Yazarlar finansmanı için MICINN (PTA programı Montserrat Porta de la Riva destekleyen), AGAUR (Laura Fontrodona için Doktora Bursu), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet programı Julián Ceron destekli) ve Marie Curie IRG, ISCIII ve IDIBELL tanımak istiyoruz lab.

1. Protokol A: 11 Kasar için Kültüre Worms C. Büyük popülasyonları elegans sıvı ortam içinde veya plakaların katı ortam üzerine ya kültürleme bunlardan elde edilebilir. Bunlar genellikle E ile katı NGM (Nematodu Büyüme Media) ve beslenen yetiştirilmektedir coli (ısı 13 veya soğuk 14, UV 12 tarafından öldürüldü), canlı veya ölü ya plakaları eklenir bakteriler. En sık uygulanan cerrahi canlı OP50 E. kullanır urasil sentezinde arızalı bozabilir ve solucanlar olur kalın bir tabaka haline Sığmamak olamaz coli,. <ol><li> NaCl 3 g, 17 g agar ve pepton, 2.5 g karıştırın ve H 2 O ve 975 mL 50 dk için otoklava. </li><li> 55 ° C&#39;ye kadar soğumaya şişeye </li><li> 1 M CaCI2 ve 1 ml etanol içinde 5 mg / ml kolesterol 1 ml 1 M MgSO 4 ve 1 ml 1 M KPO 4 tamponu, 25 mL (hepsi aynı kolesterol önceden autoclav eklemeed). </li><li> Steril prosedürleri kullanarak Petri kapları içine NGM solüsyonu dağıtmak; kendi hacminin 2/3 tabak kadar doldurun. </li><li> Kuruduktan sonra, kirletici maddelerin tespiti için kullanımdan önce 2-3 gün için oda sıcaklığında plakaları bırakmak için tavsiye edilir. OP50 E. bir çizgi hazırlayın Bir gliserol stoktan coli (OP50 Caenorhabditis Genetik Merkezi&#39;nden temin edilebilir). </li><li> Tek bir koloni seçin ve ajitasyon ile 37 ° C de bir gece LB içinde büyür. </li><li> Laminar akış kapağı kaldırarak plakalardan buharlaşması ve steril bir Pasteur pipetle plakaların merkezine OP50 eklemek için neme aşan izin verir. </li><li> OP50 E. İzin coli çim 8 saat boyunca oda sıcaklığında ya da 37 ° C de bir gece boyunca büyümesi. </li><li> Plakalar (37 inkübe halinde ° C plakalar kullanılmadan önce oda-sıcaklığında soğutulur edilmelidir) ile solucanların istenen miktarda ekleyin. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> Medya aynı miktarda dökmebir pipetle veya pompa ile dağıtıcı plakalarda agar plakaları, aynı hacim sağlar ve stereomikroskop yönlendirmesi gerek olmadan plakanın vites kolaylaştırır. </li><li> Oda sıcaklığında veya 4 ° C&#39;de bir kapta saklandığında Levhalar (seribaşı ve bakteri ile dereceye giremeyen iki) birkaç hafta Hazırlanan sonra kullanılabilir </li><li> Plaka kenarına bakteri kaplama kaçının. Çim solucanlar tarafı yukarı tarama olabilir plakanın kenarlarına kadar uzanır ise, dışarı kurur ve ölür. </li><li> Plakalar üzerinde tohumlanıyor bakteriler zaten 15 ölü varsa Worms daha uzun yaşıyor. </li></ul> 2. Protokol B: Alkali Hipoklorit Çözüm tedavisi (&quot;Bleaching&quot;) 11 Ağartma yöntemi C. senkronizasyonu için kullanılır İlk larva aşamasında elegans kültürleri (L1). Yumurta kabuğu e korur yöntemin prensibi solucanlar ağartıcıya duyarlı olduğunu yatmaktadırbundan mbryos. Alkalin hipoklorit solüsyonu ile tedaviden sonra, embriyolar kuluçka verir fakat daha fazla gelişimini engeller, gıda, sıvı olmadan medyada inkübe edilir. <ol><li> Solucanlar erişkin aşamasına kadar büyümesine izin verin. </li><li> M9 tamponu ile tabak yıkama ile 15 ml tüpler içinde gebe yetişkin kurtarın. </li><li> Oda sıcaklığında 400xg (standart bir tablo santrifüj üzerine ~ 1500 rpm) 2 dakika santrifüj ve süpernatan atmak tarafından Pelet solucanlar. </li><li> Tampon bakteri net görünene kadar 1-3 yıkama yapın. </li><li> Istenilen beyazlatma solüsyonu (Tablo I) ekleyin ve (yetişkin doku yıkımı mikroskop altında izlenen ve yetişkinlerin izleri hala görünür olduğunda reaksiyon genellikle birkaç bağlı olarak 3 ila 9 dakika sürer, durdurulması gerektiğini bazı dakika için kışkırtıcılık Bu tür tartışma bahsedilen solucanı pelet hacim) (Şekil 3) gibi sorunları,. </li><li> M9 Buffe ekleyerek reaksiyonu durdurunr tüpü doldurmak için. </li><li> Hızla 400 xg 1 dakika için (tedavisi hala aktif olabilir beri) santrifüj ve supernatant atın. </li><li> M9 tamponu ile tüp doldurarak pelet daha üç kez yıkanır. </li><li> Pelet için M9 tampon 1 ml ekleyin, ya da dereceye giremeyen NGM plakalarına yumurta yerleştirin ve yavaşça sallanarak ile istenilen sıcaklıkta inkübe edin. Uygun havalandırma (Şekil 4) temin edilmelidir. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> Farklı beyazlatma çözümü vardır, (Tablo 1, Şekil 1). Elinizde daha iyi çalışır birini seçin. </li><li> Zaten plakalar üzerine serilir yumurtaları, böyle bir X-ışını filmine bir parça gibi yumuşak bir malzeme ile agar yüzeyi kazıma ile geri kazanılabilir. </li><li> Onlar yakın zamanda yumurtadan larva için bir gıda kaynağı teşkil gibi yetişkin hayvanların çok fazla kalıntı senkronizasyonu bozabilir. </li><li> Yüksek sıcaklıklar biraz rahatsız edici olduğunu gelişimini hızlandırmak isenkronize ve eşitlenmemiş solucanlar arasındaki gelişmişlik farkının daha yüksek sıcaklıklarda daha fazla olacaktır, çünkü f herhangi bir solucan atlar senkronizasyonu. </li><li> Ağartma çözeltisi ile kullanımdan hemen önce gerçekleştirilmesi gerekir. Bir süre açık olmuştur sonra ek olarak, bu ağartıcı fotosensitivite bağlı, kısmen potensi kaybeder. Biz kaybını önlemek ve ışık maruziyeti en aza indirmek için küçük sarı şişeler içine tablet, her yeni şişe öneririz. </li></ul> 3. Protokol C: Solucan Kaplama <ol><li> Ağartma yapıldı sonra 12 ve 24 saat (embriyonik gelişimi tamamlamak için zaman sıcaklığına bağlıdır) arasında bekleyin ve santrifüj (400 xg&#39;de 2 dakika) solucanlar kurtarabilirsiniz. </li><li> Gerekli plakalar üzerinde yüzer, tohum solucanlar atın ve kalan sıvı kurumaya bırakın. </li><li> Gerekli sıcaklıkta tabak yerleştirin. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> M9 tampon içinde L1 larvaları ° C&#39;de bir hafta boyunca en az bir sallanan Wi 15 tutulabilirbariz değişiklikler thout. </li><li> çok beklenenden daha hızlı gıda tüketmesine ve deneme kalıntısı olabilir çünkü tohum olacak solucanlar hesaplanırken dikkatli olun. Yaklaşık 500 L1 yiyecek tükeniyor olmadan bir 55 mm levha erişkin ulaşabilirsiniz. </li></ul> 4. Protokol D: C. elegans Gözlem D.1 Nomarski gözlem Diferansiyel girişim kontrast mikroskopi boyanmamış şeffaf örneklerinde kontrastı artırmak için kullanılan optik mikroskopi aydınlatma tekniğidir. Kelimesi Nomarski Yaratıcısının adını kullanılan prizma, ifade eder. Hayvanları canlı canlı gözlemleyerek, immobilizasyon elde sadece değişikliklerle hayvan fizyolojisi incelemek mümkündür. Herhangi sabitleştirici eklenir Buna ek olarak, flüoresan belirteçler in vivo tespit edilebilir. Bu gerçek bir ilgi ve gen üzerinde ısıtılmadan floresan işaretleri olasılığı bu mümkün w süreçleri takip etmeyi kolaylaştırırÇalışmanın proteini tutulabilir hich. Bu protokol açıklanan tekniği kullanılarak, canlı solucanlar sadece görülebilir, ama onlar da yine kurtarıldı ve kaplama yapılabilir. Agar ped hazırlama (sadece kullanımdan önce): <ol><li> Su içinde% 2 agaroz hazırlayın ve eritin. 65 eridi tutun ° C </li><li> Üçüncü, temiz slayt her iki tarafında onlara bir bant ile iki slayt yerleştirin. </li><li> Bir Pasteur pipeti yere temiz bir yüzey üzerine agar bir damla. </li><li> Dik üç slayt üstüne yerleştirilen başka bir temiz slayt agar örtün. </li><li> Böylece agar damla bandı aralayıcılar kalınlığına düzleştirilir yavaşça basın. </li><li> Agar katılaşır sonra, yavaşça bantlanmış slaytlar çekin ve birini diğerine göre kaydırarak kalan iki slaytlar ayırın. </li></ol> Canlı hayvan Montaj <ol start="7"><li> T üzerine bir yerde bir levamisole 1mM damla (10 mikrolitre) veya sodyum azid 10-30 mMo yastığı ortalarsınız. </li><li> Bir solucan seçim kullanarak damla içine hayvanlar aktarın. </li><li> Yavaşça hayvanlar üzerinde bir coverslip yerleştirmek ve bazı tırnak cilası ya da silikon ile her iki tarafta bunu düzeltmek. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> 4 ° C de% 2 agaroz hacimde tutun </li><li> Erimiş agaroz, en az bir gün boyunca 65 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Not: Levamisole spastik kas felci 16 elicits bir nikotinik reseptör agonistidir. </li><li> Dikkatli olun, Sodyum Azide son derece zehirlidir! </li></ul> D.2 Etanol fiksasyon ve DAPI boyaması Burada açıklanan protokol Ancak, çünkü solucanın dissecation bazı yapıları bazı değişiklik ortaya çıkabilir, DAPI ile solucanlar boyama hızlı bir şekilde temsil eder. Böyle daha iyi solucan 17 bütünlüğünü korumak Carnoy çözümü veya formaldehit ile fiksasyon olarak DAPI boyama önceki solucanlar düzeltmek için birçok yöntem vardır. Etanol fiksasyon (18 değiştirilerek) <ol><li> Yeri ~ bir mikroskop lamı üzerine M9 tampon 10 ul (veya su). </li><li> Bir solucan kullanarak dikkatle damlasına kadar 10-25 solucanlar aktarmak bulmaya başladım. </li><li> Solucanları kaldırma ya da kuru izin vermeden filtre kağıdı ya da mümkün olduğunca bir mikro-pipet kaldırmak kadar M9 tampon kullanma. </li><li> % 90 etanol ~ 10 ul ekleyin ve kurumaya bırakın. </li><li> Bir veya iki kez 4. adımı yineleyin. </li></ol> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama <ol start="6"><li> 2 ng / ml arasında bir nihai konsantrasyona istenen yarığına sahip DAPI karıştırılır. </li><li> Yarığına karışımı: etanol tamamen buharlaştırıldı sonra, DAPI 7 ul ekleyin. </li><li> Bir coverslip yerleştirin ve bazı tırnak cilası ya da silikon ile her iki tarafta bunu düzeltmek. Slaytlar DAPI ilave edildikten sonra gözlem yaklaşık 5 dakika için hazır hale gelecektir. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> Montaj medİA gliserol içeren, az miktarda bir bütün hazırlanması karşılamak için yeterli olacak şekilde. </li><li> Ticari yarığına geniş bir yelpazede (Fluoromount veya Prolong, örneğin) vardır, bunların kalite ve fiyat sizin örnek saklamak istediğiniz ne kadar bağlıdır. </li><li> Dikkatli olun, DAPI DNA zengin bölgeler AT güçlü bağlar bilinen bir mutajen olduğunu. </li></ul> Tarifler Nematod Büyüme Orta (NGM) % 1.7 (w / v) Agar 50 mM NaCl % 0.25 (a / h) pepton 1 mM CaCI2 5 ug / ml Kolesterol 25 mM KPO 4 1 mM MgSO 4 M9 tampon 22mm KH 2 PO 4 42 mM Na 2 HPO 4 86 mM NaCl 1 mM MgSO 4 Kasar çözümleri test <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td> tarifi # 1 </td><td> tarifi # 2 </td><td> tarifi # 3 </td><td> tarifi # 4 </td><td> tarifi # 5 </td></tr><tr><td> Su (ml) </td><td> 2.75 </td><td> 3.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> sodyum hidroksit (ml) </td><td> 1,25 (1M) </td><td> 0.5 (5M) </td><td> 2,5 (1M) </td><td> 2,5 (2M) </td><td> 2,5 (1M) </td></tr><tr><td> sodyum hipoklorit% 4 (ml) Resimler ~ </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Toplam (ml) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tablo I. Farklı beyazlatma solüsyonu tarifleri Bu yazı için test edilmiştir. Tarifler # # 3 ve 4 2x olup, M9 aynı hacimde ilave edilmelidir. # 1, # # 2 ve 5 tarifleri için daha önceden 2, 11, 19 bildirilmiştir. Final konsantrasyonları: # 1 NaOH 0.25M, NaOCl% 0.8 Resimler ~<html> , # 2 NaOH 0.5M NaOCl ~% 0.8, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~% 1, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~% 1.6, # 5 NaOH 0.5M NaOCl ~% 0.8. 5.. Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. Iki farklı inkübasyon zamanlarda beş farklı beyazlatma çözümler Karşılaştırılması. N2 solucanlar M9 ile iki kere yıkanır, her beyazlatma solüsyonu içeren beş 15 ml konik tüpler içine ayrıldı. Tüpler kuvvetli bir şekilde çalkalandı ve 1 ml belirlenmiş bir süre sonra tepkime durdurma M9 sahip yeni bir tüpe aktarıldı. Ağartma sonra prosedürü solucanlar 24 saat boyunca 20 ° C&#39;de M9 1 ml ile inkübe edildi. Her iki durumda da, daha düşük bir görüntü, sadece 24 saat sonra, üstte resim ağartma sonrası alınmıştır. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 2 &quot;/&gt; Şekil 2. Ağartıcı çözeltinin sıcaklığı tedavisinde de etkilidir. N2 solucanlar eşit hacimleri, ya daha önceden 20 dakika boyunca buz üzerinde soğutuldu ve aynı süre için 25 ° C&#39;da muhafaza aynı ağartma çözeltisi ile ağartılmış edildi. Sadece beyazlatma sonrası sol gösteri resimlerin üzerine iki sütun. Tedavi solucanlar 24 saat boyunca 20 ° C&#39;de M9 1 ml ile 15 ml konik bir tüp içinde inkübe edildikten sonra. 24 saat sonra sağ ekranda resimlerin Sütunlar. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Oranı solucanı pelet: alkalin hipoklorit inkübasyon süresi tedavisinde de etkilidir solucanı pelet 50, 100, 250 ve 500 ul 3, 6 ve 9 saat için çözelti içinden 3 ağartma 2 ml ile inkübe edildi.. Taranmış L1, ölü embriyo ve yetişkin parçalarının kalıntıları 2 için 20 ° C&#39;de inkübasyondan sonra ölçüldü<html> 4 M9 tamponu 1 ml olan 15 ml&#39;lik tüplere konik saat. Erişkin solucanlar ile yaklaşık üç konfluent 55 mm levha 100 ul solucan pelet almak için gereklidir. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Uygun havalandırma kuluçkalık ve C. yaşaması için gereklidir elegans embriyosu. N2 solucanların A 100 ul topağı 6 dakika süreyle ağartılan ve 24 saat boyunca 20 ° C&#39;de M9 arasında, belirtildiği gibi, 1, 5 ya da 10 ml ile 15 ml konik bir tüp içinde kuluçkalanmağa devam etmiştir. Oklar yumurtadan vermedi yumurta işaret nerede rakam üst kısmı, 24 saat sonra kültürlerin resimleri görüntüler. En altta belirtilen şartlarda beyazlatma sonrası larvalar (açık gri) ve ölü embriyo (koyu gri) 48 saat miktarını gösteren bir grafik var. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 5 &quot;/&gt; Şekil 5. C. yaşam döngüsü elegans. Bir. Farklı aşamalarda solucanlar yaklaşık uzunluğu. Saat sıcaklığı (20 değiştirilerek) Belirtilen gelişim aşamalarında farklı solucan. B. Nomarski (yukarı) ve DAPI (aşağı) resimler bağlı olarak her bir aşamaya ulaşmak için gerekli. Her aşamada en önemli özelliği büyütülmüş L1: ok gonad somatik ve germ hattı öncüleri gösterir L4 Erken: siyah ok (Nomarski) gelişmekte olan vulva gösterir; beyaz oklar (DAPI) iki gonadal silah işaret Orta... L4 geç: ok sözde Noel ağacı aşamada gelişen vulva gösterir Genç Yetişkin:. siyah ok rahim içinde embriyo gösterir, ok ucu noktaları spermateka için, beyaz ok Yumurta gösterir Hamile olan yetişkin:. ok (DAPI) puan Döllenen embriyolar. DAPI görüntü Ok spermateka gösterir. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> 6 Şekil. L3, L4 ve Yetişkin aşamalarında vulva morfolojisi. L3 aşamada vulvada oluşan küçük bir lümen görülebilir. L4 anda bu lümen sözde &quot;Noel ağacı&quot; oluşturan genişler. Erişkin vulva zaten kapalıdır. Sarı çizgiler bu üç aşamada vulva yerini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7. L3 DAPI lekelenme, erken L4, L4 geç ve Yetişkin aşamaları. L3 anda, germ line uzamıştır. L4, gonad silah mevcut U-şekil morfolojileri. Geç-L4 aşamada spermin az gonad distalinde görülebilir. Genç Yetişkinler oosit sunuyoruz. Yetişkin germ line oosit ve embriyolar sunuyor. Sarı çizgiler th germ hatları sınırlandırmake farklı belirtilen aşamaları. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="Şekil 8" /> Şekil 8. C. 15 ve 25 ° C N2 solucanlar az elegans gelişimi 15 M9 ve ajitasyon ° C, tabak transfer ve belirtilen sıcaklıklarda belirtilen sürelerin yetiştirilen bir gece inkübe, ağartılmış edildi.

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWood%2C+WB+%22The+nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The nematode Caenorhabditis elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).</li>
<li>Potts, M. B., Cameron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+and+cell+death%3A+Caenorhabditis+elegans+and+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell lineage and cell death: Caenorhabditis elegans and cancer research.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 50-58 (2011).</li>
<li>Kimble, J., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postembryonic+cell+lineages+of+the+hermaphrodite+and+male+gonads+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 70, 396-417 (1979).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-24 (2010).</li>
<li>Depuydt, G., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+metabolism+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein metabolism and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 81-107 (2010).</li>
<li>Jia, K., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+longevity%3A+lessons+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and longevity: lessons from C. elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 47-60 (2010).</li>
<li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev. Dyn. 239, 1539-1554 (2010).</li>
<li>Waters, K. A., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+control+of+germ+cell+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic control of germ cell proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 151-160 (2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+calorie-independent+life+span+extension+from+dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Dev. Biol. 8, 49(2008).</li>
<li>Olahova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox-sensitive+peroxiredoxin+that+is+important+for+longevity+has+tissue-+and+stress-specific+roles+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A redox-sensitive peroxiredoxin that is important for longevity has tissue- and stress-specific roles in stress resistance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19839-19344 (2008).</li>
<li>Voisine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+therapeutic+drugs+for+huntington%27s+disease+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 2, e504(2007).</li>
<li>Garigan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Aceves, J., Erlij, D., Martinez-Maranon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+paralysing+action+of+tetramisole+on+Ascaris+somatic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the paralysing action of tetramisole on Ascaris somatic muscle.</a> Br. J. Pharmacol. 38, 602-607 (1970).</li>
<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Methods in cell biology.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbardm, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10417-10422 (2002).</li>
<li>Protocols [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://protocols.mmml.nl">http://protocols.mmml.nl</a> (2012).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Nematod Senkronizasyon Çeşitli çözümler ağartma tarif edilmiştir. Biz beş farklı tarifler (Tablo I) çalıştı ve bizim ellerimizde, onlar solucan nüfus senkronizasyon önemli farklılıklar (Şekil 1) göstermemiştir. Solucanların hacmi (Şekil 3) ve embriyo (Şekil 4) kuluçka inkübe edilir hangi ile M9 hacmi etkide: Bununla birlikte, bu tür deneyler sıcaklığında (Şekil 2), ağartıcı ç?...

basic caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation

Nematod Caenorhabditis elegans moleküler ve gelişim biyolojisi üzerine araştırmalar Sydney Brenner tarafından Yetmişli yılların başında başladığını ve o zamandan beri bir model organizma 1 olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. C. elegans gibi uzun yıllar 2 temel biyolojik çalışmalar için uygun bir deneysel sistem yaptık sadelik, şeffaflık ve kısa yaşam döngüsü gibi önemli özelliğe sahip. Birçok hücresel ve moleküler süreçlerin kontrolü hayvan gelişimi evrimsel korunmuş 3 olduğunu, çünkü bu nematod Keşifler geniş etkileri vardır. Hayvanlar yetişkinliğe ulaşmadan C. elegans yaşam döngüsünün bir embriyonik evre ve dört larval evreden geçer. Kalkınma sıcaklığa bağlı olarak 2 ila 4 gün sürebilir. Aşamaların her birkaç karakteristik özelliklerini görülebilir. Derin annotat ile birlikte 4,5 komple hücre soyunun bilgigenom iyon 7,8 yaşlanma nörobiyoloji 6, kök hücre biyolojisi 9 ve germ line biyoloji 10 gibi çok farklı alanlarda büyük bir modelin içine bu nematod açın. C. kılan ek bir özelliği çalışmak için cazip bir model elegans nispeten kolay bir protokol ile belirli bir aşamada senkronize solucanlar nüfus alma imkanı vardır. Bu nematod sürdürmek ve yayma kolaylığı gibi RNAi ekranlar, mikroarrayler, masif sıralama gibi küçük ya da yüksek verim denemeleri çeşitli için kullanılabilir solucanlar büyük miktarda elde etmek için güçlü bir araç sağlar senkronizasyon imkanı eklendi diğerleri arasında immunoblotting veya in situ hibridizasyon,. Şeffaflığı, C. nedeniyle elegans yapıların da Nomarski micros olarak bilinen, Diferansiyel Girişim Kontrast mikroskobu kullanılarak mikroskop altında ayırt edilebilirkopyalayın. Bir floresan DNA bağlayıcı, DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol) kullanımı, örneğin, belirli bir tanımlama ve Lokalizasyon tek tek hücrelerin yanı sıra, hücre içi yapıları / bunlara eşlik bozukluklara yol açabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation at JoVE.com

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Nematod koruma ve yayma kolaylığı<em&gt; C. elegans</em&gt; Onunla çalışmak çok güzel bir model organizma olun. Senkronize solucanların olasılığı çok hayvanlarda belirli bir işlem çalışma kolaylaştırır, ne de aynı gelişim aşamasında deneklerin önemli bir miktarda çalışma sağlar.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

basic-caenorhabditis-elegans-methods-synchronization-and-observation

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

46.5K Görüntüleme.  Bellvitge Institute for Biomedical Research. Nematod koruma ve yayma kolaylığı C. elegans Onunla çalışmak çok güzel bir model organizma olun. Senkronize solucanların olasılığı çok hayvanlarda belirli bir işlem çalışma kolaylaştırır, ne de aynı gelişim aşamasında deneklerin önemli bir miktarda çalışma sağlar.

Video: Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

Caenorhabditis elegans Isı Şok Uyanımı İndüksiyon ölçme için Standart Yöntemler

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...

Çevre

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Genetik

<meta charset="utf8"></head><body>C. elegans'ta Uçucu Seks Feromon Yanıtlarının Ekstraksiyonu ve Miktarının Belirlenmesi

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Erkek C. elegans Davranışı Üzerindeki Uçucu Seks Feromon Etkisinin İncelenmesi

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Davranış

<meta charset="utf8"></head><body>C. elegans'ın Erken Gelişim Evrelerinde Kalsiyumun İzlenmesi

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Gelişim Biyolojisi

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Biyoloji

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Temel

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Caenorhabditis elegans Isı Şok Uyanımı İndüksiyon ölçme için Standart Yöntemler

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri