細孔形成毒素に対する耐性のメカニズムはよく理解されていません。私たちのプロトコルは、遺伝的に扱いやすく生理学的に関連するシステムであるリーシュマニアメジャーを使用して毒素を形成する機能とメカニズムを可能にします。細胞毒性アッセイの主な利点は、毒素にリアルタイムで挑戦した場合、ミディアムスループットアッセイで複数の表現型の細胞生存率を単一細胞レベルで比較できることです。
アムホテリシンBのような膜摂動剤は、リーシュマニアの最前線の治療法です。このアッセイにより、アムホテリシンBおよび/または新しい膜損傷剤を増強する薬剤の同定が可能になります。このアッセイは、修復応答や修復応答に関連するシグナル伝達経路などの領域への洞察を提供します。
このアッセイは、トリパノソーマやナエグレリア・ファウレリなどの原生動物に適用できます。人々は毒素の連続希釈シリーズを理解するのが難しいと感じています。したがって、私ができる最善のアドバイスは、実験を設定する前に、連続希釈シリーズの概略図を描くことです。
はじめに、0.5ミリリットルの処理済み前鞭毛を別のチューブに染色されていない対照として予約します。残りの前鞭毛虫に1ミリリットルあたり10マイクログラムの最終濃度に1ミリリットルあたり2ミリグラムのヨウ化プロピジウム、またはPIを追加します。3秒間渦を巻きます。
処理済みのプロマスティゴットをV底、96ウェルプレートまたはマーシュチューブの各ウェルに追加し、プレートまたはチューブラックを氷の上に約45度の角度で置きます。ヨウ化プロピジウムを含む100マイクロリットルのアッセイバッファーを各無毒素コントロールに追加します。色が濃く見える総容量200マイクロリットルのチューブを視覚的に識別することにより、コントロールが正しく追加されたことを確認します。
毒素の量を最高希釈液に加えます。次に、毒素を順次希釈します。混合を確実にするために、少なくとも8回上下にピペットします。
最低の毒素濃度から始めて、100マイクロリットルの毒素を正しい行にすばやく追加し、すべての毒素が細胞に追加されるまで続けます。プレートをシーリングテープでシールします。摂氏37度で30分間インキュベートした後、プレートを包装してフローサイトメーターに輸送します。
データ取得の場合は、製造元の指示と施設のポリシーに従って、フローサイトメーターと取得ソフトウェアをセットアップすることから始めます。染色されていないL.majorプロマスティゴートサンプルを使用して、前方散乱と側方散乱のゲートと、選択した色素に基づく初期蛍光パラメータを設定します。単一染色コントロールを使用して、生存率色素および蛍光標識された毒素のゲートを設定します。
マイクロクロッグの前方散乱対時間を監視し、サイトメーター上の各サンプルについて10, 000を超えるゲートイベントを取得します。データ解析のために、必要に応じて前方散乱と側方散乱および時間にゲーティングすることにより、全単一細胞L.major前鞭毛虫をゲートします。フローサイトメーターに推奨される高さまたは面積を使用してください。
死細胞をPIハイとして識別してゲートします。分析のためにExcelで線量反応曲線を整理します。2つのテクニカル反復間の各条件の平均PI高率を求めます。
毒素濃度と平均比溶解率、および/または生のパーセントPI高計算を含めます。さらに 4 つの列に、モデル、残差、パラメーター、およびパラメーター値というラベルを付けます。最初の列が実験パラメータ、毒素濃度、および比溶解率に対応していることを確認します。
パラメーター L、k、および c を初期化するには、[パラメーター値] 列に値を入力します。[モデル済み] 列で、ロジスティック モデルを作成します。残差列で、モデル化された数と実際の比溶解との差の二乗を計算します。
[パラメーター値] 列の [SUM] の横で、[残差] 列のすべての値を合計します。LC50の横にある[パラメータ値]列で、決定された値からLC50を計算する式を初期化します。[データ]タブからソルバーを開きます。
計算された残差の合計を含むセルに設定目標を選択します。[最小] に設定します。L、k、および c のパラメータ値の変数セルを変更します。
負の k 値の場合は、k から負の 1 を因数分解して方程式を変更し、k を正に変更します。GRG 非線形解析方法を使用し、[解析]をクリックします。曲線を確認し、LC50が自動的に計算されていることを確認します。
特異的溶解率と毒素濃度に対するモデリングの両方をグラフィカルにプロットすることにより、適合度を検証します。スフィンゴ脂質欠損SPT2ノックアウト前鞭毛虫は、無血清M199およびタイロード緩衝液の両方でSLOに感受性を示した。野生型およびSPT2付加前鞭毛虫は、無血清M199ではSLOに耐性がありましたが、Tyrodeバッファーでの特異的溶解は20%未満でした。
SPT2ノックアウト前鞭毛虫は、M199よりもタイロード緩衝液中のSLOに対して約8倍敏感であった。これらのデータは、毒素感受性が使用されるバッファーに基づいて変化する可能性があることを示しています。L.major前鞭毛虫のホスホMEKについて120キロダルトンのバンドが観察された。
総MEKについて、約120キロダルトンおよび55キロダルトンのバンドが観察され、これらはそれぞれMRK1およびLmxMKKのサイズと一致した。Phospho-ERKは同様のバンドを検出しましたが、ERK抗体染色はこのアッセイでは堅牢ではありませんでした。この手順を試みるときに覚えておくべき最も重要なことは、毒素の適切な取り扱いを確実にすることです。
リーシュマニアは、原形質膜修復を研究するための遺伝的に扱いやすいモデルとして利用することができ、サンドフライ中腸におけるリーシュマニア細菌相互作用中の膜修復メカニズムに関する新しい洞察を提供します。
