Bu protokol, model organizma C.elegans'ta uzunlamasına ve transkripsiyonel analizin bir kombinasyonu ile iki lipit takviyesi stratejisini açıklamaktadır. Teknik, birkaç solucan veya disseke edilmiş solucan dokusu kullanarak transkripsiyonel değişikliklerin nasıl inceleneceğini ve bir böcek popülasyonu için sıvı beslemenin hidro tekniklerle nasıl birleştirilebileceğini açıklar. Bu tekniği uygulayan bireyler, yeterli transkripsiyonel analiz elde etmek için deneyi gerçekleştirmek için kısa zaman penceresi nedeniyle doku diseksiyonu uygulamalıdır.
Başlamak için, gece boyunca yetiştirilen kültürü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüj ederek OP50 bakterilerini toplayın. Süper natantı atın. Bakteriyel peleti vorteks yoluyla 20 mililitre bakteriyel seyreltme, diyet kısıtlaması veya BDR baz içinde askıya alın ve tekrar santrifüjlemeyi 10 dakika tekrarlayın.
Süper natantı attıktan sonra, 20 X BDR bakteri stoğu hazırlamak için bakteriyel peleti BDR ortamında tekrar askıya alın. Kullanmadan önce bir BDR ortamı kullanarak bakteri stoğunu 5X'e kadar seyreltin. Çözücü olarak etanol veya dimetil sülfoksit kullanarak, yeni bir otoklavlanmış cam şişede bir lipit stok çözeltisi hazırlayın ve oksidasyonu önlemek için cam şişeyi argon veya azotla doldurun.
Besleme koşullarında istenen nihai konsantrasyonu elde etmek için lipit stok çözeltisini BDR bakteri çözeltisine aktarın. 20 saniye boyunca vorteks yaparak iyice karıştırın. Aynı hacimlerde filtrelenmiş etanol veya dimetil sülfoksitin BDR bakterileriyle karıştırılmasıyla kontrol edilen aracı hazırlayın.
İstenilen miktarda lipit veya araç kontrolünü, her besleme koşulu için üç ila dört kopya içeren 12 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktararak lipit takviyesi ve sıvı kültürü gerçekleştirin. Senkronize Caenorrhabditis elegans solucan süspansiyonunu 5X BDR bakterileriyle bire bir oranında karıştırarak mililitre başına 1.500 solucan ve bakteriler için 2.5X nihai konsantrasyon elde edin. Daha sonra solucan bakteri karışımının iki mililitresini 12 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğuna aktarın.
Tamamlandığında, 12 kuyucuklu plakayı folyo ile sarın ve plakayı istenen inkübasyon uzunluğu için 100 RPMM'de 20 santigrat derecelik bir inkübatörde çalkalayın. Plakalarda lipit takviyesi için, lipit şartlandırılmış bakterilerin bir mililitresini 10 santimetrelik bir nematod büyüme ortamının veya NGM agar plakasının merkezine tohumlayın. Çok sayıda plaka ile çalışırken nihai çalışma çözeltisinin iki plakanın tohumlanması arasında birkaç kez girdap halinde yapıldığından emin olun.
Plakayı karanlıkta bir biyogüvenlik başlığının içinde kurulayın. Senkronize solucan kültüründen 3000 solucanı 10 santimetrelik plakaya aktarın. Lipit takviyeli plakalar üzerinde yüzen solucanlar emeklemeye başlayana kadar plakayı bir biyogüvenlik başlığında kurutun.
Kurutulduktan sonra, lipit şartlandırılmış plakayı istenen süre boyunca 20 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edin ve çoklu doymamış lipitler kullanılıyorsa plakayı ışıktan koruyun. Bir PCR tüpünde 0,2 mikrolitre DNaz I ile 19,8 mikrolitre lizis çözeltisi karıştırarak her numune için 20 mikrolitre nihai lizis çözeltisi hazırlayın ve beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. RNA'yı az sayıda bütün solucandan çıkarmak için, bakteri çimlerinden 15 ila 20 solucanı taze tohumlanmamış bir NGM plakasına aktararak bakterileri çıkarın.
Tohumlanmamış NGM plakasından 15 ila 20 solucanı, minimum bakteri sayısı ile taze hazırlanmış son lizis çözeltisinin 20 mikrolitresini içeren PCR tüpüne aktarın ve lizis reaksiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka bittikten sonra, numuneyi güzel bir soğuk su banyosunda tutun ve sonda, solucanları dört kez, her seferinde beş saniye% 30 genlik ve her sonikasyon zamanı arasında 15 saniye boyunca nabız ile sonikleştirin. Lizis reaksiyonuna iki mikrolitre durdurma çözeltisi eklemeden önce tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin ve hafifçe dokunarak karıştırın.
Reaksiyonu oda sıcaklığında iki dakika boyunca inkübe edin ve ardından tüpü buz üzerine ayarlayın. RNA'yı solucan dokusundan çıkarmak için, bakteri çimlerinden yaklaşık 20 solucan toplayın ve bakterileri solucanlardan çıkarmak için taze bir tohumlanmamış NGM plakasına yerleştirin. Mümkün olduğunca az bakteri içeren 20 solucanı, dört mikromolar levamisol içeren 500 mikrolitre M9 çözeltisi içeren bir saat camına aktarın.
Solucanlar hareketsiz hale getirildiğinde, bir mililitrelik şırıngaya tutturulabilen 25 gauge iğne kullanarak germline veya bağırsağı diseke edin. Otoklavlanmış bir cam pipet kullanarak, disseke edilmiş dokuları PCR tüpüne aktarın ve tüpü iki dakika boyunca buz üzerine yerleştirin ve malzemenin altta birikmesine izin verin. 20 mikrolitre nihai lizis çözeltisi eklemeden önce süpernatantı PCR tüpünden çıkarın ve dokunarak iyice karıştırın.
Lizis reaksiyonunu beş dakika inkübe ettikten sonra, iki mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin ve tüpe birkaç kez dokunun. Ters transkripsiyona geçmeden önce tüpü iki dakika boyunca inkübe edin. Doğrulama çalışmasında, büyük bir popülasyondan ekstrakte edilen RNA ve birkaç solucan, nöropeptit işleme genlerinin, egl-3 ve egl-21'in benzer indüksiyonunu gösterdi.
Birkaç solucandan RNA ekstraksiyonunun, büyük popülasyonlardan standart CDNA sentez tekniklerine geçerli bir alternatif olabileceğini düşündürmektedir. Lipl-4 transgen solucanlarının disseke edilmiş bağırsağında, dihomo-gama-linolenik asit veya DGLA ile desteklenmiş, nöronal nöropeptit işleme genleri indüklenmemiştir. Farklı konsantrasyonlarda DGLA takviyesi, yağ-3 nakavtı üzerine solucanlarda yaşam süresinin uzamasını kurtardı.
Lipid takviyeli solucanlar, bu spesifik koşullar altında ek fenotipleri tanımlamak için RNA dizilimi, proteomik, metabolomik ve davranışsal çalışmalar için de işlenebilir. Bu metodoloji, yaşlanma araştırmalarına, lipit biyolojisine ve belirli bir fenotip ile beslenme faktörü veya metabolit arasında bir ilişki kurmayı amaçlayan diğer araştırma alanlarına uygulanabilir.
