yüzdesini belirleyin.
Toksin konsantrasyonu ve ortalama yüzde spesifik lizisin yanı sıra deneysel detaylar ve / veya ham yüzde PI yüksek hesaplamaları içerir. Dört sütunu daha Modellenmiş, Artıklar, Parametreler ve Parametre Değerleri olarak etiketleyin. İlk sütunların deneysel parametrelere, toksin konsantrasyonuna ve yüzde spesifik lizise karşılık geldiğini doğrulayın.
Parametre Değerleri sütununa değerleri girerek L, k ve c parametrelerini başlatın. Modellenmiş sütununda, lojistik modeli oluşturun. Artıklar sütununda, modellenen sayı ile gerçek spesifik lizis arasındaki farkın karesini hesaplayın.
Parametre Değerleri sütununda, TOPLA'nın yanında, Artıklar sütunundaki tüm değerleri toplayın. LC50'nin yanındaki Parametre Değerleri sütununda, LC50'yi belirlenen değerlerden hesaplamak için denklemi başlatın. Veri sekmesinden Çözücü'yü açın.
Hesaplanan artıkların toplamını içeren hücre olmak üzere ayarlanan hedefi seçin. L, k ve c parametre değerleri için değişken hücrelerini değiştirin.
Negatif k değerleri için, k'yi pozitife değiştirmek için negatif olanı k'den faktoring yaparak denklemleri değiştirin. GRG Doğrusal Olmayan Çözme yöntemini kullanın ve Çözümle'yi tıklatın. Eğriyi ve LC50'nin otomatik olarak hesaplandığını kontrol edin.
Hem yüzde spesifik lizis hem de toksin konsantrasyonuna karşı modellemeyi grafiksel olarak çizerek uyumu doğrulayın. Sfengolipid eksikliği olan SPT2 nakavt promastigotları, hem serumsuz M199 hem de Tyrode tamponunda SLO'ya duyarlıydı. Wild tip ve SPT2 eklenti geri promastigotlar, serumsuz M199'da SLO'ya dirençliydi, ancak Tyrode tamponunda% 20'den az spesifik lizise sahipti.
SPT2 nakavt promastigotları, Tyrode'un tamponundaki SLO'ya M199'dan yaklaşık sekiz kat daha duyarlıydı. Bu veriler, toksin duyarlılığının kullanılan tampona bağlı olarak değişebileceğini göstermektedir. L.major promastigotlarda fosfo-MEK için 120-kilodalton bandı gözlendi.
Toplam MEK için, sırasıyla MRK1 ve LmxMKK boyutlarıyla tutarlı olan yaklaşık 120 kilodalton ve 55 kilodalton bantları gözlenmiştir. Fosfo-ERK benzer bantlar tespit ederken, ERK antikor boyaması bu tahlilde sağlam değildi. Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, toksinin uygun şekilde kullanılmasını sağlamaktır.
Leishmania, plazma membran onarımını incelemek için genetik olarak izlenebilir bir model olarak kullanılabilir ve kum sineği midgutunda Leishmania bakteri etkileşimi sırasında membran onarım mekaniği hakkında yeni bilgiler sağlar.
