Die Isolierung hochreiner Plastoglobuli ist für ihre Untersuchung entscheidend. Ein schnelles und effektives Protokoll für ihre Isolierung, das ihre nachgelagerte biochemische Untersuchung erleichtert, wird hier vorgestellt. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt in der relativen Geschwindigkeit des Verfahrens und ihrer Anpassungsfähigkeit an zahlreiche Pflanzenarten und Umweltbedingungen.
Bei der Beschallung von Thylakoid-Resuspensionen ist besondere Vorsicht geboten, um eine ausreichende Kraft zum Entfernen von Plastoglobulen aus Thylakoiden und bei der anschließenden Extraktion von Plastoglobulen aus dem Saccharosegradienten zu gewährleisten. Dieses Verfahren wird von Dr. Elsinraju Devadasu, einem Postdoktoranden in meinem Labor, und Febri Susanto, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit dem Erwerb von drei Wochen alten Sämlingen von sechs gesunden Maissorten mit V5-Wachstumsstadium und einem Gewicht von etwa 120 Gramm.
Schneiden Sie alle Blätter an der Basis des Stängels ab und tauchen Sie sie schnell in ein Eisbad, bevor Sie sie in den Kühlraum transportieren. Unter einer grünen Sicherheitslampe die Maisblätter aus dem Eisbad nehmen und mit einer Schere in kleinere, fünf mal fünf Zentimeter große Stücke schneiden. Mahlen Sie vorsichtig und gründlich die Hälfte des abgeschnittenen Blattgewebes in 350 Milliliter des Mahlpuffers auf einem Niveau von weniger als sieben auf einem handelsüblichen Mixer.
Starten und stoppen Sie den Mixer fünf- bis sechsmal, um sicherzustellen, dass alle Blätter geschnitten sind. Filtrieren Sie das Homogenat durch eine Schicht 25-Mikron-Nylontuch auf einem großen Trichter zu vier 250-Milliliter-Zentrifugenflaschen. Nachdem Sie den Mischschritt mit dem verbleibenden abgeschnittenen Blattgewebe wiederholt haben, verteilen Sie das Filtrat gleichmäßig auf die vier Flaschen.
Ein aliquoter Teil des Blattfiltrats wird entfernt und beiseite gestellt, um als repräsentative Gesamtblattprobe aufbewahrt zu werden. Anschließend wird das Filtrat sechs Minuten lang bei 1,840 g und vier Grad Celsius zentrifugiert. Gießen Sie den resultierenden Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet mit sanften Wirbelbewegungen der Bürste in 12 Milliliter Medium R 0,2, das 0,2 molare Saccharose enthält.
Nachdem Sie das Pellet in einer Flasche resuspendiert haben, geben Sie die Suspension in die nächste Flasche und wiederholen Sie die Resuspension, um die Suspensionen in einer Flasche zu sammeln. Verteilen Sie die gepoolte Suspension auf sechs Drei-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen, wobei in jedem Röhrchen ein maximales Volumen von 2,5 Millilitern erreicht wird. Verwenden Sie dann den Spitzenbeschaller mit einer Amplitude von 100%, um jede Röhre viermal für jeweils 10 Sekunden zu beschallen.
Stellen Sie sicher, dass das Ultraschallhorn unter Wasser und von der Flüssigkeitsoberfläche ferngehalten wird, um ein Aufschäumen zu vermeiden. Bewegen Sie das Ultraschallhorn während jeder Runde langsam innerhalb der Aufhängung auf und ab. Während Sie die vier Röhrchen abwechseln, geben Sie jedes Röhrchen nach jeder Beschallung in einen Eiskübel zurück, damit die Probe abkühlen kann.
Anschließend wird die beschallte rohe Thylakoidsuspension bei 150.000 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Schöpfen Sie die Kissenoberfläche mit einer Spritze und einer 22-Gauge-Nadel ab und entnehmen Sie das resultierende gelbe und ölige Schwimmkissen aus rohen Plastoglobulen aus dem Saccharosekissen. Gewinnen Sie ca. 500 Mikroliter aus jedem Röhrchen zurück und geben Sie sie in ein 2,0-Milliliter-Röhrchen.
Sammeln Sie rohe Thylakoid-Aliquots vor und nach der Beschallung und Freisetzung von Plastoglobuli. Danach setzen Sie entweder die Verarbeitung des Pflanzengewebes fort oder lagern Sie die rohen Plastoglobuli bei minus 80 Grad Celsius und reinigen Sie sie später. Züchten Sie 50 Milliliter Synechocystis-Spezies PCC 6802-Kultur in BG11-Medien für 7 bis 10 Tage, um die stationäre Phase zu erreichen.
Stellen Sie die Zelldichte mit einem Spektralphotometer auf eine optische Dichte von 2,0 bei 750 Nanometern ein. Um die Polysaccharide zu entfernen, zentrifugieren Sie 50 Milliliter Kultur und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie das Waschen der Zellen in 50 Milliliter Puffer A zweimal.
Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in 25 Milliliter Puffer A und brechen Sie die Zellen mit einer französischen Druckzelle bei 1, 100 Pfund Quadratzoll. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal unter kalten Bedingungen, bis die lysierte Farbe unter weißem Licht von grün zu rot, blau, grün wechselt. Das aliquot des Zellhomogenats wird entfernt und beiseite gestellt, um es als repräsentative Gesamtzellprobe aufzubewahren.
Verteilen Sie das resultierende Homogenat in acht Drei-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen, die in jedem Röhrchen maximal 2,5 Milliliter gefüllt sind. Dieses Homogenat wird mit 400 Mikrolitern Medium R überlagert, wodurch ein Stufengradient entsteht. Die Röhrchen sorgfältig ausbalancieren, indem Sie bei Bedarf zusätzliches Medium R hinzufügen, bevor Sie die Röhrchen zentrifugieren.
Das Thylakoid und andere schwerere Organellen, einschließlich aller Polyhydroxyalkanoatkörper, zeigen eine Pelletbildung, während Plastoglobulen ein gelbes öliges Pad auf oder nahe der Oberseite des Saccharosegradienten bilden. Ernten Sie das resultierende schwimmende Pad aus rohen Plastoglobulen mit einer Spritze, wie bereits gezeigt, und legen Sie die Ernte in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen. Kratzen Sie die Plastoglobuli bei Bedarf mit einer Nadelspitze seitlich von der Wand des Ultrazentrifugenröhrchens ab.
Entweder mit der Cyanobakterien-Verarbeitung fortfahren oder rohe Plastoglobuli bei minus 80 Grad Celsius lagern und später reinigen. Um die reinen Plastoglobulen unter Verwendung der Methode der Pflanzengewebeverarbeitung zu ernten, bereiten Sie den zuvor beschriebenen Saccharosegradienten unter Verwendung von 500 Mikrolitern roher Plastoglobuli, 400 Mikrolitern Medium R 0,2 und 400 Mikrolitern Medium R vor.Nach der Zentrifugation wird das resultierende schwimmende Pad aus reinen Plastoglobulen in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen geerntet. Nach dem Aliquotieren der reinen Plastoglobuli und dem Schockgefrieren der Aliquoten in flüssigem Stickstoff lagern Sie sie entweder bei minus 80 Grad Celsius oder lyophilisieren Sie sie zu einem trockenen Pulver.
Um reine Plastoglobulen aus Cyanobakterien zu ernten, erzeugen Sie, wie bereits erwähnt, einen Saccharosegradienten unter Verwendung von 500 Mikrolitern der rohen Plastoglobuli, 750 Mikroliter Medium R 0,7 und 750 Mikroliter Medium R 0,2. Nach der Zentrifugation werden die reinen Plastoglobuli in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen gesammelt und die reinen Plastoglobuli aliquotiert. Anschließend die reinen Plastoglobuli aliquot in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und direkt bei minus 80 Grad Celsius lagern oder zu einem trockenen Pulver gefrieren.
Bei dieser Methode wurde eine signifikante Menge an Plastoglobulen- oder Lipidtröpfchenmaterial auf der obersten Schicht des Saccharosekissens schwimmend gesehen. Nach anschließender Zentrifugation wurden gereinigte Plastoglobulen an oder nahe der Oberfläche des Saccharosegradienten erhalten. Nach der erfolgreichen Isolierung von Plastoglobuli zeigten Immunoblots, die zur Reinheitsbeurteilung mit Antikörpern gegen Arabidopsis thaliana Fibrillin 1a und Arabidopsis thaliana Photosystem II Untereinheit D1 entwickelt wurden, dass die Fibrillin-Homologe primär mit Thylakoiden assoziiert waren als die Plastoglobuli.
Um eine effiziente und konzentrierte Extraktion des schwimmenden Pads zu gewährleisten, platzieren Sie die Spritzennadelöffnung direkt unter der Flüssigkeitsoberfläche des Puffers, während Sie vollständig eingetaucht sind, und ziehen Sie sie dann vorsichtig nach oben. Isolierte Plastoglobulenproben sind für nachfolgende proteomische oder lipidomische Studien geeignet und wurden verwendet, um die Veränderungen in der angestrebten Protein-Lipid-Zusammensetzung unter verschiedenen Umweltbedingungen nachzuweisen. Diese Technik hat neue Studien der Plastoglobule ermöglicht, einschließlich der Entdeckung der assoziierten Proteinkinaseaktivität und des Vorhandenseins von oligomeren Proteinkomplexen durch nachfolgende biochemische Untersuchungen.
