기공 형성 독소에 대한 내성 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 우리의 프로토콜은 유전적으로 다루기 쉽고 생리학적으로 관련된 시스템인 Leishmania major를 사용하여 독소를 기공에 형성하는 기능과 메커니즘을 가능하게 합니다. 세포독성 분석의 주요 장점은 실시간으로 독소에 도전할 때 중간 처리량 분석에서 단일 세포 수준에서 여러 표현형의 세포 생존율을 비교하는 것입니다.
암포테리신 B와 같은 막 교란 작용제는 리슈만편모충의 최전선 치료법입니다. 이 분석은 암포테리신 B 및/또는 새로운 막 손상 제제를 강화시키는 작용제의 식별을 가능하게 합니다. 이 분석은 수리 반응과 관련된 수리 반응 및 신호 경로와 같은 영역에 대한 통찰력을 제공합니다.
이 분석은 Trypanosoma 및 Naegleria fowleri와 같은 원생 동물에 적용될 수 있습니다. 사람들은 독소 연속 희석 시리즈를 이해하기 어렵다고 생각합니다. 그래서 제가 드릴 수있는 최선의 조언은 실험을 설정하기 전에 직렬 희석 시리즈의 개략도를 그리는 것입니다.
시작하려면 0.5 밀리리터의 가공 된 프로 마스티고트를 별도의 튜브에 염색되지 않은 대조군으로 예약하십시오. 밀리리터당 2밀리그램의 프로피듐 요오드화물 또는 PI를 나머지 프로마스티고테에 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도로 추가합니다. 3 초 동안 소용돌이.
V- 바닥, 96 웰 플레이트 또는 습지 튜브의 각 웰에 가공 된 프로 마스티 고트를 추가하고 플레이트 또는 튜브 랙을 얼음 위에 약 45도 각도로 놓습니다. 프로피듐 요오드화물이 포함된 100마이크로리터의 분석 완충액을 각 무독소 대조군에 추가합니다. 색상이 더 어둡게 표시되는 총 부피가 200마이크로리터인 튜브를 시각적으로 식별하여 컨트롤이 올바르게 추가되었는지 확인합니다.
독소의 양을 가장 높은 희석액에 첨가하십시오. 그런 다음 독소를 연속적으로 희석하십시오. 혼합을 보장하기 위해 적어도 8 번 위아래로 피펫.
가장 낮은 독소 농도에서 시작하여 100 마이크로 리터의 독소를 올바른 행에 빠르게 추가하고 모든 독소가 세포에 추가 될 때까지 계속하십시오. 밀봉 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 후, 플레이트를 포장하고 유세포분석기로 운반한다.
데이터 수집의 경우, 제조업체의 지침과 시설 정책에 따라 유세포분석기 및 수집 소프트웨어를 설정하는 것부터 시작하십시오. 염색되지 않은 L.major 프로마스티고트 샘플을 사용하여 전방 및 측면 산란에 대한 게이트와 선택한 염료를 기반으로 초기 형광 매개변수를 설정합니다. 단일 염색 대조군을 사용하여 생존 염료 및 형광 표지 독소에 대한 게이트를 설정합니다.
마이크로클로그에 대한 순방향 산란 대 시간을 모니터링하고 세포분석기의 각 샘플에 대해 10, 000개 이상의 게이트 이벤트를 수집합니다. 데이터 분석을 위해, 전방 및 측면 산란에 게이팅하여 총 단일 세포 L.major 프로마스티고테를 게이트하고 필요에 따라 시간을 보냅니다. 유세포분석기에 권장되는 높이 또는 면적을 사용하십시오.
죽은 세포를 PI 높음으로 식별하고 게이트합니다. 분석을 위해 Excel에서 용량-반응 곡선을 구성합니다. 두 기술 반복실험 사이의 각 조건에 대한 평균 PI 높음 백분율을 결정합니다.
독소 농도 및 평균 백분율 특이적 용해와 실험 세부 정보 및/또는 원시 백분율 PI 높은 계산을 포함합니다. 4개 이상의 열에 모델링됨, 잔차, 매개변수 및 매개변수 값으로 레이블을 지정합니다. 첫 번째 열이 실험 매개 변수, 독소 농도 및 백분율 특이적 용해와 일치하는지 확인합니다.
매개 변수 값 열에 값을 입력하여 매개 변수 L, k 및 c를 초기화합니다. 모델링됨 열에서 로지스틱 모델을 생성합니다. 잔차 열에서 모델링된 수와 실제 특정 용해 사이의 차이의 제곱을 계산합니다.
파라미터 값 열의 SUM 옆에서 잔차 열의 모든 값을 합산합니다. 매개 변수 값 열에서 LC50 옆에 방정식을 초기화하여 결정된 값에서 LC50을 계산합니다. 데이터 탭에서 해 찾기를 엽니다.
계산된 잔차의 합을 포함하는 셀이 되도록 설정된 목표를 선택합니다. 최소로 설정합니다. L, k 및 c의 매개 변수 값에 대한 변수 셀을 변경합니다.
음수 k 값의 경우 k에서 음수를 빼내어 k를 양수로 변경하여 방정식을 수정합니다. GRG 비선형 해결 방법을 사용하고 해결을 클릭합니다. 곡선을 확인하고 LC50이 자동으로 계산되는지 확인합니다.
백분율 특이적 용해와 독소 농도에 대한 모델링을 그래픽으로 플로팅하여 적합성을 확인합니다. 스핑고지질이 결핍된 SPT2 녹아웃 프로마스티고테는 무혈청 M199와 Tyrode의 완충액 모두에서 SLO에 민감했습니다. 야생형 및 SPT2 추가 프로마스티고테는 무혈청 M199에서 SLO에 내성이 있었지만 Tyrode의 완충액에서는 20% 미만의 특이적 용해를 보였습니다.
SPT2 녹아웃 프로마스티고테는 M199보다 Tyrode의 완충액에서 SLO에 약 8배 더 민감했습니다. 이러한 데이터는 독소 민감도가 사용된 완충액에 따라 달라질 수 있음을 보여줍니다. L.major 프로마스티고테스에서 포스포-MEK에 대해 120킬로달톤 밴드가 관찰되었습니다.
전체 MEK의 경우 약 120킬로달톤 및 55킬로달톤의 대역이 관찰되었으며 이는 각각 MRK1 및 LmxMKK의 크기와 일치합니다. Phospho-ERK는 유사한 밴드를 검출한 반면, ERK 항체 염색은 이 분석에서 견고하지 않았습니다. 이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 독소의 적절한 취급을 보장하는 것입니다.
리슈만편모충은 원형질막 복구를 연구하기 위한 유전적으로 다루기 쉬운 모델로 활용될 수 있으며, 모래파리 중추에서 리슈만편모충 박테리아가 상호 작용하는 동안 막 복구 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
