Yazarlar finansmanı için MICINN (PTA programı Montserrat Porta de la Riva destekleyen), AGAUR (Laura Fontrodona için Doktora Bursu), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet programı Julián Ceron destekli) ve Marie Curie IRG, ISCIII ve IDIBELL tanımak istiyoruz lab.

1. Protokol A: 11 Kasar için Kültüre Worms C. Büyük popülasyonları elegans sıvı ortam içinde veya plakaların katı ortam üzerine ya kültürleme bunlardan elde edilebilir. Bunlar genellikle E ile katı NGM (Nematodu Büyüme Media) ve beslenen yetiştirilmektedir coli (ısı 13 veya soğuk 14, UV 12 tarafından öldürüldü), canlı veya ölü ya plakaları eklenir bakteriler. En sık uygulanan cerrahi canlı OP50 E. kullanır urasil sentezinde arızalı bozabilir ve solucanlar olur kalın bir tabaka haline Sığmamak olamaz coli,. <ol><li> NaCl 3 g, 17 g agar ve pepton, 2.5 g karıştırın ve H 2 O ve 975 mL 50 dk için otoklava. </li><li> 55 ° C&#39;ye kadar soğumaya şişeye </li><li> 1 M CaCI2 ve 1 ml etanol içinde 5 mg / ml kolesterol 1 ml 1 M MgSO 4 ve 1 ml 1 M KPO 4 tamponu, 25 mL (hepsi aynı kolesterol önceden autoclav eklemeed). </li><li> Steril prosedürleri kullanarak Petri kapları içine NGM solüsyonu dağıtmak; kendi hacminin 2/3 tabak kadar doldurun. </li><li> Kuruduktan sonra, kirletici maddelerin tespiti için kullanımdan önce 2-3 gün için oda sıcaklığında plakaları bırakmak için tavsiye edilir. OP50 E. bir çizgi hazırlayın Bir gliserol stoktan coli (OP50 Caenorhabditis Genetik Merkezi&#39;nden temin edilebilir). </li><li> Tek bir koloni seçin ve ajitasyon ile 37 ° C de bir gece LB içinde büyür. </li><li> Laminar akış kapağı kaldırarak plakalardan buharlaşması ve steril bir Pasteur pipetle plakaların merkezine OP50 eklemek için neme aşan izin verir. </li><li> OP50 E. İzin coli çim 8 saat boyunca oda sıcaklığında ya da 37 ° C de bir gece boyunca büyümesi. </li><li> Plakalar (37 inkübe halinde ° C plakalar kullanılmadan önce oda-sıcaklığında soğutulur edilmelidir) ile solucanların istenen miktarda ekleyin. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> Medya aynı miktarda dökmebir pipetle veya pompa ile dağıtıcı plakalarda agar plakaları, aynı hacim sağlar ve stereomikroskop yönlendirmesi gerek olmadan plakanın vites kolaylaştırır. </li><li> Oda sıcaklığında veya 4 ° C&#39;de bir kapta saklandığında Levhalar (seribaşı ve bakteri ile dereceye giremeyen iki) birkaç hafta Hazırlanan sonra kullanılabilir </li><li> Plaka kenarına bakteri kaplama kaçının. Çim solucanlar tarafı yukarı tarama olabilir plakanın kenarlarına kadar uzanır ise, dışarı kurur ve ölür. </li><li> Plakalar üzerinde tohumlanıyor bakteriler zaten 15 ölü varsa Worms daha uzun yaşıyor. </li></ul> 2. Protokol B: Alkali Hipoklorit Çözüm tedavisi (&quot;Bleaching&quot;) 11 Ağartma yöntemi C. senkronizasyonu için kullanılır İlk larva aşamasında elegans kültürleri (L1). Yumurta kabuğu e korur yöntemin prensibi solucanlar ağartıcıya duyarlı olduğunu yatmaktadırbundan mbryos. Alkalin hipoklorit solüsyonu ile tedaviden sonra, embriyolar kuluçka verir fakat daha fazla gelişimini engeller, gıda, sıvı olmadan medyada inkübe edilir. <ol><li> Solucanlar erişkin aşamasına kadar büyümesine izin verin. </li><li> M9 tamponu ile tabak yıkama ile 15 ml tüpler içinde gebe yetişkin kurtarın. </li><li> Oda sıcaklığında 400xg (standart bir tablo santrifüj üzerine ~ 1500 rpm) 2 dakika santrifüj ve süpernatan atmak tarafından Pelet solucanlar. </li><li> Tampon bakteri net görünene kadar 1-3 yıkama yapın. </li><li> Istenilen beyazlatma solüsyonu (Tablo I) ekleyin ve (yetişkin doku yıkımı mikroskop altında izlenen ve yetişkinlerin izleri hala görünür olduğunda reaksiyon genellikle birkaç bağlı olarak 3 ila 9 dakika sürer, durdurulması gerektiğini bazı dakika için kışkırtıcılık Bu tür tartışma bahsedilen solucanı pelet hacim) (Şekil 3) gibi sorunları,. </li><li> M9 Buffe ekleyerek reaksiyonu durdurunr tüpü doldurmak için. </li><li> Hızla 400 xg 1 dakika için (tedavisi hala aktif olabilir beri) santrifüj ve supernatant atın. </li><li> M9 tamponu ile tüp doldurarak pelet daha üç kez yıkanır. </li><li> Pelet için M9 tampon 1 ml ekleyin, ya da dereceye giremeyen NGM plakalarına yumurta yerleştirin ve yavaşça sallanarak ile istenilen sıcaklıkta inkübe edin. Uygun havalandırma (Şekil 4) temin edilmelidir. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> Farklı beyazlatma çözümü vardır, (Tablo 1, Şekil 1). Elinizde daha iyi çalışır birini seçin. </li><li> Zaten plakalar üzerine serilir yumurtaları, böyle bir X-ışını filmine bir parça gibi yumuşak bir malzeme ile agar yüzeyi kazıma ile geri kazanılabilir. </li><li> Onlar yakın zamanda yumurtadan larva için bir gıda kaynağı teşkil gibi yetişkin hayvanların çok fazla kalıntı senkronizasyonu bozabilir. </li><li> Yüksek sıcaklıklar biraz rahatsız edici olduğunu gelişimini hızlandırmak isenkronize ve eşitlenmemiş solucanlar arasındaki gelişmişlik farkının daha yüksek sıcaklıklarda daha fazla olacaktır, çünkü f herhangi bir solucan atlar senkronizasyonu. </li><li> Ağartma çözeltisi ile kullanımdan hemen önce gerçekleştirilmesi gerekir. Bir süre açık olmuştur sonra ek olarak, bu ağartıcı fotosensitivite bağlı, kısmen potensi kaybeder. Biz kaybını önlemek ve ışık maruziyeti en aza indirmek için küçük sarı şişeler içine tablet, her yeni şişe öneririz. </li></ul> 3. Protokol C: Solucan Kaplama <ol><li> Ağartma yapıldı sonra 12 ve 24 saat (embriyonik gelişimi tamamlamak için zaman sıcaklığına bağlıdır) arasında bekleyin ve santrifüj (400 xg&#39;de 2 dakika) solucanlar kurtarabilirsiniz. </li><li> Gerekli plakalar üzerinde yüzer, tohum solucanlar atın ve kalan sıvı kurumaya bırakın. </li><li> Gerekli sıcaklıkta tabak yerleştirin. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> M9 tampon içinde L1 larvaları ° C&#39;de bir hafta boyunca en az bir sallanan Wi 15 tutulabilirbariz değişiklikler thout. </li><li> çok beklenenden daha hızlı gıda tüketmesine ve deneme kalıntısı olabilir çünkü tohum olacak solucanlar hesaplanırken dikkatli olun. Yaklaşık 500 L1 yiyecek tükeniyor olmadan bir 55 mm levha erişkin ulaşabilirsiniz. </li></ul> 4. Protokol D: C. elegans Gözlem D.1 Nomarski gözlem Diferansiyel girişim kontrast mikroskopi boyanmamış şeffaf örneklerinde kontrastı artırmak için kullanılan optik mikroskopi aydınlatma tekniğidir. Kelimesi Nomarski Yaratıcısının adını kullanılan prizma, ifade eder. Hayvanları canlı canlı gözlemleyerek, immobilizasyon elde sadece değişikliklerle hayvan fizyolojisi incelemek mümkündür. Herhangi sabitleştirici eklenir Buna ek olarak, flüoresan belirteçler in vivo tespit edilebilir. Bu gerçek bir ilgi ve gen üzerinde ısıtılmadan floresan işaretleri olasılığı bu mümkün w süreçleri takip etmeyi kolaylaştırırÇalışmanın proteini tutulabilir hich. Bu protokol açıklanan tekniği kullanılarak, canlı solucanlar sadece görülebilir, ama onlar da yine kurtarıldı ve kaplama yapılabilir. Agar ped hazırlama (sadece kullanımdan önce): <ol><li> Su içinde% 2 agaroz hazırlayın ve eritin. 65 eridi tutun ° C </li><li> Üçüncü, temiz slayt her iki tarafında onlara bir bant ile iki slayt yerleştirin. </li><li> Bir Pasteur pipeti yere temiz bir yüzey üzerine agar bir damla. </li><li> Dik üç slayt üstüne yerleştirilen başka bir temiz slayt agar örtün. </li><li> Böylece agar damla bandı aralayıcılar kalınlığına düzleştirilir yavaşça basın. </li><li> Agar katılaşır sonra, yavaşça bantlanmış slaytlar çekin ve birini diğerine göre kaydırarak kalan iki slaytlar ayırın. </li></ol> Canlı hayvan Montaj <ol start="7"><li> T üzerine bir yerde bir levamisole 1mM damla (10 mikrolitre) veya sodyum azid 10-30 mMo yastığı ortalarsınız. </li><li> Bir solucan seçim kullanarak damla içine hayvanlar aktarın. </li><li> Yavaşça hayvanlar üzerinde bir coverslip yerleştirmek ve bazı tırnak cilası ya da silikon ile her iki tarafta bunu düzeltmek. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> 4 ° C de% 2 agaroz hacimde tutun </li><li> Erimiş agaroz, en az bir gün boyunca 65 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Not: Levamisole spastik kas felci 16 elicits bir nikotinik reseptör agonistidir. </li><li> Dikkatli olun, Sodyum Azide son derece zehirlidir! </li></ul> D.2 Etanol fiksasyon ve DAPI boyaması Burada açıklanan protokol Ancak, çünkü solucanın dissecation bazı yapıları bazı değişiklik ortaya çıkabilir, DAPI ile solucanlar boyama hızlı bir şekilde temsil eder. Böyle daha iyi solucan 17 bütünlüğünü korumak Carnoy çözümü veya formaldehit ile fiksasyon olarak DAPI boyama önceki solucanlar düzeltmek için birçok yöntem vardır. Etanol fiksasyon (18 değiştirilerek) <ol><li> Yeri ~ bir mikroskop lamı üzerine M9 tampon 10 ul (veya su). </li><li> Bir solucan kullanarak dikkatle damlasına kadar 10-25 solucanlar aktarmak bulmaya başladım. </li><li> Solucanları kaldırma ya da kuru izin vermeden filtre kağıdı ya da mümkün olduğunca bir mikro-pipet kaldırmak kadar M9 tampon kullanma. </li><li> % 90 etanol ~ 10 ul ekleyin ve kurumaya bırakın. </li><li> Bir veya iki kez 4. adımı yineleyin. </li></ol> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama <ol start="6"><li> 2 ng / ml arasında bir nihai konsantrasyona istenen yarığına sahip DAPI karıştırılır. </li><li> Yarığına karışımı: etanol tamamen buharlaştırıldı sonra, DAPI 7 ul ekleyin. </li><li> Bir coverslip yerleştirin ve bazı tırnak cilası ya da silikon ile her iki tarafta bunu düzeltmek. Slaytlar DAPI ilave edildikten sonra gözlem yaklaşık 5 dakika için hazır hale gelecektir. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> Montaj medİA gliserol içeren, az miktarda bir bütün hazırlanması karşılamak için yeterli olacak şekilde. </li><li> Ticari yarığına geniş bir yelpazede (Fluoromount veya Prolong, örneğin) vardır, bunların kalite ve fiyat sizin örnek saklamak istediğiniz ne kadar bağlıdır. </li><li> Dikkatli olun, DAPI DNA zengin bölgeler AT güçlü bağlar bilinen bir mutajen olduğunu. </li></ul> Tarifler Nematod Büyüme Orta (NGM) % 1.7 (w / v) Agar 50 mM NaCl % 0.25 (a / h) pepton 1 mM CaCI2 5 ug / ml Kolesterol 25 mM KPO 4 1 mM MgSO 4 M9 tampon 22mm KH 2 PO 4 42 mM Na 2 HPO 4 86 mM NaCl 1 mM MgSO 4 Kasar çözümleri test <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td> tarifi # 1 </td><td> tarifi # 2 </td><td> tarifi # 3 </td><td> tarifi # 4 </td><td> tarifi # 5 </td></tr><tr><td> Su (ml) </td><td> 2.75 </td><td> 3.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> sodyum hidroksit (ml) </td><td> 1,25 (1M) </td><td> 0.5 (5M) </td><td> 2,5 (1M) </td><td> 2,5 (2M) </td><td> 2,5 (1M) </td></tr><tr><td> sodyum hipoklorit% 4 (ml) Resimler ~ </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Toplam (ml) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tablo I. Farklı beyazlatma solüsyonu tarifleri Bu yazı için test edilmiştir. Tarifler # # 3 ve 4 2x olup, M9 aynı hacimde ilave edilmelidir. # 1, # # 2 ve 5 tarifleri için daha önceden 2, 11, 19 bildirilmiştir. Final konsantrasyonları: # 1 NaOH 0.25M, NaOCl% 0.8 Resimler ~<html> , # 2 NaOH 0.5M NaOCl ~% 0.8, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~% 1, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~% 1.6, # 5 NaOH 0.5M NaOCl ~% 0.8. 5.. Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. Iki farklı inkübasyon zamanlarda beş farklı beyazlatma çözümler Karşılaştırılması. N2 solucanlar M9 ile iki kere yıkanır, her beyazlatma solüsyonu içeren beş 15 ml konik tüpler içine ayrıldı. Tüpler kuvvetli bir şekilde çalkalandı ve 1 ml belirlenmiş bir süre sonra tepkime durdurma M9 sahip yeni bir tüpe aktarıldı. Ağartma sonra prosedürü solucanlar 24 saat boyunca 20 ° C&#39;de M9 1 ml ile inkübe edildi. Her iki durumda da, daha düşük bir görüntü, sadece 24 saat sonra, üstte resim ağartma sonrası alınmıştır. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 2 &quot;/&gt; Şekil 2. Ağartıcı çözeltinin sıcaklığı tedavisinde de etkilidir. N2 solucanlar eşit hacimleri, ya daha önceden 20 dakika boyunca buz üzerinde soğutuldu ve aynı süre için 25 ° C&#39;da muhafaza aynı ağartma çözeltisi ile ağartılmış edildi. Sadece beyazlatma sonrası sol gösteri resimlerin üzerine iki sütun. Tedavi solucanlar 24 saat boyunca 20 ° C&#39;de M9 1 ml ile 15 ml konik bir tüp içinde inkübe edildikten sonra. 24 saat sonra sağ ekranda resimlerin Sütunlar. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Oranı solucanı pelet: alkalin hipoklorit inkübasyon süresi tedavisinde de etkilidir solucanı pelet 50, 100, 250 ve 500 ul 3, 6 ve 9 saat için çözelti içinden 3 ağartma 2 ml ile inkübe edildi.. Taranmış L1, ölü embriyo ve yetişkin parçalarının kalıntıları 2 için 20 ° C&#39;de inkübasyondan sonra ölçüldü<html> 4 M9 tamponu 1 ml olan 15 ml&#39;lik tüplere konik saat. Erişkin solucanlar ile yaklaşık üç konfluent 55 mm levha 100 ul solucan pelet almak için gereklidir. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Uygun havalandırma kuluçkalık ve C. yaşaması için gereklidir elegans embriyosu. N2 solucanların A 100 ul topağı 6 dakika süreyle ağartılan ve 24 saat boyunca 20 ° C&#39;de M9 arasında, belirtildiği gibi, 1, 5 ya da 10 ml ile 15 ml konik bir tüp içinde kuluçkalanmağa devam etmiştir. Oklar yumurtadan vermedi yumurta işaret nerede rakam üst kısmı, 24 saat sonra kültürlerin resimleri görüntüler. En altta belirtilen şartlarda beyazlatma sonrası larvalar (açık gri) ve ölü embriyo (koyu gri) 48 saat miktarını gösteren bir grafik var. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 5 &quot;/&gt; Şekil 5. C. yaşam döngüsü elegans. Bir. Farklı aşamalarda solucanlar yaklaşık uzunluğu. Saat sıcaklığı (20 değiştirilerek) Belirtilen gelişim aşamalarında farklı solucan. B. Nomarski (yukarı) ve DAPI (aşağı) resimler bağlı olarak her bir aşamaya ulaşmak için gerekli. Her aşamada en önemli özelliği büyütülmüş L1: ok gonad somatik ve germ hattı öncüleri gösterir L4 Erken: siyah ok (Nomarski) gelişmekte olan vulva gösterir; beyaz oklar (DAPI) iki gonadal silah işaret Orta... L4 geç: ok sözde Noel ağacı aşamada gelişen vulva gösterir Genç Yetişkin:. siyah ok rahim içinde embriyo gösterir, ok ucu noktaları spermateka için, beyaz ok Yumurta gösterir Hamile olan yetişkin:. ok (DAPI) puan Döllenen embriyolar. DAPI görüntü Ok spermateka gösterir. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> 6 Şekil. L3, L4 ve Yetişkin aşamalarında vulva morfolojisi. L3 aşamada vulvada oluşan küçük bir lümen görülebilir. L4 anda bu lümen sözde &quot;Noel ağacı&quot; oluşturan genişler. Erişkin vulva zaten kapalıdır. Sarı çizgiler bu üç aşamada vulva yerini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7. L3 DAPI lekelenme, erken L4, L4 geç ve Yetişkin aşamaları. L3 anda, germ line uzamıştır. L4, gonad silah mevcut U-şekil morfolojileri. Geç-L4 aşamada spermin az gonad distalinde görülebilir. Genç Yetişkinler oosit sunuyoruz. Yetişkin germ line oosit ve embriyolar sunuyor. Sarı çizgiler th germ hatları sınırlandırmake farklı belirtilen aşamaları. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="Şekil 8" /> Şekil 8. C. 15 ve 25 ° C N2 solucanlar az elegans gelişimi 15 M9 ve ajitasyon ° C, tabak transfer ve belirtilen sıcaklıklarda belirtilen sürelerin yetiştirilen bir gece inkübe, ağartılmış edildi.

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The nematode Caenorhabditis elegans. , (1988).</li><li>Potts, M. B., Cameron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+and+cell+death:+Caenorhabditis+elegans+and+cancer+research.">Cell lineage and cell death: Caenorhabditis elegans and cancer research.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 50-58 (2011).</li><li>Kimble, J., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+cell+lineages+of+the+hermaphrodite+and+male+gonads+in+Caenorhabditis+elegans.">The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 70, 396-417 (1979).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-24 (2010).</li><li>Depuydt, G., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+metabolism+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Protein metabolism and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 81-107 (2010).</li><li>Jia, K., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+longevity:+lessons+from+C.+elegans.">Autophagy and longevity: lessons from C. elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 47-60 (2010).</li><li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev. Dyn. 239, 1539-1554 (2010).</li><li>Waters, K. A., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+control+of+germ+cell+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans.">Extrinsic and intrinsic control of germ cell proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 151-160 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+calorie-independent+life+span+extension+from+dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans.">Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Dev. Biol. 8, 49 (2008).</li><li>Olahova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+redox-sensitive+peroxiredoxin+that+is+important+for+longevity+has+tissue-+and+stress-specific+roles+in+stress+resistance.">A redox-sensitive peroxiredoxin that is important for longevity has tissue- and stress-specific roles in stress resistance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19839-19344 (2008).</li><li>Voisine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+therapeutic+drugs+for+huntington's+disease+using+Caenorhabditis+elegans.">Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 2, e504 (2007).</li><li>Garigan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Aceves, J., Erlij, D., Martinez-Maranon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+paralysing+action+of+tetramisole+on+Ascaris+somatic+muscle.">The mechanism of the paralysing action of tetramisole on Ascaris somatic muscle.</a> Br. J. Pharmacol. 38, 602-607 (1970).</li><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+biology.">Methods in cell biology.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbardm, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition.">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10417-10422 (2002).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Nematod Senkronizasyon Çeşitli çözümler ağartma tarif edilmiştir. Biz beş farklı tarifler (Tablo I) çalıştı ve bizim ellerimizde, onlar solucan nüfus senkronizasyon önemli farklılıklar (Şekil 1) göstermemiştir. Solucanların hacmi (Şekil 3) ve embriyo (Şekil 4) kuluçka inkübe edilir hangi ile M9 hacmi etkide: Bununla birlikte, bu tür deneyler sıcaklığında (Şekil 2), ağartıcı ç?...

basic caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation

Nematod Caenorhabditis elegans moleküler ve gelişim biyolojisi üzerine araştırmalar Sydney Brenner tarafından Yetmişli yılların başında başladığını ve o zamandan beri bir model organizma 1 olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. C. elegans gibi uzun yıllar 2 temel biyolojik çalışmalar için uygun bir deneysel sistem yaptık sadelik, şeffaflık ve kısa yaşam döngüsü gibi önemli özelliğe sahip. Birçok hücresel ve moleküler süreçlerin kontrolü hayvan gelişimi evrimsel korunmuş 3 olduğunu, çünkü bu nematod Keşifler geniş etkileri vardır. Hayvanlar yetişkinliğe ulaşmadan C. elegans yaşam döngüsünün bir embriyonik evre ve dört larval evreden geçer. Kalkınma sıcaklığa bağlı olarak 2 ila 4 gün sürebilir. Aşamaların her birkaç karakteristik özelliklerini görülebilir. Derin annotat ile birlikte 4,5 komple hücre soyunun bilgigenom iyon 7,8 yaşlanma nörobiyoloji 6, kök hücre biyolojisi 9 ve germ line biyoloji 10 gibi çok farklı alanlarda büyük bir modelin içine bu nematod açın. C. kılan ek bir özelliği çalışmak için cazip bir model elegans nispeten kolay bir protokol ile belirli bir aşamada senkronize solucanlar nüfus alma imkanı vardır. Bu nematod sürdürmek ve yayma kolaylığı gibi RNAi ekranlar, mikroarrayler, masif sıralama gibi küçük ya da yüksek verim denemeleri çeşitli için kullanılabilir solucanlar büyük miktarda elde etmek için güçlü bir araç sağlar senkronizasyon imkanı eklendi diğerleri arasında immunoblotting veya in situ hibridizasyon,. Şeffaflığı, C. nedeniyle elegans yapıların da Nomarski micros olarak bilinen, Diferansiyel Girişim Kontrast mikroskobu kullanılarak mikroskop altında ayırt edilebilirkopyalayın. Bir floresan DNA bağlayıcı, DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol) kullanımı, örneğin, belirli bir tanımlama ve Lokalizasyon tek tek hücrelerin yanı sıra, hücre içi yapıları / bunlara eşlik bozukluklara yol açabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation at JoVE.com

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Nematod koruma ve yayma kolaylığı<em&gt; C. elegans</em&gt; Onunla çalışmak çok güzel bir model organizma olun. Senkronize solucanların olasılığı çok hayvanlarda belirli bir işlem çalışma kolaylaştırır, ne de aynı gelişim aşamasında deneklerin önemli bir miktarda çalışma sağlar.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

basic-caenorhabditis-elegans-methods-synchronization-and-observation

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

45.9K Görüntüleme.  Bellvitge Institute for Biomedical Research. Nematod koruma ve yayma kolaylığı C. elegans Onunla çalışmak çok güzel bir model organizma olun. Senkronize solucanların olasılığı çok hayvanlarda belirli bir işlem çalışma kolaylaştırır, ne de aynı gelişim aşamasında deneklerin önemli bir miktarda çalışma sağlar.

Video: Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Biyoloji

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Gözlem ve telomer Niceleme ve Tekrarlayan Diziler kullanma Floresan<em&gt; In Situ</emPNA Sondalar&gt; ile hibridizasyon (FISH)<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

Caenorhabditis elegans de novo Protein Sentez Oranlarının Değerlendirilmesi

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...