Ekstrasellüler vezikül alanı, hücre dışı veziküllerin protein ve RNA sinyallerini incelemek için genetik olarak izole edilebilir omurgasız modelden yoksunk. Bu protokol, C.elegans bol, saf ekstrasellüler elde etmek için yöntemler kurar. Bu sağlam RNA-SEQ ve proteomik analiz için yeterlidir.
Senkronize kültür C.elegans normal büyüme orta plaka gıda tükenmiş olduğunda, steril bir şişe üzerine beş mikrometre naylon örgü filtre kapağı güvenli ve bir vakum başlatmak için kauçuk bantlar kullanın. L1 solucanlarını filtrenin üzerine dökün ve solucan agregalarının üzerine eşit hacimde orta hacim geçirin. Girdap tan sonra, solucan süspansiyonunun üç adet 10 mikrolitrelik hacmini bir solucan yetiştirme plakası kapağına aktarın ve her damladaki hayvan sayısını sayın.
Solucan süspansiyonu, taze ortamın mikrolitresi başına iki hayvana ayarlayın ve süspansiyonu tekrar girdaplayın. Daha sonra, yeni bir plaka kapağı üzerine solucandokuz, 10 mikrolitre damla ekleyin ve el ile her damla hayvan sayısını saymak. Daha sonra her solucan popülasyonunun yüzdesi olarak ortalama ve standart hata hesaplamak ve her popülasyonda hayvanların toplam sayısını hesaplamak.
Solucanları salgı üretimine hazırlamak için, solucanları 15 mililitre steril M9 ortamında üç beş dakikalık yıkama ile yıkayın ve her tabak başına 50 mikrogram karbenicillin ve solucanları çıkarmak için yumuşak bir dönüş le, yıkamaları 50 mililitrelik konik bir tüpe birleştirin. Son yıkamadan sonra, s-Basel çözeltisi mikrolitre başına bir hayvan için kolesterol mililitre başına 2,5 mikrogram ve 50 mikromolar carbenicillin konsantrasyonu ile takviye solucanlar seyreltin. Sonra steril iki litre alt şaşkın şişe solucan süspansiyon 400 mililitre kadar ekleyin.
Şişeyi 20 santigrat derecede dairesel bir dönere ve 24 saat boyunca dakikada 100 dönüşe yerleştirin. Ekstrasellüler vezikül hasadı için, solucanları santrifüj için 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve herhangi bir partikül enkazını temizlemek için 0,22 mikrometrelik vakum filtresi ile süpernatant'ı çıkarın. Saydıktan sonra, bir bakteri çim üzerine askıya solucanlar bir damla yerleştirin ve 15 dakika sonra hareketli, felç veya ölü olarak hayvanlar puan.
Daha sonra, süzülen süpernatantı 700 mikrolitreye rejenere nitroselüloz 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme filtresi ile yoğunlaştırın ve 150 mikrolitre taze S-Basel çözeltisini azaltın. Filtre ve girdap elde edilen çözüm ve azaltma ve filtrasyon iki kez daha az önce gösterildiği gibi tekrarlayın. Son filtrasyon sonra, işleme sırasında birikmiş olabilir herhangi bir parçacık ve enkaz kaldırmak ve üreticinin talimatları uyarınca proteaz inhibitörü kokteyl artı EDTA eklemek için supernatant santrifüj.
Boyut dışlama sütunu hazırlamak için, boş bir yerçekimi akış sütunu kartuş içine askıya agarose reçine 15 mililitre decant. Sütun dolduğunda, reçine yatağı 10 mililitrelik son bir hacimde paketlenene kadar S-Basel çözeltisi ekleyin. Reçine tamponu 40 mililitre steril filtrelenmiş S-Basel çözeltisi ile değiştirin, reçinerahatsız etmemeye özen verin ve yerçekiminin tamponu sütundan boşaltmasına izin verin.
Reçinenin üst kısmı artık batırıldıktan sonra, akışı durdurmak için kartuşun altını kaplayın ve kolonun altına bir toplama tüpü yerleştirin. Sekretasyon fraksiyonunu başlatmak için kapağı çıkarın ve hemen kol yatağının üstüne konsantre sekretom çözeltisi damla-akıllıca ekleyin, s-Basel çözeltisi damla akıllıca bir mililitre eklenmesi izledi. Sütunun altına yeni bir toplama tüpü yerleştirin ve üst sütun haznesini beş mililitre S-Basel çözeltisi ile yavaşça doldurun.
Eluat ilk iki mililitre topladıktan sonra, hızlı bir şekilde sonraki dört mililitre toplamak için tüpleri değiştirin. 300 mikrolitre ye kadar sütun eluat içeren ekstrasellüler vezikül konsantre ve düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpü için filtre retentate aktarmak için bir rejenere nitroselüloz 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme spin filtre kullanın. Daha sonra filtre zarını 100 mikrolitre S-Basel çözeltisi ile yıkama başına 20 saniyelik girdapla iki kez yıkayın ve yıkamayı 500 mikrolitrelik son numune hacmi için orijinal retentate ile birleştirin.
Akış sitometrik analizi ile sayısallaştırma için ekstrasellüler vezikülleri hazırlamak için, bir mikrosantrifüj tüpüne 840 mikrolitre S-Basel çözeltisi ve 60 mikrolitre saflaştırılmış hücre dışı vezikül ekleyin. İki ek mikrosantrifüj tüpü içine numunenin 300 mikrolitre ekleyin ve tüp başına uygun bir potansiyometrik prob yedi mikrolitre ile birlikte. Son tüpe %1 Triton X-100'ün yedi mikrolitresini ekleyin ve girdap yaparak tüm tüpleri karıştırın.
Üçüncü numunenin tüpün ortasına bir sonicator ucu yerleştirin ve numuneyi %20 güç ve %30 görev döngüsüyle 10 kez darbele atın. Daha sonra, iki kontrol mikrocentrifuge tüpleri için S-Basel çözeltisi 300 mikrolitre ekleyin ve boya sadece tüp prob yedi mikrolitre ekleyin. Yalnızca ikinci tüp Arabelleği etiketle.
Daha sonra tüm tüpleri standart protokollere göre akış sitometrisi ile analizedilmeden önce ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Verileri analiz etmek için, uygun akış sitometrik analiz yazılımındaki dosyaları açın. Küçük açı ışık dağılım seviyesinden bir kere10'dan 1'e 10'a kadar uzanan dikdörtgen bir geçit kurun ve toplam olayların yaklaşık %2,5'ini içerene kadar geçidi aşağı indirin.
Geçidi sondadan sonra adlandırın ve geçidi diğer iki örnek ve kontrol veri çizimine kopyalayıp yapıştırın. Ardından, çözümlemesi bir elektronik tabloya aktarın. Burada, 10 biyolojik kopyanın temsili sonuçları gösterilmiştir.
Çoğaltmalar arasındaki değişkenlik önemli değildir ve popülasyon büyüklüğünün ortalamasının tipik standart hatası %10'un biraz üzerindedir Hayvanların plakalar arasında aktarılması yaklaşık %10 hayvan kaybına yol açarken, hayvanların yaklaşık %20'si sakaroz yüzdürme adımında kaybedilir. Ortalama olarak, 1.000 vahşi tipli genç yetişkin hayvan çevrelerine 10 kilodaltondan daha büyük bir mikrogram protein salgılar. Bu kesir boyut dışlama kromatografisi ile daha da ayrıldığında, toplam protein elüsyon profili iki ila altı mililitre arasında küçük bir protein tepe ve sekiz mililitre sonra büyük bir tepe gösterir.
Hücre dışı veziküller sütun eluate ilk beş mililitre içinde yer almaktadır. C.elegans ve insan hücre dışı veziküller arasındaki akış sitometri özelliklerinin doğrudan karşılaştırılmasında, c.elegans hücre dışı vezikül örnek olaylarının bir histogramı, küçük açı ışık dağılımlarına göre sıralanır, tüm preparatların ortalama floresan yoğunluğunda yaklaşık bir kez 10-3 oranında doruğa ulaştığını gösterir. Potansiyometrik sonda DI-8-ANEPPS, sağlam etiketler C.elegans ekstrasellüler veziküller ve DI-8-ANEPPS ifadesi ile sıralanmış saflaştırılmış ekstrasellüler veziküllerin bolluğu C.elegans ve hücre kültürü türeyen preparatlar arasında önemli ölçüde farklı değildir.
Bu prosedür tarafından hazırlanan numuneler, RNA-SEQ, akış sitometrisi, nano parçacık izleme analizi ve proteomik analiz dahil olmak üzere tüm tipik aşağı hücre dışı vezikül analizi yöntemleri için uygun. C.elegans ekstrasellüler ekstrasellüler arındırmak için yöntemler kurulması araştırmacılar ın bu basit omurgasız modeli kullanarak hücre dışı vezikül kargo bileşimini etkileyen genetik yolları ve fizyolojik süreçleri incelemelerine olanak tanır.
