El aislamiento de plastoglóbulos de alta pureza es fundamental para su estudio. Aquí se presenta un protocolo rápido y efectivo para su aislamiento que facilita su investigación bioquímica posterior. El principal beneficio de este método es la velocidad relativa del procedimiento y su adaptabilidad a numerosas especies de plantas y condiciones ambientales.
Se debe tener especial cuidado al sonicar las resuspensiones de tilacoides para garantizar una fuerza suficiente para eliminar los plastoglóbulos de los tilacoides y con la posterior extracción de plastoglóbulos del gradiente de sacarosa. Demostrando este procedimiento estarán el Dr. Elsinraju Devadasu, investigador postdoctoral en mi laboratorio, y Febri Susanto, estudiante de doctorado en mi laboratorio. Comience adquiriendo plántulas de tres semanas de edad de seis maíz sanos, con etapa de crecimiento V5 y un peso aproximado de 120 gramos.
Recorte todas las hojas en la base del tallo y sumérjalas rápidamente en un baño de hielo antes de transportarlas a la cámara frigorífica. Trabajando bajo una lámpara de seguridad verde, retire las hojas de maíz del baño de hielo y córtelas en pedazos más pequeños de cinco por cinco centímetros con tijeras. Moler suave y completamente la mitad del tejido de la hoja recortado en 350 mililitros del tampón de molienda a un nivel inferior a siete en una licuadora comercial.
Comience y detenga la licuadora de cinco a seis veces para asegurarse de que todas las hojas estén cortadas. Filtre el homogeneizado a través de una capa de tela de nylon de 25 micras en un embudo grande a cuatro botellas de centrífuga de 250 mililitros. Después de repetir el paso de mezcla con el tejido de hoja recortado restante, divida uniformemente el filtrado entre las cuatro botellas.
Retirar una alícuota del filtrado foliar y reservarla para almacenarla como muestra representativa de la hoja total. A continuación, centrifugar el filtrado durante seis minutos a 1, 840 G y cuatro grados centígrados. Vierta el sobrenadante resultante y, con suaves movimientos de remolino del cepillo, vuelva a suspender el pellet en 12 mililitros de medio R 0.2, que contiene 0.2 molar sacarosa.
Después de resuspender el pellet en una botella, agregue la suspensión a la siguiente botella y repita la resuspensión para agrupar las suspensiones en una botella. Distribuir la suspensión agrupada entre seis tubos de ultracentrífuga de tres mililitros, alcanzando un volumen máximo de 2,5 mililitros en cada tubo. Luego use el sonicador de punta a una amplitud del 100% para sonicar cada tubo cuatro veces durante 10 segundos cada una.
Asegúrese de mantener la bocina del sonicador sumergida y lejos de la superficie del líquido para evitar la espuma. Mueva lentamente la bocina del sonicador hacia arriba y hacia abajo dentro de la suspensión durante cada ronda. Mientras alterna los cuatro tubos, devuelva cada tubo a un cubo de hielo después de cada sonicación para permitir que la muestra se enfríe.
Una vez hecho esto, centrifugar la suspensión tilacoide cruda sonicada a 150, 000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Roze la superficie del cojín con una jeringa y una aguja de calibre 22 y recoja la almohadilla flotante amarilla y aceitosa resultante de plastoglóbulos crudos del cojín de sacarosa. Recuperar aproximadamente 500 microlitros de cada tubo y depositarlos en un tubo de 2,0 mililitros.
Recolectar alícuotas tilacoides crudas antes y después de la sonicación y liberación de plastoglobulos. Una vez hecho esto, continúe el procesamiento del tejido vegetal o almacene los plastoglóbulos crudos a menos 80 grados centígrados y purifíquelos más tarde. Cultivar 50 mililitros de la especie PCC 6802 de synechocystis en medios BG11 durante 7 a 10 días para alcanzar la fase estacionaria.
Usando un espectrofotómetro, ajuste la densidad celular a una densidad óptica de 2.0 a 750 nanómetros. Para eliminar los polisacáridos, centrifugar 50 mililitros de cultivo y eliminar el sobrenadante. Repita el lavado de las células en 50 mililitros de tampón A dos veces.
Resuspenda el pellet lavado en 25 mililitros de tampón A y rompa las celdas usando una celda de presión francesa a 1, 100 libras de pulgadas cuadradas. Repita el proceso tres veces en condiciones frías hasta que el color lisado cambie de verde a rojo, azul, verde bajo luz blanca. Retirar la alícuota del homogeneizado celular y reservarla para almacenarla como muestra celular total representativa.
Distribuir el homogeneizado resultante en ocho tubos de ultracentrífuga de tres mililitros llenos hasta un máximo de 2,5 mililitros en cada tubo. Superponga este homogeneizado con 400 microlitros de medio R, produciendo un gradiente de paso. Equilibre cuidadosamente los tubos agregando medio R adicional según sea necesario antes de centrifugar los tubos.
El tilacoide y otros orgánulos más pesados, incluyendo cualquier cuerpo de polihidroxialcanoato, muestran formación de pellets, mientras que los plastoglobullos forman una almohadilla aceitosa amarilla en o cerca de la parte superior del gradiente de sacarosa. Coseche la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos crudos con una jeringa, como se demostró anteriormente, y deposite la cosecha en un tubo de dos mililitros. Raspe los plastoglóbulos del lado de la pared del tubo de la centrífuga con una punta de aguja si es necesario.
Continúe con el procesamiento de cianobacterias o almacene plastoglóbulos crudos a menos 80 grados centígrados y purifique más tarde. Para cosechar los plastoglóbulos puros utilizando el método de procesamiento de tejido vegetal, prepare el gradiente de sacarosa descrito anteriormente utilizando 500 microlitros de plastoglóbulos crudos, 400 microlitros de R medio 0.2 y 400 microlitros de R medio. Después de alícuota los plastoglóbulos puros y congelar rápidamente las alícuotas en nitrógeno líquido, almacénelos a menos 80 grados centígrados o liofilícelos en polvo seco.
Para cosechar plastoglóbulos puros de cianobacterias, cree un gradiente de sacarosa, como se mencionó anteriormente, utilizando 500 microlitros de plastoglóbulos crudos, 750 microlitros de medio R 0.7 y 750 microlitros de medio R 0.2. Después de la centrifugación, recoger los plastoglóbulos puros en un tubo de 1,5 mililitros y alícuota los plastoglóbulos puros. Una vez hecho esto, congele rápidamente las alícuotas de plastoglóbulos puros en nitrógeno líquido y guárdelas directamente a menos 80 grados centígrados o liofilícelas hasta obtener un polvo seco.
En este método, se observó una cantidad significativa de plastoglóbulo o material de gota de lípidos flotando en la capa superior del cojín de sacarosa. Después de la centrifugación posterior, se obtuvieron plastoglóbulos purificados en o cerca de la superficie del gradiente de sacarosa. Después del aislamiento exitoso de plastoglobulos, los inmunoblots desarrollados para la evaluación de la pureza utilizando anticuerpos generados contra la fibrilina 1a de Arabidopsis thaliana y la subunidad D1 del fotosistema II de Arabidopsis thaliana mostraron que los homólogos de fibrilina se asociaron principalmente con tilacoides que con los plastoglobulos.
Para garantizar la extracción eficiente y concentrada de la almohadilla flotante, coloque el orificio de la aguja de la jeringa justo debajo de la superficie líquida del tampón mientras está completamente sumergido, luego tire suavemente hacia arriba. Las muestras aisladas de plastoglóbulos son susceptibles de estudios proteómicos o lipidómicos posteriores y se han utilizado para demostrar los cambios en la composición proteína-lípido objetivo en diferentes condiciones ambientales. Esta técnica ha facilitado nuevos estudios del plastoglobulo, incluyendo el descubrimiento de la actividad asociada a la proteína quinasa y la presencia de complejos proteicos oligoméricos a través de la investigación bioquímica posterior.
