YS-T için Almanca-İsrail Bilimsel Araştırma ve Geliştirme Vakfı, Avrupa Araştırma Konseyi (ERC), İsrail Bilim Vakfı (ISF) (250/06), ISF Bikura, İsrail Kanser Araştırma Fonu (ICRF), (GIF tarafından desteklenmektedir ), ABD-İsrail Binational Bilim Vakfı (BSF), Alman-İsrail Projesi İşbirliği (DIP), İsrail Bilim ve Sağlık Bakanlıkları, Bar-Ilan Üniversitesi Yaşam Bilimleri Jane Stern Lebell Aile Üyesi. YB, bir Azrieli dostluk ödül için Azrieli Vakfı minnettardır.

Kullanılan hücre sistemine etiketleme canlı hücrelerde mRNA MS2 tekrar dizileri içeren entegre bir gen inşa içermelidir. Genin 5 &#39;lac operatör içerir (Bu protokolde floresan aşağıdaki gibidir (Şekil 1A), DNA, RNA ve protein düzeyleri 8 harfli bir stably entegre β-aktin gen barındıran U2OS bir insan hücre hattı Laço) tekrarlar bu gen (DNA) etiketlemek için kullanılır ve böylece entegrasyon genomik lokus tespit. Floresan etiketli lak repressör protein (Laci) Laço tekrarlar bağlamak ve DNA etiketi. MRNA&#39;ların MS2 tekrarlar (kök döngüler) bağlamak YFP-MS2 proteinleri ile etiketlenir. Gen ürünü CFP-aktin ve bu nedenle gen indüksiyonu CFP-etiketli aktin hücre iskeletinin görünümünü neden olacaktır. Gen yapısı bir U2OS Tet-istikrarlı bir hücre hattı transfekte ve ifade Tet transkripsiyonel kontrolü altındadır. 1. Hücre kaplama ve transfeksiyon: <ol><li> 48 saat önce ölçümler, tohum ~ 2 * 10 cam dipli doku kültürü yemekleri 5 hücreleri (35 mm, 14 mm cam dipli bir kuyu (0,16-0,19 mm kalınlık ile petri kaplarına; Kedi No P35G-1.5-14- C Mattek, Ashland, MA)). % 50-80 izdiham ulaşmak için, hücrelerin orta 2ml ekleyin. </li><li> 24 saat denemenin önce geçici olarak etiketleme DNA ve mRNA floresan işaretleri ifade yapıları hücreler transfect. FuGENE6 transfeksiyon reaktifi (Roche) kullanın. Kullanılan yapıları: <ol type="a"><li> YFP-MS2-NLS mRNA transkript, MS2 kök döngüler etiketi. Nükleer lokalizasyon dizisi (NLS) nükleer giriş sırası YFP MS2 protein sağlar. </li><li> Opsiyonel - genin 5 &#39;Laço tekrarlar bağlamak ve gen lokusu etiket CFP-Laci veya RFP-Laci. Etiketleme gen lokusu sıkı bağlamak deney sırasında gen izleme yardımcı olur, ancak gerekli değildir. </li></ol></li><li> Geçici transfekte proteinleri (nota bakınız) iyi bir ifade elde etmek için, hücrelerin en az 12 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Tet-indüklenebilir CFP-aktin gen aktive etmek için deney hücrelere 1.5 mikrogram / ml doksisiklin (Sigma) eklemek 12 saat önce - 6. </li></ol> Notlar: * Şekilde transkripsiyon sitesi, arka plan sinyale göre özel olarak elde edilen sinyal maskelemek için transfekte proteinleri, çok yüksek ifade seviyelere ulaşmak için çok önemlidir. C) bir nükleer ihracat sinyali (NES) ekleyerek; b) promotor gücü (örneğin CMV L30 organizatörü daha güçlüdür) değiştirerek a) transfeksiyon ve deney arasında zaman ayarı: ifade düzeyleri ile kontrol edilebilir tüm hücre YFP sinyali dağıtmak yardımcı olacaktır YFP-MS2-NLS protein. * Tercihen uzun satın almalar boyunca ölçümler için kullanılan fluorofor photostable olmalıdır, bu nedenle yeşil / sarı yayan fluorophores kırmızı fluorophores daha iyi. Ref 10 farklı fluorophores hakkında bilgi bulunabilir. * Farklı ışık kanalları aracılığıyla kanama yok birbirlerine belirleyin. Kullanım slaytlar, her biri ile ayrı ayrı belirteçlerin etiketli örnekler içeren her slayt, her iki kanal yoğunluğunu ölçmek ve daha sonra kanama ile hesaplanır. 2. Sıkı bağlamak: Deney görüntüleri almak ve bir lazer ışını ile photobleaching performans yeteneğine sahip herhangi bir mikroskop yapılabilir. Tipik olarak, bir konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile sıkı bağlamak deneyler yapılmaktadır. Ancak, bizim durumumuzda bu yana deney nispeten uzun (15-30 dakika), ve biz küçük bir çekirdek içinde lokus takip ediyor, bütün deney boyunca odak gen lokusu / transkripsiyon sitesi tutmak mümkün olmak önemlidir. Bu 3 boyutlu (4D) üzerinde hızlı görüntüleme gerektirir ve böyle bir satın alma oranları bir tarama konfokal mikroskop kullanılarak elde etmek zordur. Bu nedenle, yüksek hızda görüntü elde edebilirsiniz, bir EM-CCD (Quant-EM, Roper) ile donatılmış geniş bir alan Olympus IX81 mikroskobu (63X Planı-Apo 1.4 NA) üzerine inşa edilmiş bir 3D-sıkı bağlamak sistemi (Photometrics) (en fazla 30 görüntü / saniye). Sistemi örnek ilgi, belirli bir bölge (ROI) photobleaching etkinleştirmek için kamera ile senkronize edilebilen 405 nm ve 491 nm lazerler vardır. Mikroskop Lambda DG-4 ışık kaynağı (Sutter) ve Z-ekseninde hızlı ve doğru görüntüleme sağlayan bir XY ve Z sahne (Önceki) ile donatılmıştır. Tüm donanım, entegre ve MetaMorph (Moleküler Cihazlar) tarafından kontrol edilir. Canlı hücre deneyleri bir canlı hücre kamara sistemi (Tokai) kullanılarak 37 ° C,% 5 CO 2 yapılmaktadır. <ol><li> Prosedür: deney Yarım saat önce, ısıtma cihazı, mikroskop ve lazer açmak. Deney sırasındaMent sıcaklığının sabit kalması gerekiyor, aksi takdirde uzun satın alma kez sırasında odak değişiklikleri neden olabilir. Lazer gücü tutarlı güç çıkışı için kararlı olmalıdır. </li><li> Lazer kamera ile senkronize edin: <ol><li> Hücreleri (DIC kullanarak) içermez plaka bir alan ara. </li><li> Deneyleri için kullanılan aynı ışık kanal kullanın. Burada YFP kanal için 491 nm lazer kullanın. </li><li> Lazer resmin ortasına gelin. </li><li> Senkronize düğmesi (makro sağlanan) kullanın. </li><li> Lazer ve kamera senkronize olmasını sağlamak için bu alanda farklı noktalar deneyin. </li></ol></li><li> Deneme için iyi bir aday hücre seçin. Istikrarlı hücre hatları ile çalışmasına rağmen, tüm hücreleri benzer ekspresyon düzeyleri olduğunu bulabilirsiniz. Sonra tamamen kurtarmak için muktedir ve b) yeterli boş YFP-MS2 hücre içinde protein var; a) açık YFP MS2 etiketli diffüz YFP-MS2 arka plan üzerinde transkripsiyon sitesi sergilerler: iyi bir aday hücrelerin olurdu (sol hücre beyazlatma için iyi bir aday değil iki hücre karşılaştırmak Örneğin Şekil 1B) photobleaching. </li><li> Uygun ölçüm koşulları seçin. Sıkı bağlamak yordam birçok görüntü elde gerektirir ve bu nedenle uygun pozlama süreleri ve mümkün olduğunca düşük ışık kullanımı arasındaki denge önemlidir. Yüksek ışık seviyeleri fototoksisite nedeniyle hücre etkileyebilir ve photobleaching neden olacaktır. Bu farklı deneyler arasında görüntüleme parametreleri sabit tutmak için tavsiye edilir. Hücreler YFP 150 msn pozlama süreleri ile kanal görüntülü ve CFP-Laci (genomik lokus) tespiti için CFP kanal. CFP-Laci etiketli lokus YFP-MS2 mRNA sinyali (isteğe bağlı) photobleached bile genin algılanmasını sağlar. Her bir satın alma için, 7 Z-dilimleri her 350 nm alınır. 491 nm lazer kullanarak aktif transkripsiyon sitesi ağartılmıştır. </li><li> Tam bir deney yapın ama kasar. Sıkı bağlamak deney kararlı duruma dönmek için transkripsiyon sitesi için gereken zamanı ölçer. İlk olarak, aktif transkripsiyon sitesi kararlı durum fonksiyonel ve istikrarlı olduğunu doğrulamak için istiyorum. Bu nedenle, transkripsiyon sitesi ölçülen yoğunluğu deneme zaman diliminde değişmez sağlamak için ağartma kalmadan, tam bir sıkı bağlamak deneyi gerçekleştirmek ama. Ayrıca tam görüntüleme dizi kaynaklanan toplam photobleaching ölçerek görüntüleme koşullarını test etmek için bu deneyde kullanın. Genel bir kural olarak, tam bir film photobleach ilk yoğunluğunun% 30&#39;dan fazla olmamalıdır. Bu ilk görüntü (oranı 0.7 &#39;den büyük olmalıdır) bölünmesiyle son görüntü çekirdeğinde aynı noktada, yoğunluğu oranı kullanılarak ölçülebilir. </li><li> Sıkı bağlamak: 491 nm lazer kullanarak aktif transkripsiyon yerinde YFP-MS2 sinyal ağartılmıştır. 6 ön-bleach görüntüler elde edilir. Post-çamaşır suyu görüntüler 3 kez frekansları bir dizi elde edilir: 15 Resim her 3 saniyede, 15 fotoğraf her 6 saniye ve 26 (veya 45) görüntüleri uzun deneyler için her 30 sn. Bir görüntü elde etme frekans değişiklikleri sinyal değişiklikleri daha az belirgindir sonuna doğru en yüksek yoğunluğunu değiştirmek (ilk kurtarma), ve daha az görüntü zamanlarda daha fazla görüntü kazanmasını sağlamaktadır. </li></ol> Notlar: Bu deney o &quot;normal&quot; sıkı bağlamak farklıdır: Tipik sıkı bağlamak deneyler hücrenin farklı proteinler hareketliliği ölçmek ise mRNA transkripsiyon sitesi * sıkı bağlamak, doğmakta olan mRNA YFP-MS2 proteinlerin bağlama ölçer. Bu nedenle, YFP-MS2 proteinlerin uzadıya havuzu ölçüm hiçbir çıkarı yoktur. Ağartma ve ilk elde edilen görüntü arasındaki zaman oldukça uzun zaman ücretsiz YFP-MS2 proteinlerin bu difüzyon havuzu göz ardı etmek mümkündür. YFP MS2 sinyal kurtarma nispeten uzundur (15-30 dk) *, odak transkripsiyon sitede tutmak için önemlidir. Z-dilimleri bir dizi her zaman noktasında kazanılmış olmasının nedeni budur. 3. Sıkı bağlamak veriler Normalizasyon: 4D sıkı bağlamak veri, ücretsiz analiz yazılımı ImageJ (NIH, Bethesda, MD kullanılarak <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">analiz</a> http://rsb.info.nih.gov/ij/) . Aşağıda ImageJ yazılım aracılığıyla makroları ile yapılan analiz, ama tabii kendi kendine yazılmış makrolar oluşturulabilir. <ol><li> Z-yığınlarının en ileri analiz için zaman içinde bir 2D film, her zaman bir noktada tahmin edilmektedir. </li><li> Transkripsiyon sitesi, her çerçeve içinde takip edilir ve ortalama yoğunluk Spot Tracker aracını kullanarak ölçülür. Ileri analiz için bir Excel sayfasında 11 veri kaydedilir. </li><li> Her zaman noktası için, ilgi (ROI) ve diğer bölgelerde ortalama yoğunlukları (plug-in ImageJ, Zaman Serileri Analyzer kullanarak) aşağıdaki gibi ölçülür: a) gerizemin hücre = B (t) dışında bir yatırım getirisi alınır. b) çekirdek plazması bir yatırım getirisi, ama mümkün olduğunca çamaşır suyu sitesinden = C (t). c) transkripsiyon site = S (t) (spot izci ile ölçülen). </li><li> Görüntüleme sırasında neden photobleaching veri Doğru: arka plan çıkarma ve diğer tüm ölçümlerden sonra çamaşır suyu doğru. Sc (t), t zamanında transkripsiyon sitesi düzeltilmiş yoğunluk </li></ol> eq. 1: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq1.jpg" alt="Denklem 1" /><ol start="5"><li> Veri Normale: ilk kararlı durum (= &lt;Sc (pre-bleach)&gt;) transkripsiyon sitenin yoğunluğunu gösterir öncesi ağartıcı görüntüleri ortalamasını. </li></ol> Sonra veri normalleştirmek: eq. 2 <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> Veriler en az 10 deneyler için normalize edilirler. Deneyler her zaman nokta (Şekil 1C) hata çubuklar için ortalama ve standart sapma (STD) hesaplayın. Notlar: Sıkı bağlamak analizi sırasında YFP MS2 protein difüzyon bağlı YFP-MS2 mRNA yüksek afinite ile ilişkili iken, çok hızlı bir şekilde ücretsiz nucleoplasmic YFP-MS2 yayılma oranı beri göz ardı edildi ve transkripsiyon iliştirmeniz değildir site. Bu analizden önce beyazlatma sonra ilk görüntü neden kaldırılması gerektiği. 4. Bir matematiksel model kullanarak verileri analiz: Bu tür veri kümesi kinetik parametreleri almak için, biz bu tür veri sığabilecek en basit tarif modeli kullanıldı. Bu özel model tam bir açıklama burada 5 okunabilir. Model, şekil 2A düzeni açıklayan aşağıdaki denklemler içerir: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq3.jpg" alt="Denklem 3" /> <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq4.jpg" alt="Denklem 4" /> Model parametreleri olması, uzama hızı hesaplamak mümkündür: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq5.jpg" alt="Denklem 5" /> Biz Berkeley Madonna (kullanarak eğri analiz <a href="http://www.berkeleymadonna.com">http://www.berkeleymadonna.com</a> ), daha önce 5 modellenmiş ama diğer seçenekleri (MatLab, Sanal Hücre, COPASI vb.) mevcuttur . Veri modeline uygun ve hız sabitleri çıkarıldı. Berkeley Madonna kod ekleyebilirsiniz. En iyi biz kararlı durum hesaplanır ve sonra normalize modeli normalize deneysel verilere uygun verilerin sığması için. 5. Temsilcisi Sonuçlar: Biz yüksek lazer gücü kullanarak aktif transkripsiyon yerinde etiketli mRNA sinyal photobleached ve zamanla YFP-MS2 sinyal iyileşme izledi. Transkripsiyon yerinde floresan sinyal mRNA sentezi gibi sitesinden yayınlandı mRNA kararlı durum kinetiği oluşur. Ağartma olmadan zamanla transkripsiyon sitesi yoğunluğu ölçümü, bu genin bir göreli istikrarlı bir devlet olduğunu ima &#39;sabit&#39; sinyali (Şekil 1C, kırmızı noktalar) verir. Bu, yeni transkripsiyonu mRNA üzerinde biriken sinyal bir mRNA transkripsiyon sitesinden bırakıldığında yaprakları sinyal eşit olduğu anlamına gelir. Photobleached zaman, bu sistem kararlı durum devam eder, ancak kurtarmak için sinyal için gereken süreyi ölçmek için artık mümkün. Bu nedenle, floresan kurtarma çoğunlukla polimeraz uzama özelliklerine bağlıdır. 3D sıkı bağlamak sistemi sıkı bağlamak kurtarma sırasında tam 3 boyutlu nükleer hacmi satın izin ve böylece hiçbir sinyal deneyler sırasında kaybetti. Verilerden kinetik parametreleri hesaplamak için, normalize eğrisi diferansiyel denklemler dayalı kinetik model açıklayan uzama takıldı, basit bir ODE model kullanılarak 5 avantajı parametreleri sadece küçük bir sayı uygun olabilir . . Modelin ilk adım (giriş noktası) yani uzama, yeni MS2 bağlayıcı siteleri sentezleme sorumlu süreç. Son adım (çıkış noktası), çekirdek plazması içine mRNA serbest. Modeli kurtarma iki kinetik çözülmesi bileşenleri oluşan eğriler, bir hızlı ve yavaş bir dayanmaktadır. Yavaş bileşeni uzama sırasında duraklatma polimeraz olarak modellenmiş iken, hızlı bileşeni, uzama gösterir. Iki polimeraz devletler duraklatma bir stokastik geçiş uzama olarak modellenmiştir. 3.3 kb / dakikalık bir uzama hızı daha yavaş bir sentez oranı (kümülatif süre 2.5 dakika duraklamadan) için bir stokastik geçişle birlikte vermiştir bu model diferansiyel denklemler, optimize edilmiş. Modelleme tha gösterdit uzama gelen duraklatma uzama girdi polimerazları sadece% 11 etkilenir bu geçiş. <table border="1"><tbody><tr><td> K dışarı </td><td> 0,0112 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_in </td><td> 0,0015 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_out </td><td> 0,0067 </td><td></td></tr><tr><td> Uzama süresi </td><td> (K çıkışı + k pause_out) -1 </td><td> 56 sn. </td></tr><tr><td> Duraklama süresi </td><td> (K pause_out) -1 </td><td> 2.5 dakika </td></tr><tr><td> Pause olasılık </td><td> (K pause_in) / (K pause_in + k çıkışı) </td><td> % 11 </td></tr></tbody></table> Tablo 1 model bir parametre tablodaki sonuçlar. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. (A) deneysel hücre sistemi in vivo gen ekspresyonu için kullanılır. CFP-aktin gen şematik yapısı. 5&#39;-ucu RFP-Laci (kırmızı) ile bağlanır ve gen entegrasyon site işareti 256 Laço tekrarlar bir dizi içerir. Minimal CMV organizatörü transkripsiyonel indüksiyon dox varlığı Tet duyarlı elemanları (Tres), ters tetrasiklin transkripsiyonel aktivatörü (rtTA veya Tet-On) bağlanması ile elde edilir. Transkripsiyonu mRNA kodlama dizisi, CFP-β-aktin ve YFP MS2 füzyon proteini bağlı 24 MS2 tekrarlar içerir. 3&#39;-sonunda, bir tavşan β-globin ekzon-intron-ekson modülü bir kısmını bir bölünme Polya sinyal tarafından takip edilmektedir. Program, aynı zamanda, RNA Pol II transkripsiyonu yeni transkripsiyonu mRNA&#39;ların bağlı floresan MS2 proteinleri (sarı) gösteren uzama testi açıklar (B) aktif bir transkripsiyon sitesi (YFP-MS2, sağ hücre) photobleached ve floresan kurtarma paletli zaman içinde (altta çerçeveler). Biz çamaşır suyu (orta çizgi) ve non-beyazlatılmış (alt çizgi) aktif transkripsiyon siteleri floresan yoğunluğu ölçülür. Not sol hücre, bir photobleaching deney için uygun değildir (C) deneysel ölçümler CFP-aktin gen transkripsiyon sitelerinde . YFP MS2 sıkı bağlamak ölçümleri mavi kurtarma eğrileri. Kırmızı, kararlı durum transkripsiyon yerinde YFP-MS2 sinyali gösteren aynı deneyi olmayan bir ağartılmış hücre. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Transkripsiyon sitesi YFP-MS2 molekülleri ile işaretlenen mRNA&#39;ların giriş ve çıkış kinetiği açıklayan model (A) Programı ve (B) YFP-MS2 sıkı bağlamak veri ve monte simülasyon (ortalama on deneyler modeli takıldı ) . Uyum hesaplanan artıklar altta sunulmaktadır.

<ol>
	<li>Wada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wave+of+nascent+transcription+on+activated+human+genes.">A wave of nascent transcription on activated human genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).</li><li>Brody, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transcription+in+real-time.">Visualizing transcription in real-time.</a> Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).</li><li>Lamond, A. I., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription+in+living+color.">RNA polymerase II transcription in living color.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).</li><li>Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription.">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).</li><li>Boireau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+cycle+of+HIV-1+in+real-time+and+live+cells.">The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells.</a> J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).</li><li>Janicki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+silencing+to+gene+expression;+real-time+analysis+in+single+cells.">From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells.</a> Cell. 116, 683-698 (2004).</li><li>Ben-Ari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+of+an+mRNA+in+space+and+time.">The life of an mRNA in space and time.</a> J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).</li><li>Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+single+mRNPs+in+nuclei+of+living+cells.">Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells.</a> Science. 304, 1797-1800 (2004).</li><li>Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+at+a+glance.">Fluorescent proteins at a glance.</a> J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).</li><li>Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+tracking+of+individual+fluorescence+particles:+application+to+the+study+of+chromosome+dynamics.">Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics.</a> IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).</li><li>Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-allele+analysis+of+transcription+kinetics+in+living+mammalian+cells.">Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells.</a> Nat Methods. 7, 631-633 (2010).</li><li>Brody, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+kinetics+of+RNA+polymerase+II+elongation+during+co-transcriptional+splicing.">The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing.</a> PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).</li><li>Munoz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+regulates+alternative+splicing+through+inhibition+of+RNA+polymerase+II+elongation.">DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation.</a> Cell. 137, 708-720 (2009).</li><li>Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+of+RNA+polymerase+II+in+living+mammalian+cells.">Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells.</a> Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).</li><li>Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+cycle+of+RNA+polymerase+II+in+living+cells.">The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells.</a> J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Canlı hücreler polimeraz kinetik aktivitesini ölçmek için yöntem iki bölüme ayrılabilir. Ilk bölümü, ikinci bölümünde, veri ODE model kullanılarak analiz ise, ölçüm ve mRNA transkripsiyon kinetik verileri almak &#39;ıslak&#39; prosedürü açıklamaktadır. 5 ayıklamak için bir dizi çalışma yaklaşımıdır canlı hücreler 5, 6, 8, 12-14 transkripsiyon kinetiği. Bu çalışmalar arasında en önemli fark, sıkı bağlamak kurtarma eğrisi kinetik parametreleri dönüştü...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th></tr><tr><td> Doksisiklin </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> FuGENE 6 transfeksiyon reaktif </td><td> Roche </td></tr></tbody></table>

measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells

RNA polimeraz II (Pol II) transkripsiyonel aktivitesini dinamik bir süreçtir ve bu nedenle in vivo transkripsiyonel sürecin kinetiği ölçülmesi önem taşımaktadır . Pol II kinetiği, biyokimyasal ve moleküler yöntemler kullanılarak ölçüldü 1-3, son yıllarda yeni görüntüleme yöntemlerinin gelişmesi ile, gerçek zamanlı olarak tek bir canlı hücreler olarak ortaya çıkar transkripsiyon takip etmek mümkün hale gelmiştir 4 Burada nasıl tarif belirli bir gen lokusu (DNA), mRNA ürün ve nihai bir protein ürünü floresan etiketli ve in vivo görüntülendi hangi bir hücre satırını kullanarak canlı hücrelerin belirli bir gen Pol II uzaması kinetik analizi gerçekleştirmek için 5, 6 mRNA&#39;ların gerçek transkripsiyon, ilgi gen tespit etmek mümkündür. 7, 8 mRNA floresan in vivo, mRNA transkript 3&#39;UTR 24 MS2 kök-loop içeren, etiketleme mRNA&#39;ların MS2 sistemi kullanılarak etiketlenir mRNA transkripsiyonu gibi etiketler YFP MS2 kat protein bağlama bölgeleri için son derece özel sağlar tekrarlar, 9 (sıkı bağlamak) yöntemi Photobleaching sonra Floresan Kurtarma transkripsiyon kinetiği izlemek için. Transkripsiyon yerinde YFP-MS2 etiketli doğmakta olan transkript photobleaching ve sonra zamanla bu sinyal kurtarma, yeni yapılan mRNA&#39;ların sentezi oranı edinin. 5. Diğer bir deyişle, YFP-MS2 floresan kurtarma nesil yansıtır , yeni MS2 doğmakta olan transkript ve floresan YFP-MS2 çevreleyen çekirdek plazması giren moleküller tarafından, bağlayıcı kök döngüler. Daha sonra sıkı bağlamak kurtarma eğrileri, transkripsiyon kinetik parametreleri almak için, diferansiyel denklemlerin bir dizi resmiyet matematiksel mekanik modelleri kullanılarak analiz edilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells at JoVE.com

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

RNA polimeraz II transkripsiyonel kinetiği canlı hücrelerin belirli genlerin ölçülür. ilgi gen transkripsiyonu mRNA&#39;ların floresan etiketli ve (sıkı bağlamak) in vivo kinetiği transkripsiyonel uzama elde edilir Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak.

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

measuring-the-kinetics-of-mrna-transcription-in-single-living-cells

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Görüntüleme.  Bar-Ilan University. RNA polimeraz II transkripsiyonel kinetiği canlı hücrelerin belirli genlerin ölçülür. ilgi gen transkripsiyonu mRNA'ların floresan etiketli ve (sıkı bağlamak) in vivo kinetiği transkripsiyonel uzama elde edilir Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak.