Bağırsak mikrobiyomu, konakçının fizyolojisini şekillendirmede önemli rol oynar. Bu protokol, özellikle, tek, hücresel hayvanlarda floresan bağırsak mikrop kolonizasyon seviyelerinin büyük ölçekte yüksek verimli değerlendirmesine izin verir. Bu yöntemin en büyük faydalarından biri, canlı hayvanların bağırsak mikrobiyomunu gerçek zamanlı olarak izleme yeteneğidir, bu da herhangi bir değişikliğin konakçının fizyolojisi ile tanımlanmasına ve korelasyonuna izin verir.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Dana Blackburn olacak. Solucanları bakteri çimlerinden bir ila iki mililitre M9-TX ile yıkayarak başlayın. Solucanları sterilize edilmiş iki mililitrelik 96 kuyu derinliğinde bir plakaya aktarın.
Bir dakika boyunca 300 G'de pelet yapın ve bir aspirasyon manifoldu kullanarak sıvıyı çıkarın. 1,2 mililitrelik çok kanallı bir pipet kullanarak, birkaç kez pipetleyerek karıştırılan derin kuyu plakasının her bir oyuğuna 1,8 mililitre M9-TX ekleyin ve bir dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Son yıkamadan sonra, aspirasyon manifoldunu kullanarak her bir oyuktaki hacmi 100 mikrolitreye getirin.
Her kuyucuğa 100 mikrolitre 10 milimolar levamisol ve M9-T ekleyin ve solucanların beş dakika boyunca felç olmasına izin verin. Daha sonra bakteri kümelerini azaltmak için her bir oyuğa iki dakika boyunca% 4 ağartma solüsyonu ekleyin. Ağartma işleminden sonra, solucanları yıkamak için plakanın her bir oyuğuna M9-TX ekleyin.
Plakayı santrifüjleyin ve ikinci yıkamadan sonra 100 mikrolitrelik son hacme aspire edin. Solucanları, 150 mikrolitre 10 milimol levamisol ve M9-TX içeren düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Solucan yoğunluğunu kuyu başına 50 ila 100 solucanda tutun ve popülasyon çok kalabalıksa solucanları birden fazla kuyuya bölün.
Hava kompresörünü, bilgisayarı ve LPS cihazını açın. Atık tankını kontrol edin ve boşaltın. Hacim düşükse kılıf ve su depolarını kontrol edin ve yeniden doldurun.
250 mikrometre akışkan ve optik çekirdek tertibatının yerinde olduğundan emin olun. Otomatik örnekleyiciyi bağlayın ve açın. Otomatik örnekleyiciyi ve LPS yazılımını açmak için otomatik örnekleyici cihaz yazılımını açın.
LPS yazılım penceresinde dosyaya gidin ve yeni deneme'ye tıklayın, ardından dosyayı tekrar seçin ve yeni örnek denetimi'ne tıklayın. Henüz yapılmadıysa, lazerlerin 488 ve 561 nanometre lazerleri açmasını sağlayın. Şimdi, LPS yazılım penceresinde uçuş süresi, sönme ve floresan kanallarını kullanarak edinim nokta grafikleri için şablonlar oluşturun.
Ölçeklendirmeyi değiştirmek için grafiğin gövdesine sağ tıklayın. Ardından, kontrol örneklerini yükleyin. Otomatik örnekleyici penceresinde Prime'ı seçin, dosyaya gidin, doğru yerleşik komut dosyasını seçmek için komut dosyasını aç'a tıklayın ve Tamam'a tıklayın.
Analiz için istenen kuyucukları seçmek için numune alıcı yazılım menüsündeki plaka şablonuna gidin. Plakayı otomatik örnekleyici aşamasına yükledikten ve sabitledikten sonra, otomatik örnekleyici penceresindeki plakayı çalıştır'a basın ve istendiğinde dosyayı kaydedin, ardından LPS yazılım penceresinde üst şeritte bulunan mevcut verileri sakla düğmesine tıklayın ve verileri tekrar kaydedin. LPS yazılımını açın.
Dosyaya gidin ve yeni denemeyi seçin, ardından dosyaya geri dönün ve yeni örnek'i tıklayın. X ekseninde uçuş süresi ve Y ekseninde sönme ile bir nokta grafiği oluşturun. X ekseninde uçuş süresi ve Y ekseninde kırmızı olan başka bir nokta grafiği oluşturun.
488 ve 561 nanometre lazerleri etkinleştirmek için lazerleri etkinleştirdiğinizden emin olun. Kontrol s'yi yerleştirinampample bağlantı noktası, ardından al ve dağıt iletişim kutusunda al'a tıklayın. İstendiğinde, dosyayı kaydettiğinizden emin olun.
Popülasyonları ayırt etmek için yeterli sayıda solucan ölçüldükten sonra, uçuş ve yok olma zamanını gösteren nokta grafiğinde iptali seçin. Alanın etrafına yetişkin nüfusu temsil eden bir kapı çizin. Ardından görünüme gidin, geçit hiyerarşisine tıklayın ve floresan kapıların yetişkin nüfus kapısı altında doğru şekilde listelenip listelenmediğini kontrol edin.
Uçuş zamanına karşı kırmızı nokta grafiğinde, yetişkin solucanlarda mikrobiyom kolonizasyonunu gösteren ilgi alanlarını vurgulamak için yüksek ve düşük kırmızı değerli alanların etrafında kapılar oluşturun. Ayarlar optimize edildikten sonra dosyaya ilerleyin ve denemeyi kaydet'e tıklayın, ardından dosyaya tıklayın ve örneği kaydet'i seçin. Toplama aparatını yüklemek için, toplama aşamasının bir toplama tüpü veya 96 kuyulu bir plaka yüklemek için hazırlanmış bir konuma hareket etmesine izin vermek için yük plakası A'yı seçin.
96 kuyulu bir plakaya dağıtmak için kurulum bölümüne gidin ve plakaları seçin, ardından kalibre edilmiş plakalara tıklayın ve 96 kuyulu plakayı seçin. Ardından, solucanların sıralanacağı kuyucukları seçin ve her bir kuyucuğa sıralanacak nesnelerin sayısını girin. İlgilendiğiniz geçitli bölgeleri de belirttiğinizden emin olun.
Aynı plakaya sıralanan birden fazla kapılı bölge varsa, her biri kapı işaretli kutuyu işaretlediğinizden emin olun. Değişiklikleri kaydetmek için Tamam'ı tıklayın. Numaraları sıraladıktan ve konumları atadıktan sonra, numuneyi numune portuna yükleyin ve 96 oyuklu bir plakaya dağıtımı başlatmak için alma ve dağıtma iletişim kutusundan doldurma plakası düğmelerine tıklayın.
Erişkinlerde larvalara göre daha yüksek uzama ve uçuş süresi değerleri gözlenir. İki günlük yetişkinlerden alınan döller L1 ve L2 aşamaları tarafından domine edilirken, üç günlük yetişkinlerden gelen döllerin çoğu L3 ve L4 aşamalarına ulaştı. E.coli'de büyütüldüğünde, uçuş süresi ve uzatma değerleri üçüncü günde ikinci güne göre arttı.
Ochrobactrum, BH üç ve karışık kültürlerde yetiştirildiğinde, cenor abdidas alegorları uçuş süresi ve uzama değerlerinde farklılıklar gösterdi. Karışık durumda sadece ochrobactrum BH3'e göre artmış ochrobactrum BH3 kolonizasyonu gözlendi. Buna karşılık, yeşil, floresan değerler, karışık durumda tek başına OP50'ye göre daha düşük OP50 kolonizasyonunu gösterdi.
Solucanlar, Y eksenine doğru yoğun bir şekilde çarpıktır, bu da OP50 kolonizasyonunun çoğu solucanda düşük olduğunu, ochrobactrum, BH3 kolonizasyonu seviyelerinin popülasyonda eşit olarak dağıldığını düşündürür. Okrobaktrum, BH3 kolonizasyon düzeyleri ile vücut yoğunluğu gibi konak gelişimi ve üreme paternlerindeki farklılıklar arasındaki ilişki de gözlendi. İki üyeli karışımda yetiştirilen üç günlük yetişkinler, mikrobiyom, grup içindeki ochrobactrum kolonizasyonundaki bireysel varyasyonları gösteren geniş bir RFP yoğunluğu yelpazesi sergiledi.
Yüksek ve düşük RFP kapılarından 15 adet sıralanmış ve ayrı ayrı solucan içeren kuyucukların RFP görüntüleri gösterilmektedir. En önemli şey, protokolün ve makinenin düzgün çalıştığından emin olmak için tüm adımlar için uygun kontrolleri kullanmayı hatırlamaktır. Gerçek zamanlı olarak, belirli özelliklere sahip hayvanlar, mikrop sonrası etkileşimleri düzenleyen genleri tanımlamak için konakçı veya mikrobiyal mutant havuzlardan suşları izole etmek için kullanılabilir.
İzole edilmiş hayvanlar, RNA-seq veya benzerleri gibi tek hayvan veya zenginleştirilmiş fenotipik havuz tabanlı aşağı akış analizleri için de kullanılabilir. Gerçekten, fırsatlar gerçekten sonsuzdur.
