Son derece saf plastoglobüllerin izolasyonu, çalışmaları için kritik öneme sahiptir. İzolasyonları için aşağı akış biyokimyasal araştırmalarını kolaylaştıran hızlı ve etkili bir protokol burada sunulmaktadır. Bu yöntemin birincil yararı, prosedürün göreceli hızı ve çok sayıda bitki türüne ve çevresel koşullara uyarlanabilirliğidir.
Plastoglobülleri tilakoidlerden sıyırmak için yeterli kuvveti sağlamak için tilakoid resüsitasyonlarını sonikleştirirken ve daha sonra sakkaroz gradyanından plastoglobüllerin çıkarılmasıyla özel dikkat gösterilmelidir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Elsinraju Devadasu ve laboratuvarımda doktora öğrencisi olan Febri Susanto olacak. V5 büyüme aşamasına sahip ve yaklaşık 120 gram ağırlığında altı sağlıklı mısırın üç haftalık fidelerini edinerek başlayın.
Sapın tabanındaki tüm yaprakları kesin ve soğuk odaya taşımadan önce hızla bir buz banyosuna batırın. Yeşil bir güvenlik lambası altında çalışırken, mısır yapraklarını buz banyosundan çıkarın ve makas kullanarak daha küçük beşe beş santimetrelik parçalara ayırın. Kırpılmış yaprak dokusunun yarısını, ticari bir karıştırıcıda yediden düşük bir seviyede öğütme tamponunun 350 mililitresinde nazikçe ve iyice öğütün.
Tüm yaprakların kesildiğinden emin olmak için karıştırıcıyı beş ila altı kez başlatın ve durdurun. Homojenatı büyük bir huni üzerinde bir kat 25 mikron naylon bezden dört adet 250 mililitrelik santrifüj şişesine filtreleyin. Karıştırma adımını kalan kırpılmış yaprak dokusuyla tekrarladıktan sonra, filtradı dört şişe arasında eşit olarak bölün.
Yaprak filtrasyonunun bir aliquotunu çıkarın ve temsili bir toplam yaprak örneği olarak saklanmak üzere bir kenara koyun. Daha sonra, filtratın altı dakika boyunca 1.840 G ve dört santigrat derecede santrifüj yapın. Elde edilen süpernatantı dökün ve fırçanın yumuşak döner hareketleriyle, peleti 0.2 molar sakkaroz içeren 12 mililitre orta R 0.2 içinde yeniden askıya alın.
Pelet'i bir şişede yeniden askıya aldıktan sonra, süspansiyonu bir sonraki şişeye ekleyin ve süspansiyonları bir şişede toplamak için yeniden süspansiyonu tekrarlayın. Havuzlanmış süspansiyonu altı adet üç mililitrelik ultrasantrifüj tüp arasında dağıtın ve her tüpte maksimum 2,5 mililitre hacme ulaşın. Ardından, her tüpü her biri 10 saniye boyunca dört kez sonikleştirmek için% 100 genlikte uç sonicator'u kullanın.
Köpüğü önlemek için sonicator boynuzunu suya batırılmış ve sıvı yüzeyden uzak tuttuğunuzdan emin olun. Her tur boyunca sonicator kornasını süspansiyon içinde yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin. Dört tüpü değiştirirken, numunenin soğumasına izin vermek için her sonikasyondan sonra her tüpü bir buz kovasına geri döndürün.
Bir kez bittiğinde, sonikleştirilmiş ham tilakoid süspansiyonunu dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 150.000 G'de santrifüj yapın. Bir şırınga ve 22 gauge iğne kullanarak yastık yüzeyini gözden geçirin ve elde edilen sarı ve yağlı yüzer ham plastoglobül pedini sakkaroz yastığından toplayın. Her tüpten yaklaşık 500 mikrolitre geri kazanın ve bunları 2.0 mililitrelik bir tüpe koyun.
Plastoglobüllerin sonikasyonundan ve salınımından önce ve sonra ham thylakoid aliquots toplayın. Bir kez yapıldıktan sonra, bitki dokusu işlemeye devam edin veya ham plastoglobülleri eksi 80 santigrat derecede saklayın ve daha sonra saflaştırın. Sabit faza ulaşmak için BG11 ortamında 50 mililitre synechocystis türü PCC 6802 kültürünü 7 ila 10 gün boyunca büyütün.
Bir spektrofotometre kullanarak, hücre yoğunluğunu 750 nanometrede 2.0 optik yoğunluğa ayarlayın. Polisakaritleri çıkarmak için, 50 mililitre kültürü santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Hücrelerin 50 mililitre tampon A'da iki kez yıkanmasını tekrarlayın.
Yıkanmış peleti 25 mililitre tampon A'da yeniden askıya alın ve hücreleri 1.100 pound inç karede bir Fransız basınç hücresi kullanarak kırın. Lised rengi yeşilden kırmızıya, maviye, yeşile beyaz ışık altında değişene kadar işlemi soğuk koşullarda üç kez tekrarlayın. Hücre homojenatının aliquot'unu çıkarın ve temsili bir toplam hücre örneği olarak saklanmak üzere bir kenara koyun.
Elde edilen homojenatı her tüpte maksimum 2,5 mililitreye kadar doldurulmuş sekiz adet üç mililitrelik ultrasantrifüj tüpüne dağıtın. Bu homojenatı 400 mikrolitre orta R ile kaplayın ve bir adım gradyanı üretin. Tüpleri santrifüj etmeden önce gerektiğinde ilave ortam R ekleyerek tüpleri dikkatlice dengeleyin.
Herhangi bir polihidroksyalkanoat cismi de dahil olmak üzere tilakoid ve diğer ağır organeller pelet oluşumu gösterirken, plastoglobüller sakkaroz gradyanının üstünde veya yakınında sarı yağlı bir ped oluşturur. Elde edilen yüzer ham plastoglobül pedini, daha önce gösterildiği gibi bir şırınga ile hasat edin ve hasadı iki mililitrelik bir tüpe koyun. Plastoglobülleri ultrasantrifüj tüp duvarının yan tarafından gerekirse bir iğne ucu ile kazıyın.
Ya siyanobakteri işlemeye devam edin ya da ham plastoglobülleri eksi 80 santigrat derecede depolayın ve daha sonra saflaştırın. Bitki dokusu işleme yöntemini kullanarak saf plastoglobülleri hasat etmek için, 500 mikrolitre ham plastoglobül, 400 mikrolitre orta R 0.2 ve 400 mikrolitre orta R. Santrifüjlemeden sonra, elde edilen yüzer saf plastoglobül pedini iki mililitrelik bir tüpe toplayın. Saf plastoglobülleri alıkoyduktan ve alikotları sıvı azotta dondurduktan sonra, ya eksi 80 santigrat derecede saklayın ya da kuru bir toza liyofilize edin.
Siyanobakterilerden saf plastoglobülleri hasat etmek için, daha önce de belirtildiği gibi, 500 mikrolitre ham plastoglobül, 750 mikrolitre orta R 0.7 ve 750 mikrolitre orta R 0.2 kullanarak bir sakkaroz gradyanı oluşturun. Santrifüjlemeden sonra, saf plastoglobülleri 1.5 mililitrelik bir tüpte toplayın ve saf plastoglobülleri aliquot edin. Tamamlandığında, saf plastoglobüller alikotlarını sıvı azotta flaş dondurun ve doğrudan eksi 80 santigrat derecede saklayın veya kuru bir toza liyofilize edin.
Bu yöntemde sakkaroz yastığının üst tabakasında yüzen önemli miktarda plastoglobül veya lipid damlacık materyali görülmüştür. Daha sonraki santrifüjlemeden sonra, saflaştırılmış plastoglobüller sakkaroz gradyanının yüzeyinde veya yakınında elde edildi. Plastoglobüllerin başarılı bir şekilde izole edilmesinden sonra, arabidopsis thaliana fibrilin 1a ve arabidopsis thaliana fotosistem II alt ünitesi D1'e karşı yükseltilen antikorlar kullanılarak saflık değerlendirmesi için geliştirilen immünoblotlar, fibrilin homologlarının öncelikle plastoglobüllerden ziyade tilakoidlerle ilişkili olduğunu göstermiştir.
Yüzer pedin verimli ve konsantre bir şekilde ekstraksiyonunu sağlamak için, şırınga iğne deliğini tamamen suya batırılmışken tamponun sıvı yüzeyinin hemen altına yerleştirin, ardından yavaşça yukarı çekin. İzole plastoglobül örnekleri, sonraki proteomik veya lipidomik çalışmalara uygundur ve farklı çevresel koşullar altında hedeflenen protein-lipid bileşimindeki değişiklikleri göstermek için kullanılmıştır. Bu teknik, ilişkili protein kinaz aktivitesinin keşfi ve daha sonraki biyokimyasal araştırmalarla oligomerik protein komplekslerinin varlığı da dahil olmak üzere plastoglobülün yeni çalışmalarını kolaylaştırmıştır.
