El mecanismo de resistencia a las toxinas formadoras de poros es poco conocido. Nuestro protocolo permite la función y el mecanismo para formar toxinas de poros utilizando Leishmania major, un sistema genéticamente tratable y fisiológicamente relevante. La principal ventaja del ensayo de citotoxicidad es comparar la viabilidad celular de múltiples fenotipos a nivel de una sola célula en un ensayo de rendimiento medio cuando se desafía con toxinas en tiempo real.
Los agentes perturbadores de la membrana como la anfotericina B son terapias de primera línea para la Leishmania. Este ensayo permite la identificación de agentes que potencian la anfotericina B y/o nuevos agentes dañinos para la membrana. Este ensayo proporciona información sobre áreas como la respuesta de reparación y las vías de señalización relacionadas con las respuestas de reparación.
Este ensayo se puede aplicar a protozoos como Trypanosoma y Naegleria fowleri. A la gente le resulta difícil entender la serie de dilución en serie de toxinas. Así que el mejor consejo que puedo dar es dibujar un esquema de la serie de dilución en serie antes de configurar el experimento.
Para comenzar, reserve 0,5 mililitros de promastigotes procesados en un tubo separado como control sin teñir. Agregue dos miligramos por mililitro de yoduro de propidio, o PI, a una concentración final de 10 microgramos por mililitro a los promastigotes restantes. Vórtice durante tres segundos.
Agregue promastigotes procesados a cada pocillo de una placa de 96 pocillos o tubos de pantano con fondo en V, y coloque la placa o el estante de tubos sobre el hielo en un ángulo de aproximadamente 45 grados desde la visión. Agregue 100 microlitros de tampón de ensayo con yoduro de propidio a cada control sin toxinas. Verifique que el control se agregó correctamente identificando visualmente los tubos con un volumen total de 200 microlitros que aparecen de color más oscuro.
Agregue el volumen de toxina a la dilución más alta. Luego, diluya en serie la toxina. Pipetear hacia arriba y hacia abajo al menos ocho veces para asegurar la mezcla.
Comenzando desde la concentración más baja de toxina, agregue rápidamente 100 microlitros de toxina a la fila correcta y continúe hasta que toda la toxina se haya agregado a las células. Selle la placa con cinta de sellado. Después de incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos, empaque y transporte la placa al citómetro de flujo.
Para la adquisición de datos, comience con la configuración del citómetro de flujo y el software de adquisición de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la política de la instalación. Usando la muestra de promastigote, sin teñir, ajuste las compuertas para la dispersión hacia adelante y hacia los lados y los parámetros fluorescentes iniciales en función de los tintes elegidos. Usando controles de una sola mancha, configure las puertas para el tinte de viabilidad y cualquier toxina marcada con fluorescencia.
Monitoree la dispersión hacia adelante frente al tiempo para microobstrucciones y adquiera más de 10, 000 eventos cerrados para cada muestra en el citómetro. Para el análisis de los datos, compuerta total de promastigotes L.major unicelulares mediante la dispersión hacia adelante y hacia el lado y el tiempo según sea necesario. Use la altura o el área según lo recomendado para el citómetro de flujo.
Identifique y componga las celdas muertas como PI alto. Organice la curva dosis-respuesta en Excel para su análisis. Determine el porcentaje promedio de PI alto para cada condición entre las dos réplicas técnicas.
Incluya la concentración de toxinas y el porcentaje promedio de lisis específica, junto con detalles experimentales y / o cálculos de porcentaje bruto de PI alto. Etiquete cuatro columnas más como Modelado, Residuos, Parámetros y Valores de parámetro. Verifique que las primeras columnas correspondan a los parámetros experimentales, la concentración de toxinas y el porcentaje de lisis específica.
Inicialice los parámetros L, k y c introduciendo los valores en la columna Valores de parámetro. En la columna Modelado, cree el modelo logístico. En la columna Residuos, calcule el cuadrado de la diferencia entre el número modelado y la lisis específica real.
En la columna Valores de parámetro, junto a SUMA, suma todos los valores de la columna Residuos. En la columna Valores de parámetro, junto a LC50, inicialice la ecuación para calcular la CL50 a partir de los valores determinados. Abra el Solver desde la pestaña Datos.
Seleccione el objetivo establecido para que sea la celda que contiene la suma de los residuos calculados. Establézcalo en Min. Cambie las celdas variables para los valores de parámetro de L, k y c.
Para valores k negativos, modifique las ecuaciones factorizando uno negativo de k para cambiar k a positivo. Utilice el método de resolución no lineal GRG y haga clic en Resolver. Compruebe la curva y que el LC50 se calcule automáticamente.
Verifique el ajuste trazando gráficamente tanto la lisis específica del porcentaje como el modelado contra la concentración de toxinas. Los promastigotes knockout SPT2 deficientes en esfingolípidos fueron sensibles al SLO tanto en M199 sin suero como en el tampón de Tyrode. Los promastigotes de tipo salvaje y SPT2 adicionales fueron resistentes al SLO en M199 sin suero, pero tuvieron menos del 20% de lisis específica en el tampón de Tyrode.
Los promastigotes knockout SPT2 fueron aproximadamente ocho veces más sensibles al SLO en el tampón de Tyrode que en M199. Estos datos demuestran que la sensibilidad a las toxinas puede variar según el tampón utilizado. Se observó una banda de 120 kilodalton para fosfo-MEK en los promastigotes de L. major.
Para el MEK total, se observaron bandas de aproximadamente 120 kilodaltons y 55 kilodaltons, que son consistentes con los tamaños de MRK1 y LmxMKK, respectivamente. Phospho-ERK detectó bandas similares, mientras que la tinción de anticuerpos ERK no fue robusta en este ensayo. Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es garantizar el manejo adecuado de la toxina.
Leishmania se puede utilizar como un modelo genéticamente tratable para estudiar la reparación de la membrana plasmática, proporcionando nuevos conocimientos sobre la mecánica de reparación de la membrana durante la interacción de la bacteria Leishmania en el intestino medio del flebótomo.
