Bu yöntem, bir hücre perkastı yeşil-floresan mitokondri boyası ve bir kırmızı-floresan lizozom boyası kullanarak canlı hücrelerde mitofajiyi gözlemlemeye yardımcı olur. Mitofaji, mitokondri homeostazının ve hücresel fonksiyonun çeşitli yönlerinin korunmasında önemli bir rol oynar. Bu teknik, mitokondri ile ilişkili hastalıkların tedavisinde yeni bir yaklaşım sağlayabilir.
Bu prosedür çok karmaşık değildir. Net görüntüler yakalamak, mitokondri ve lizozomların bindirmesini saymak için çok önemlidir. Başlamak için, kültür faresi embriyonik fibroblast veya MEF hücreleri, 10 mililitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı veya DMEM içeren 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabında.
37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin ve hücreleri mikroskop altında 100X büyütmede izleyin. Hücreler% 80 ila% 90 akıcılığa ulaştığında, bunları iki mililitre Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini ile yıkayın. Daha sonra hücreleri ayırmak için bir dakika boyunca iki mililitre% 0.05 tripsin EDTA, ardından reaksiyonu durdurmak için iki mililitre DMEM ekleyin.
Hücre süspansiyonunu 100 G'de üç dakika boyunca santrifüj yapın ve peleti bir mililitre DMEM'de yeniden askıya alın. Otomatik bir hücre sayacı ve hücre sayma odası slaytları kullanarak hücreleri sayın ve 10 mililitre DMEM içeren yeni bir 10 santimetre hücre kültürü kabına altıncı hücrelere 1,5 kez 10 kez aşılayın. Mitofaji testi için, tarif edildiği gibi bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve hücre süspansiyonunu, taze DMEM'in mililitresi başına bir kez 10 ila beşinci hücrelere seyreltin.
Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun iki mililitresini 20 milimetrelik bir konfokal kaba ekleyin ve çanağı bir haç içinde sallayın. 24 saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Stok çözeltilerini seyrelterek boyaların çalışma çözeltilerini hazırlayın.
0.2 mikromolar mitokondriyal boya ve 50 nanomolar lizozom boyası çalışma konsantrasyonu elde etmek için iki mililitre DMEM'e her biri 0.2 milimolar mitokondriyal boya ve 50 mikromolar lizozom boyası ekleyin. Ortamı konfokal kültür kabından çıkarın ve hücreleri örtmek için bir mililitre boyama çözeltisi ekleyin. Hücre kültürü kabını 20 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite yerleştirin.
Konfokal mikroskopi görüntüleme yazılımının parametrelerini ayarlayın. Çift uyarma görüntüleri için, 488 nanometre ve 543 nanometrede sıralı uyarma kullanın ve sırasıyla 505 ila 545 nanometre ve 560 nanometreden daha büyük emisyonları toplayın. Boyayı içeren kültür orta kabını inkübatörden çıkarın ve kaba bir mililitre Krebs-Henseleit veya KH tamponu ekleyin.
Mitofajiyi indüklemek için, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca KH tamponunda bir mikromolar'da FCCP ile tedavi edin ve hemen konfokal mikroskop kullanarak hücreleri görüntülemeye devam edin. 63X yağlı lensin üst kısmına uygun miktarda yağ uygulayın. Numuneyi konfokal mikroskobun numune aşamasına yerleştirin ve doğrudan objektif lensin üzerine taşıyın.
Yazılım arabiriminin sol üst köşesindeki Bul sekmesine tıklayarak örneği bulmak için görüntüleme yazılımını kullanın. Deneme için yeşil bir filtre kümesi seçin. Objektif lensi yukarı ve aşağı hareket ettirerek hızlı bir şekilde odaklanmak için kaba ayar düğmesini kullanın.
Hücre örneği göz merceğinden açıkça görülebildikten sonra, tek hücrelerin alanını arayın ve odaklayın ve görüş alanının merkezine taşıyın. Görüntüleri almak için yazılım arayüzünün sol üst köşesindeki Edinme sekmesine tıklayın. Önizleme için yalnızca 488 nanometre kanalı ve kare çözünürlüğü 1024 x 1024'ü seçin.
Canlı bir tarama başlatmak için sol üst köşedeki Canlı sekmesine tıklayın. Görüş alanını en keskin olana ayarlayın ve kaydırıcıyı sola veya sağa hareket ettirerek lazer gücünü ayarlayın. Aşırı pozlamayı önlemek için kazanç ayarını 600'ün altında tutun.
İğne deliği değerini 156, kazanç değerini 545 ve dijital ofset değerini sıfır olarak ayarlayın. En iyi görüş alanını seçin, iki kanalı kontrol edin ve kare çözünürlüğü 1024 x 1024'ü seçin. 2B görüntüleri almak ve elde edilen görüntüleri kaydetmek için Tuttur'u tıklatın.
Bu çalışmada, konfokal görüntüleme için MEF hücrelerinde mitofajiyi tetiklemek için FFCP kullanıldı. Mitokondri gösteren yeşil floresan mitokondri boyası ile boyanmış ve lizozom gösteren kırmızı-floresan lizozom boyası ile boyanmış hücrelerin temsili görüntüleri burada gösterilmiştir. Hasarlı yeşil lekeli mitokondri kırmızı lekeli lizozomlar tarafından yutulduğunda, yeşil ve kırmızı floresan sarı birlikte lokalize mitokondri lizozomlarını ortaya çıkarmak için üst üste biner.
Sarı noktalar, devam eden mitofajiyi temsil eden bu birlikte lokalize mitokondri lizozomlarına karşılık gelir ve bu nedenle mitofajinin derecesini değerlendirmek için sayılabilir. Mitokondri ve lizozom boyama için çalışan bir boya çözeltisinin hazırlanması ve konfokal mikroskopi ile görüntüleme sırasında uygun hücre akıcılığının korunması, hatırlanması gereken önemli adımlardır. Bu prosedür, mitokondriyal dinamikleri değerlendirmek için önemli olan mitokondriyal sayı ve morfolojiyi analiz etmek için de kullanılabilir.
Mitofaji, çeşitli insan hastalıkları ile yakından ilişkilidir ve bu teknik, mitofaji ve insan hastalıkları arasındaki bağlantıyı araştırmak için kullanılabilir.
