Biz retroviral partiküllerin üretimi için Phoenix GP ambalaj hücre hattı sağlamak için Stanford Üniversitesi&#39;nden Dr. Garry Nolan teşekkür etmek istiyorum. Biz td Domates sağlamak için Kaliforniya San Diego Üniversitesi&#39;nden Dr. Roger Tsien teşekkür ederim. Biz de onların hizmet ve yardım için San Diego Devlet Üniversitesi Sitometrisi Çekirdek Tesisi teşekkür etmek istiyorum.

Memeli Hücre, Genetik barkodlama için Viral Üretim ve İletim 1. Hazırlık <ol><li> Bir 10 sm&#39;lik plaka içinde Plaka, 2.5 x 10 6 yapışan hücreler (veya yaklaşık% 50-60 konflüans) Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında% 10 fetal dana serumu (FCS) (FCS) içinde, transfeksiyondan önce bir gün. Böyle Phoenix-GP (Gary Nolan, Stanford Üniversitesi bir tür hediye) olarak tercih retroviral üretim kullanımlık ambalajlar hücre hattı için. Not: Ambalajlama hücre soyu, trans-retroviral partikül oluşumu için gag ve pol proteinlerini ifade eder. Emin hücreler transfeksiyondan önce, sağlıklı ve bir tek tabaka plakaya uyulması emin olun. </li><li> 24 saat sonra, DNA, bir transfeksiyon karışımı hazırlandı. <ol><li> Serumsuz DMEM 125 ul 3 ug Veziküler Stomatit Virüsü Zarf glikoprotein vektörü (pCI-VSVg) ve ilgili floresan protein genini taşıyan transfer vektörü 3 ug ekleyin. 2 mg / ml (Mix ve polyethylimine 15 ul ekleyin). </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı ve damla damla hücrelere ilave edin. Not: Polyethylimine polyplexes oluşumu için, transfeksiyon tepkin maddesi olarak homojen bir DNA karışımına ilave edilir. Farklı floresan protein işaretlerini taşıyan, viral parçacıklar elde etmek için, tercih edilen bir işaretleyici ile bağımsız bir şekilde her transfeksiyon gerçekleştirin. Retroviral transfer vektörü uzunluğu yaklaşık 7 kb ve eğer 10 kb üzerinde paketlenmiş olamaz unutmayın. </li></ol></li><li> 37 ° C&#39;de inkübe edin. Bunun yerine, 30 ° C ya da 32 ° C &#39;de viral üretim yeri plakaları arttırmak için. NOT: 24 saat sonra, transfeksiyon ortamı, taze ortam 7 ml ile ikame edilmiş olabilir, ve bu hücre sağlığını geliştirmek de, bu yüzer viral yükü azaltabilir. </li><li> 48 saat sonra, transfeksiyon, 0.45 uM politetrafluoroetilen filtresi ile yüzer içeren viral parçacıklar ve filtre toplar. Transdüksiyonu için yeni toplanmış virüs süpernatant kullanın. Diğhalde, -80 ° C &#39;de parçalar halinde süpernatan tutmak ve donma-çözülme kaçının. Viral titre her donma-çözülme döngüsü muhtemelen 50% azalacak unutmayın. </li><li> Önce seçim 24 saat Levha hücre hattı iletimine yapışık ise, ya da hemen iletimi yapışmaz ise önce. 2.0 x 10 5-3,0 (burada Huh 7.5.1 ve HEK 293T) x 10 5 yapışık hücre veya 5.0 x 10 5 Tohum 1 x 10 6 yapışmayan hücreler (burada SupT1) oyuk başına bir 6-yuvalı plaka. Not: hücreler transdüksiyon zamanında yaklaşık% 60 bir katışma elde böylece hücrelerin sayısı, özellikle yapışan hücreler için, bu yüzden, transdüksiyonun öncesine tohumlanır üzere kalibre emin olun. </li><li> Tohumlanır hücrelere 5 ug / ml polibren (hexadimethrene bromür) ilave edin ve daha sonra yaklaşık% 20-40, enfeksiyon (burada 2 mi) elde etmek üzere, daha önce toplanmış virüs süpernatant ekleyin. NOT: tasnif herhangi subpopulat yükseltmek için izin verecek gibi İçişleri Bakanlığı ya da enfeksiyon yüzdesi, çoğunlukla keyfihücrelerin iyon. Açıkçası, enfeksiyon daha yüksek bir oran kolaylaştırır ve büyütme sürecini hızlandırır. </li><li> 32 ° C&#39;de 120 dakika boyunca 1500 x g&#39;de asılı kepçeli rotor içinde santrifüj ile hücreleri nakletmek. Inkübasyondan önce, taze ortam ile yıkanarak yapışmayan hücreler tekrar süspansiyon. Yapışık hücreler için, taze medya 24 saat sonrası transdüksiyon ile değiştirin. NOT: Bu üzerinde dökülmesini önlemek için parafilm ile santrifüje önce plakaları mühür tavsiye edilir. Genetik Barkodlanan hücre çeşitliliğini arttırmak için, (aşama 1.4 de elde edilmiş) farklı floresan proteinleri taşıyan viral partikül hücreleri nakletmek. Floresan belirteçler seçerken, onlar enstrümantasyon ile uyumlu olduğundan emin olun ve ayırt floresan parametreler var. </li></ol> Genetik barkodlu Hücre 2. Seçme ve Amplifikasyon <ol><li> Transdüksiyon yüzdesi oranını ölçmek için akım sitometri en az 72 saat sonrası transdüksiyon transduced memeli hücrelerini analiz. Negatif kontrol olarak, kıyaslanabilir transduse hücre çizgisi kullanın. Not: sıralama, tek tek Barkodlanan hücre popülasyonları, ilk iletimi yüksek bir yüzde oranı da saflaştırmak için kullanılabilir edileceği gibi, gerekli olmasa da, amplifikasyon işlemi hızlandırmak gerekir. </li><li> İlgili proteini eksprese eden hücreler elde etmek için seçilen hücre sıralayıcı kullanmaktadır. <ol><li> Bu amaçla, kapıları düzgün sağ kanallar ayarlanır sağlamak. <ol><li> Böylece negatif kontrol ile aynı naif hücre hattını kullanmak ve negatif nüfus her floresan eksende 10 3 değerinin altında olacak şekilde parametre / Kanal voltajını ayarlamak yapmak için. Her floresan kanal için negatif kontrol yukarıda görünen olaylar gibi pozitif floresan için yolluk belirleyin. </li></ol></li><li> Her enstrüman değişebilir farkında olun ve yolluk belirlenmesi için doğru gerilim her exp zorunlu pozitif ve negatif kontroller yaparak, buna göre ayarlanmalıdırerimental kurulum. <ol><li> Bu deneysel kurulum floresan tespiti için td Domates için eGFP için FITC kanalı (502 uzun geçiş filtresi ile devam 530/30 bant geçiren filtre), PE kanalı (bir 556 uzun geçiş filtresi ile devam 585/42 bant geçiren filtre) kullanın E2 Crimson için, ve APC kanalı (660/20 bant geçiren filtre). NOT: E2 Crimson 633 nm lazer ile heyecan ise 488 nm lazer eGFP ve td Domates heyecanlandırıyor. </li></ol></li></ol></li><li> % 100 FCS 1 ml sırala içine 15 ml konik tüpler. NOT: biri doğrudan bireysel klonlar (aşağıya bakınız) sıralama ile devam edebilirsiniz gibi floresan hücre popülasyonlarının sıralama süreci zorunlu değildir. Seçilen floresan dayalı sıkı popülasyonları sıralama bireysel klonların gelecekteki seçimi için bir yedekleme nüfusu sağlar. Tek tek hücreler bazen hücrelerin büyük bir nüfus kolaylıkla dondurulmuş ve çözülmüş sonra ve bir sonraki aşamada amplifiye edilebilir ise büyümeye zor olduğunu aklınızda bulundurun. </li><li> Sp5 dakika boyunca 32 ° C&#39;de 524 g asılı kepçeli rotor santrifüj sıralanmış popülasyonlarının aşağı hücrelerini pellet haline getirmek. Taze ortam 1 ml yeniden askıya ve bu hücre birleşmesi, en az iki gün boyunca büyümesini ve bölünmesini sağlamak için% 60&#39;ın altında olduğu, böylece hücreler plaka yeniden. <ol><li> Örneğin, 6-çukurlu plaka içinde gözenek başına ortam 2 ml yaklaşık 3 x 10 5 hücre ve 6 cm plaka ortam, 2 ml, 2 x 10 6 hücre plaka yapışan hücreler. Yapışmayan hücreler için yapışkan hücreleri ve RPMI için DMEM kullanarak (veya herhangi bir belirli bir ortamda gerekirse). Büyümesine olanak sağlamak için bir kaç gün boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde kaplama hücreleri yerleştirin. </li></ol></li></ol> 3. Farklı şiddetler de Genetiği barkodlu Hücreleri ile klonal popülasyonları elde <ol><li> Başlangıçta transdüse hücrelerden klonal popülasyonları elde (1.7 adım) veya sıralı nüfustan (adım 2.3). Not: Bu, tüm hücrenin arasında floresan protein ifade eşit veya benzer seviyede sağlayacaknüfus içinde in (% 40 ortalama floresan yoğunluğunda küçük CV ile sıkı bir nüfus). <ol><li> Bu amaçla, bir otomatik hücre yerleştirme birimi (ACDU) ile 96-çukurlu plakalara tür tek hücre. Ilgi nüfusa göre sıralama için kapıları ayarlayın. Emin olun kapıları farklı floresan yoğunluklarda hücreleri seçerken ayırt popülasyonları elde etmek dışında en az bir günlük ölçekli ayarlanır. Burada gösterilen prosedür için, adım 2.2 tarif biri olarak kurmak deneysel sitometri aynı akışını kullanın. </li></ol></li><li> En az 2 hafta boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde tek tek klonlar yükseltin. Amplifikasyon işlemi ile artan nüfus birden fazla tek tek hücrelerden kaynaklanan olup sağlamak için mikroskop altında hücre analiz eder. NOT: sıralayıcı ortalama kuyu başına bir hücre yerleştirir, ve bazı kuyular hiç bir hücreyi olmayabilir iken, diğerleri birden fazla olabileceğini unutmayın. <ol><li> Bir po sağlamakpulation sadece plaka ile son derece nazik olun ve pipetleme kuyu rahatsız asla bir hücreden doğar. Mikroskop altında, iyi tarafından da, plaka gözlemleyin. NOT: tek tek hücreler bazen onlar kolayca tanınabilir olacaktır bölen başladığınızda, tespit etmek zor olsa da. </li><li> Kenarları boyunca sık sık hücrelerin yığın &#39;farkında olun. Birden klonal popülasyonları görülebilir bu kuyuları atın ve bir sıkı nüfusa sahip olanlar tutmak. Not: Bu, büyütme için büyük plakalar halinde olan transfer tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Flow sitometri ile analiz ederek varsayılan klonal popülasyonları Ekran. Deney düzeneği sitometri aynı akışını kullanan bir negatif kontrol onları karşılaştırın. <ol><li> Numunenin sadece bir yüzdesini analiz ve yedekleme gibi geri kalanı tutmak. Ortalama yoğunluğu ve nüfus gerginlik dayalı en belirgin ayrı popülasyonları seçin. Bunları gerektiği gibi yükseltmek veya hisse senetleri dondurmadaha uzun bir süre veya sıvı azot kısa bir süre için, -80 ° C&#39;de% 20 gliserol ile ortam dondurulması. NOT: Bir &#39;gerçek&#39; klonal nüfus çok sıkı bir floresan desen olması gerektiğini unutmayın. </li></ol></li></ol> 4. (HTS) Yüksek Verimli Tarama için Çoklama Yetenekler olun <ol><li> Bundan başka, bir çok katlı bir biçimde kullanılabileceği gerektiği kadar farklı klonal popülasyonları birleştirin. Ayırt absorpsiyon / emisyon spektrumları ve / veya farklı şiddetlerde ile klonlar seçin. 96 kuyucuklu plak format HTS için uygun olan, kullanılırsa, 200 ul içinde 50,000 hücre tohum ile sabitleştirilir. NOT: hücrelerin sayısı sadece bir tahmindir ve hücre tipi bağlı olarak değişebilir ve yapışık olup olmadığını unutmayın. </li><li> Bağımsız kurulan floresan hücre çizgilerinin her biri birbirinden ayırt edilebilir sağlamak için akış sitometrisi ile analiz edin. Analizden önce negatif hazırlamakve tek renk kontrolleri parametre ve tazminat değerlerini ayarlamak için. NOT: açıkça sağlayacak karışık popülasyonları ayırt etmek parametrelerinin ayarlanması ayrıca bir çoğaltılmış biçimde kullanılmak üzere. </li></ol> 5. Seçim Biyolojik Uygulama Genetiği Barkodlu Hücre Hatları Uyum <ol><li> Stolp ve diğ., 2013, 59 burada tarif edildiği gibi tercih edilen deney öğeleri içeren virüs partikülleri ile oluşturulan genetik barkodlanmaktadır hücre hatları, transdüksiyonu. Tercih edilen deney, ayrı ve ayırt floresan kanal yer alması gerektiği unutmayın ve bu nedenle, uygun Barkodlanan hücre hattına transfer edilmelidir. NOT: Her barkodlu hücre çizgisi farklı bir tahlil taşıyabilir. </li><li> Tahlil unsurları içeren olanlar için Sıralama genetik floresan barkodlu hücreler. Not: Deney elemanları F (bir füzyon olarak ya da dahili ribozom giriş bölgesi ile), bir etiket ya da fluoresan proteine ​​bağlanmış mühendisliği ile elde edilebilirya da basit bir tespiti, Western blot yoluyla sitometrisi veya mikroskopi akar. Bu protokolde kullanılan sistem tek başına HA epitop yüzey ifadesi dayanır, ya da ek FLAG epitop ifadesi. <ol><li> HA ve APC-floresan akuple antikorlar ile tahlil içeren klonal popülasyonları Leke. Sonra, anti-FLAG ve FITC-konjuge antikor boyama ile klonal popülasyonları analiz. </li><li> Tahlil geri izlemek için, analiz veya &#39;kod çözme&#39; farklı genetik barkodlu hücre hatları ayırt edilebilir uygun kanalda popülasyonları. Burada, td Domates tespiti için PE kanalında analiz alt tabakanın doğasını çözmek. </li></ol></li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

İşte iki köklü prosedürler kombine edilmiş; retroviral teknoloji ve flow sitometri kullanılarak floresan proteinlerin tespiti yoluyla genetik mühendisliği. Benzersiz hücre çizgilerinin üretimi için floresan protein bazlı bir genetik barkod çok katlı uygulamalar için sağlam ve basit bir yol sağlar. Retroviral teknoloji ile genetiği barkodlu hücreleri üreten, başlangıçta uzun bir süreçtir, ama bir kez, hücre malzeme güvenilir ve istikrarlı bir kaynak kurulan elde etmesini sağlar. Bu teknoloj...

Böyle floresan spektroskopisi, floresan mikroskopi ve akım sitometri gibi teknolojiler, tüm floresan güveniyor, bir özellik yaygın, biyokimyasal biyomedikal ve kimya uygulamalarında kullandı. Floresan, içsel veya etiketleme yoluyla protein ekspresyonu ve profilleri, hücre kaderi, protein etkileşimleri ve biyolojik fonksiyonların 1-9 analizi için istismar ve olup olmadığını biyomolekülün etkileşimleri ve yapısal değişikliklerin tespiti için floresan / Förster rezonans enerji transferi yoluyla 10-13. Aequorea victoria yeşil flüoresan protein (GFP) 14 izolasyonu yana, diğer cnidarians, özellikle mercanlar ek doğal olarak oluşan floresan proteinlerin keşif, büyük ölçüde ayırt uyarma / emisyon spektrumları ile mevcut floresan proteinleri sayısı arttı. Bunlar, birlikte genlerinde 15-19 mutasyonların tanıtımıyla, have daha da araştırmaları için sitometri ve diğer floresan-tabanlı teknolojileri akış, mikroskopi istismar bilim adamları mevcut floresan proteinlerin gerçek bir palet elde, olanakları genişletti. Buna paralel olarak, bağımsız olsa da, retroviral teknolojinin gelişmesi büyük ölçüde memeli hücrelerinde 20-23 ektopik genetik bilginin istikrarlı ifadesini kolaylaştırmıştır. Bu teknolojinin, hücre tipi ve dokusunda 24-28 geniş bir dizi halinde ya da transgenik hayvanların 29-31 üretimi için floresan protein gen transferi için kullanılmış olması şaşırtıcı değildir. Retrovirüslerin doğası sonra, dış floresan protein genetik bilgi hücrenin 32 genomu içinde ilave edilir ve hücre ever&#39; `için floresan olur. Bu özellik, hücre kader izleme izin veya hücrelerin bir nüfus içinde tek bir hücrenin etti. Şimdi floresan hücre böylece acqui vardırkendi biosignature kırmızı ve barkodlanmaktadır olarak tanımlanabilir. Eşsiz biosignature diğer hücrelerden tanımlar, ve daha da önemlisi, genetik olarak ayırt emme / yayma spektrumlarının farklı floresan proteinleri ifade etmek için manipüle edilmiş hücrelerden ayıran. Bu tür pluripotensin 33 doğru yeniden programlama faktörleri izleme gibi biyolojik uygulamaları çekirdekçik lokalizasyonu 34 açıklanması için çekirdek içi faktörlerin analizi, transkripsiyonel çalışmaları 35 veya nöronal ağ mimarisi 36 çalışma için nöronların genetik etiketlemesi için flüoresan raportör plasmidlerin yapımı Aynı deney düzeneği için farklı floresan protein genleri istismar var birçok sadece dört örnekleridir. Sitometrisi geniş olarak gen ekspresyonu, hücre döngüsü, apoptoz gibi tek hücre düzeyinde biyolojik süreçlerin analizi için kullanılmıştır ve fosforil yoluyla sinyal edilmiş debiMemeli hücrelerinde floresan protein genlerinin tirme 37-43 .The stabil ekspresyon ayrıca hücre analizi 38,44 ve ligand-reseptör etkileşimleri 45 için akış sitometrisi kullanımını artırmıştır. Gelişmiş yetenekleri sitometri yüksek verimli ve yüksek içeriği 46 taranması için yaygın kullanılan metodoloji haline akışını sağladı. Çift plaka okuyucu sistemleri, görüntüleme ve sitometri akabilir Fluorometreler ve robotik teknolojileri artık genişletilmiş sayısına rağmen, istismar ve bu gelişmiş teknolojik yetenekleri sığabilecek deney tasarımında bir eksiklik var gibi görünüyor. Hızlı, güvenilir, basit ve sağlam hücre bazlı yöntemler büyük ölçüde daha yüksek verimli kapasitesini artırmak çoğaltılmış çok katlı uygulamalarda ihtiyaç vardır. Çoklanmış biçimde mühendislik hücre bazlı deneyler, yüksek verimli tarama 39,47-50 gücünü artırabilir burada ilaç keşfi alanında özellikle doğrudur </sup&gt;. O bir örnekte eş zamanlı analizler veriyor gibi Çoklama, daha yüksek verimli yetenekleri 51-54 artırır. Floresan genetik barkodlama zarif çoğullamanın sağlar, fakat aynı zamanda, bir kere mühendislik, zaman alıcı protokollerin gereğini circumvents, antikorlar, boncuk ve lekeleri 39,52,55 eşliğinde maliyetlerini azaltır, ve yüksek için gerekli ekranların sayısını azaltabilir sadece hacimli uygulamalar. Son zamanlarda biyolojik uygulamalarda, daha önce farklı klinik yaygın varyantları 58 ile HIV-1 proteaz aktivitesi 56,57 izlemek için geliştirilen bir analiz ile ifade floresan genetik barkod ile çoğullama geliştirmek nasıl retroviral teknoloji tarif etmişlerdir. metodoloji seçmek ve genetik floresan barkodlu hücreleri yükseltmek ve farklı floresan proteinleri ve / veya farklı floresan intensit ifade klonal popülasyonlarının panelleri üretmek için nasıl nasıl odaklanan bir daha açıklayıcı bir şekilde izah edilirler. Fluoresan özelliklerine göre ayırt hücre popülasyonlarının paneller ayrıca farklı biyolojik soruları ele hücre bazlı tahlillerde ile kombinasyon halinde yararlanılabilir multiplekslenmiş yetenekleri geliştirmek. protokolü de, örneğin 59 gibi, daha önce laboratuar içinde geliştirilen hücre bazlı tahlillerde birini taşıyan Barkodlanan hücrelerin bir panelini mühendislik açıklamaktadır. Bu protokol, böylece genetik transferi için köklü retroviral / lentiviral teknoloji, floresan proteinlerin değeri veya 60,48 flow sitometri uygulamaları göstermek için tasarlanmamıştır değil çoğaltılmış uygulamalar için üç birleştirerek artırıcı gücünü göstermek için.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:515px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10mL syringes</td>
			<td style="width:160px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45&#181;m plytetrafluoroethylen filter</td>
			<td style="width:160px;">pall corporation</td>
			<td>4219</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">45000-304</td>
			<td>cell growth media for HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI (Polyethylenimine)</td>
			<td style="width:160px;">poly sciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>&#160;2mg/mL concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Hanging bucket centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5805 000.017</td>
			<td>used for spin infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>used for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polybrene (hexadimethreen bromide)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Used to increase viral infection efficiency.&#160; Used at a 5&#181;g/mL concentration.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSAria</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for sorting cell populations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSCanto</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for cell analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phoenix-GP</td>
			<td style="width:160px;">Gift from Gary Nolan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell line used to produced retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:160px;">Mediatech</td>
			<td>MT35015CV&#160;</td>
			<td>used for cell growth and sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#160;SupT1 cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1942</td>
			<td>Human T lymphoblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>cell growth media for SupT1 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic barcoding with fluorescent proteins for multiplexed applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Çoğullama floresan genetik bireysel klonal popülasyonları üretilmiş olan sadece bir kere elde edilebilir biyolojik uygulamalarda amacıyla hücreler barkodlanmaktadır. Barkodlu popülasyonlar az spektral örtüşme net farklı floresan özelliklere sahip olduğunda Çoğullama en etkilidir. Memeli SupT1 hücrelerinin klonal popülasyonları, Şekil 1 &#39;de gösterilen örnek mCherry ve siyano floresan proteini (CFP) ile Barkodlanan hücreleri kolayca bireysel floresan özelliklerini kaybetmeden...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications at JoVE.com

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

genetic-barcoding-with-fluorescent-proteins-for-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Görüntüleme.  San Diego State University. Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications. 

Video: Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biyoloji

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Gaz Geçirgen Malzeme Teknolojisi HYPERStack gemiler Kapalı Sistem Hücre Kültürü Protokolü

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Toz numuneler mutlak Kuantum Verimi Ölçümü

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.