عزل البلاستوغلوبولات عالية النقاء أمر بالغ الأهمية لدراستهم. يتم تقديم بروتوكول سريع وفعال لعزلتهم يسهل تحقيقهم الكيميائي الحيوي في المصب. الفائدة الأساسية لهذه الطريقة هي السرعة النسبية للإجراءات وقدرتها على التكيف مع العديد من الأنواع النباتية والظروف البيئية.
يجب توخي الحذر بشكل خاص أثناء تعليق صوتنة الثايلاكويد لضمان القوة الكافية لتجريد البلاستوغلوبولات من الثايلاكويدات ومع الاستخراج اللاحق للبلاستوغلوبولات من تدرج السكروز. سيوضح هذا الإجراء الدكتور Elsinraju Devadasu ، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري ، و Febri Susanto ، طالب الدكتوراه في مختبري. ابدأ بالحصول على شتلات عمرها ثلاثة أسابيع من ستة ذرة صحية ، لها مرحلة نمو V5 وتزن حوالي 120 جراما.
قم بقص جميع الأوراق عند قاعدة الساق واغمسها بسرعة في حمام جليدي قبل نقلها إلى الغرفة الباردة. من خلال العمل تحت مصباح أمان أخضر ، قم بإزالة أوراق الذرة من الحمام الجليدي وقم بقصها إلى قطع أصغر بحجم خمسة في خمسة سنتيمترات باستخدام المقص. قم بطحن نصف أنسجة الأوراق المقطوعة برفق ودقة في 350 مل من المخزن المؤقت للطحن على مستوى أقل من سبعة على خلاط تجاري.
ابدأ الخلاط وأوقفه خمس إلى ست مرات لضمان قطع جميع الأوراق. قم بتصفية التجانس من خلال طبقة واحدة من قماش نايلون 25 ميكرون على قمع كبير إلى أربع زجاجات طرد مركزي سعة 250 ملليلتر. بعد تكرار خطوة المزج مع أنسجة الأوراق المقطوعة المتبقية ، قسم الراشح بالتساوي بين الزجاجات الأربع.
قم بإزالة حصة من مرشح الورقة وضعها جانبا ليتم تخزينها كعينة إجمالية تمثيلية للورقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمرشح لمدة ست دقائق عند 1،840 G وأربع درجات مئوية. اسكب المادة الطافية الناتجة ، وبحركات دوامية لطيفة للفرشاة ، أعد تعليق الحبيبات في 12 ملليلتر من R 0.2 المتوسط ، الذي يحتوي على 0.2 سكروز مولار.
بعد إعادة تعليق الحبيبات في زجاجة واحدة ، أضف التعليق إلى الزجاجة التالية وكرر إعادة التعليق لتجميع المعلقات في زجاجة واحدة. قم بتوزيع التعليق المجمع بين ستة أنابيب طرد مركزي فائقة سعة ثلاثة ملليلتر ، ليصل الحد الأقصى لحجم 2.5 ملليلتر في كل أنبوب. ثم استخدم صوتنة الطرف بسعة 100٪لسونيكات كل أنبوب أربع مرات لمدة 10 ثوان لكل منهما.
تأكد من إبقاء قرن الصوتنة مغمورا وبعيدا عن سطح السائل لمنع الزبد. حرك بوق الصوتنة ببطء لأعلى ولأسفل داخل التعليق خلال كل جولة. أثناء تبديل الأنابيب الأربعة ، أعد كل أنبوب إلى دلو ثلج بعد كل صوتنة للسماح للعينة بالتبريد.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الثايلاكويد الخام الصوتي عند 150،000 G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة سطح الوسادة باستخدام حقنة وإبرة قياس 22 واحصد الوسادة العائمة الصفراء والزيتية الناتجة من البلاستوغلوبولات الخام من وسادة السكروز. استرجع ما يقرب من 500 ميكرولتر من كل أنبوب وأودعها في أنبوب سعة 2.0 ملليلتر.
جمع القسمة الثايلاكويد الخام قبل وبعد صوتنة وإطلاق البلاستوغلوبولات. بمجرد الانتهاء من ذلك ، إما أن تستمر في معالجة الأنسجة النباتية أو تخزين البلاستوغلوبولات الخام عند 80 درجة مئوية تحت الصفر وتنقيتها لاحقا. ينمو 50 ملليلتر من أنواع synechocystis PCC 6802 في وسائط BG11 لمدة 7 إلى 10 أيام للوصول إلى المرحلة الثابتة.
باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، اضبط كثافة الخلية على كثافة بصرية تبلغ 2.0 عند 750 نانومتر. لإزالة السكريات ، الطرد المركزي 50 ملليلتر من الثقافة وإزالة المادة الطافية. كرر غسل الخلايا في 50 ملليلتر من المخزن المؤقت A مرتين.
أعد تعليق الحبيبات المغسولة في 25 ملليلتر من المخزن المؤقت A وكسر الخلايا باستخدام خلية ضغط فرنسية عند 1،100 رطل بوصة مربعة. كرر العملية ثلاث مرات في الظروف الباردة حتى يتغير اللون المحلل من الأخضر إلى الأحمر والأزرق والأخضر تحت الضوء الأبيض. قم بإزالة حصص تجانس الخلية وضعه جانبا ليتم تخزينه كعينة خلية كلية تمثيلية.
توزيع التجانس الناتج في ثمانية أنابيب الطرد المركزي الفائق ثلاثة ملليلتر مملوءة بحد أقصى 2.5 ملليلتر في كل أنبوب. تراكب هذا التجانس مع 400 ميكرولتر من متوسط R ، مما ينتج عنه تدرج خطوة. قم بموازنة الأنابيب بعناية عن طريق إضافة وسيط إضافي R حسب الضرورة قبل الطرد المركزي للأنابيب.
تظهر الثايلاكويد والعضيات الأثقل الأخرى، بما في ذلك أي أجسام متعددة هيدروكسي ألكانوات، تكوين الكريات، بينما تشكل البلاستوغلوبولات وسادة زيتية صفراء على قمة تدرج السكروز أو بالقرب منه. حصاد الوسادة العائمة الناتجة من plastoglobules الخام مع حقنة ، كما هو موضح سابقا ، وإيداع الحصاد في أنبوب 2 ملليلتر. اكشط البلاستوغلوبولات من جانب جدار أنبوب الطرد المركزي الفائق بطرف إبرة إذا لزم الأمر.
إما أن تستمر في معالجة البكتيريا الزرقاء أو تخزن البلاستوغلوبولات الخام عند 80 درجة مئوية تحت الصفر وتنقيتها لاحقا. لحصاد البلاستوغلوبولات النقية باستخدام طريقة معالجة الأنسجة النباتية ، قم بإعداد تدرج السكروز الموصوف سابقا باستخدام 500 ميكرولتر من البلاستوغلوبولات الخام ، و 400 ميكرولتر من المتوسط R 0.2 ، و 400 ميكرولتر من R.بعد الطرد المركزي ، احصد الوسادة العائمة الناتجة من البلاستوغلوبولات النقية في أنبوب سعة 2 ملليلتر. بعد نقث البلاستوغلوبولات النقية وتجميد القسمة في النيتروجين السائل ، قم إما بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر أو تجفيفها بالتجميد إلى مسحوق جاف.
لحصاد البلاستوغلوبولات النقية من البكتيريا الزرقاء ، قم بإنشاء تدرج السكروز ، كما ذكرنا سابقا ، باستخدام 500 ميكرولتر من البلاستوغلوبول الخام ، و 750 ميكرولتر من الوسط R 0.7 ، و 750 ميكرولتر من الوسط R 0.2. بعد الطرد المركزي ، اجمع البلاستوغلوبولات النقية في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر وقسمة البلاستوغلوبولات النقية. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتجميد حصص البلاستوغلوبولات النقية في النيتروجين السائل وتخزينها مباشرة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر أو تجفيفها بالتجميد إلى مسحوق جاف.
في هذه الطريقة ، شوهدت كمية كبيرة من مادة البلاستوغلوبول أو مادة قطرات الدهون تطفو على الطبقة العليا من وسادة السكروز. بعد الطرد المركزي اللاحق ، تم الحصول على البلاستوغلوبولات المنقاة عند أو بالقرب من سطح تدرج السكروز. بعد العزل الناجح للبلاستوغلوبولات ، أظهرت البقع المناعية التي تم تطويرها لتقييم النقاء باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد أرابيدوبسيس ثاليانا فيبريلين 1 أ والوحدة الفرعية للنظام الضوئي أرابيدوبسيس ثاليانا II D1 أن متماثلات الفيبريلين كانت مرتبطة في المقام الأول بالثايلاكويدات من البلاستوغلوبولات.
لضمان الاستخراج الفعال والمركز للوسادة العائمة ، ضع فتحة إبرة المحقنة أسفل السطح السائل للمخزن المؤقت مباشرة أثناء غمرها بالكامل ، ثم اسحبها برفق. عينات البلاستوغلوبول المعزولة قابلة للدراسات البروتينية أو الدهنية اللاحقة وقد استخدمت لإثبات التغيرات في تكوين البروتين والدهون المستهدفة في ظل ظروف بيئية مختلفة. سهلت هذه التقنية دراسات جديدة للبلاستوغلوبول ، بما في ذلك اكتشاف نشاط كيناز البروتين المرتبط ووجود مجمعات البروتين قليل القسيمات من خلال التحقيق الكيميائي الحيوي اللاحق.
