Yazarlar, José Luis Ramos-Balderas'a teknik desteği için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, CONACYT'den (fordecyt-pronace-303027) PLL'ye aşağıdaki hibe ile desteklenmiştir. OM-P ve EO-M, CONACIST'ten (sırasıyla 736162 ve 481437) bir burs aldı. MCM-M, CONACIST'ten burs aldı (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri, Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi, Hücresel Fizyoloji Enstitüsü'nün Hayvan Kullanımı İç Komitesi (CICUAL) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Tüm protokolün akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Farelerin muhafazası
<ol><li>12 saatlik aydınlık / karanlık döngülerde sabit sıcaklık ve neme sahip hayvan tesislerinde barındırılan, suya ve yiyeceğe libitum erişimi olan 8-10 haftalık, dişi veya erkek fare gruplarını kullanın. NOT: Bu protokol, daha önce açıklandığı gibi C57BL/6 arka planında IL-9 muhabir fare suşu kullanır4; Bununla birlikte, diğer IL-9 muhabir suşları 6,7,8 ve hücre içi IL-9 boyama ile değişken sonuçlar 9 kullanılabilir.</li>
</ol>2. Farelerin enfeksiyonu
<ol><li>Farelerin arkasını vücudun ortasından enfeksiyondan 1 gün önce kuyruğun tabanına yakın bir yere tıraş edin. Anestezik kullanımı gerekli değildir.</li>
	<li>Subkutan olarak her fareyi, daha önce tarif edildiği gibi, alt sırtta 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS)10'da 200 canlı üçüncü aşama N. brasiliensis larvası (L3) ile aşılayın veya kontrol olarak tek başına 100 μL PBS enjekte edin. Hayvanları enfeksiyon sonrası 4. gün, 7. gün veya 10. günde kurban edin.</li>
</ol>3. Akciğer, ince bağırsak, mediastinal ve mezenterik lenf nodlarının izolasyonu
<ol><li>Servikal çıkık ile fareyi ötenazileştirin. Fareyi sırtına yerleştirin ve% 70 etanol püskürtün. Makas kullanarak orta hat kesisi yapın ve karın ve torasik bölgeleri ortaya çıkarmak için cildi açın. NOT: İzofluran alternatif ötanazi yöntemi12 olarak kullanılabilir. CO2 akciğer dokusu hasarına ve kanamaya yol açtığı için karbondioksit odaları önerilmez13.</li>
	<li>Mediastinal lenf nodlarının ve akciğerlerin izolasyonu<ol><li>Sternumda bir kesi yapın ve kaburgaları ve torasik kasları çıkarmak için "V" şeklinde kesin. Torasik kavite açığa çıktıktan sonra, mediastinal lenf düğümlerini yemek borusunun yanında, kalbin altında bulun (bakınız Ek Şekil 1).</li>
		<li>Mediastinal lenf nodlarını çıkarın ve bunları 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamında (Tablo 1) toplayın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun. NOT: Bu deneylerde kullanılan muhabir farelerden gelen floresan sinyalinin azalmasını önlemek için numuneler ışıktan korunmalıdır.</li>
		<li>Akciğerleri çıkarın ve fare başına 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamında toplayın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Mezenterik lenf nodu zincirlerinin ve ince bağırsakların izolasyonu<ol><li>Peritoneal boşluğu açığa çıkarın ve kolon boyunca mezenterik lenf nodu (MLN) zincirini açığa çıkarmak için ince bağırsağı dikkatlice sağa hareket ettirin.</li>
		<li>Forseps kullanarak, MLN'yi çıkarın, bir kağıt havlu üzerinde yavaşça yuvarlayın ve yağı çekin.</li>
		<li>MLN'yi 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamına aktarın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
		<li>İnce bağırsağı pilor sfinkterin hemen altında ve çekumun üstünde kesin. Forseps yardımıyla bağırsağı yavaşça dışarı çekin, bağlı mezenter ve yağ dokusunu çıkarın.</li>
		<li>İnce bağırsağı bir kağıt havluya yerleştirin ve PBS ile cömertçe nemlendirin. Peyer'in yamalarını ince bağırsaktan makasla çıkarın. NOT: Canlılığı korumak için, kalan yağ dokusunu çıkarın ve tüm işlem boyunca PBS ile ince bağırsağı nemli tutun.</li>
		<li>İnce bağırsağı makas kullanarak uzunlamasına kesin ve dışkı içeriğini ve mukusları çıkarmak için forsepsleri açık bağırsak üzerinde yavaşça kaydırın.</li>
		<li>İnce bağırsağı forsepslerle tutun ve birkaç kez dikkatlice batırarak buz üzerinde 5 mL PBS içinde yıkayın. İki kez tekrarlayın.</li>
		<li>İnce bağırsağı kısa parçalara ayırın (yaklaşık 5 mm) ve% 2 FBS ile 10 mL HBSS14 içeren 50 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın (Tablo 1). Hemen intraepitelyal ve lamina propria hücrelerini izole etmeye devam edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. İnce bağırsak, akciğer ve lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonların hazırlanması
NOT: İnce bağırsaklardan tek hücreli süspansiyonlar hazırlarken kişi başına maksimum altı farenin işlenmesi son derece önemlidir, çünkü hücre canlılığı daha uzun işlem süreleriyle önemli ölçüde azalır. Bu yöntem Heligmosomoides polygyrus enfeksiyon faresi model5'ten uyarlanmıştır.
<ol><li>Sallanan inkübatör, R-20 ortam, HBSS ve HBSS-2 mM EDTA'yı (Tablo 1) 37 ° C'de önceden ısıtın.</li>
	<li>Örnek başına 10 mL ince bağırsak sindirim ortamı (Tablo 1) hazırlayın.</li>
	<li>Bağırsak parçalarını 3.3.8 adımından elle kuvvetlice sallayın.</li>
	<li>Her numuneyi bir cam huni üzerinde naylon bir ağdan (yaklaşık 10 cm x 10 cm) süzün. Numuneyi, ağın üzerine 10 mL önceden ısıtılmış HBSS ekleyerek yıkayın ve akışı atın. Bir kez daha tekrarlayın. NOT: Her numune için yeni bir ağ kullanın ve prosedür boyunca yeniden kullanın.</li>
	<li>Ağı huniden çıkarın ve numuneyi ağdan 10 mL sıcak HBSS-2 mM EDTA (adım 4.1) ile 50 mL konik bir tüp içinde toplayın. 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin, 200 rpm'de sallayın.</li>
	<li>Maksimum hızda (3.200 rpm) 10 s vorteks yapın ve numuneyi bir cam huni üzerinde ağ ile filtreleyerek akışı 50 mL konik bir tüpte geri kazanın.</li>
	<li>4,5 ve 4,6 numaralı adımları iki kez tekrarlayın ve aynı 50 mL konik tüpteki akışı geri kazanın. İntraepitelyal hücreler bu 30 mL fraksiyonda bulunur. Kalan dokuyu kaydedin.</li>
	<li>İntraepitel hücrelerinden tek hücreli süspansiyon hazırlığı<ol><li>4.7. adımda geri kazanılan 30 mL'lik hücre süspansiyonunu, oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı atın.</li>
		<li>RT'de 5 dakika boyunca 5 mL PBS ekleyin ve 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Hücre peletini 3 mL RPMI% 10 FBS-20 μg / mL DNaz içinde yeniden askıya alın (Tablo 1). Hücre lekelenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Lamina propria hücrelerinden tek hücreli süspansiyon hazırlığı<ol><li>Kalan ince bağırsak dokusunu, huni üzerindeki ağdan 10 mL'nin üzerine ılık HBSS dökerek adım 4.7'den yıkayın. Yıkamayı tekrarlayın. Dokuyu ağdan 10 mL ince bağırsak sindirim ortamı ile 50 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın.</li>
		<li>37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, 200 rpm'de sallayın. Her 5 dakikada bir 10 s maksimum hızda vorteks.</li>
		<li>Sindirim reaksiyonunu durdurmak için 10 mL FACS-EDTA tamponu ekleyin (Tablo 1) ve buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Her numuneyi serolojik bir pipet kullanarak 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve süspansiyonu buz üzerine yerleştirilmiş 50 mL'lik konik bir tüpte geri kazanın.</li>
		<li>4 °C'de 6 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süper natantı atın. Hücre peletini 5 mL PBS ile yıkayın ve 4 ° C'de 6 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 1 mL RPMI% 10 FBS-20 μg / mL DNaz içinde yeniden askıya alın. Hücre lekelenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Akciğerden tek hücreli süspansiyon hazırlığı NOT: Her akciğer ve ince bağırsak, uzun kullanım sürelerinden kaçınmak için iki kişi tarafından paralel olarak işlenmelidir, bu da düşük hücre canlılığına neden olur.<ol><li>İşlenen numune başına 4 mL akciğer sindirim ortamı (Tablo 1) hazırlayın.</li>
		<li>RPMI ortamını akciğerleri içeren kuyudan adım 3.2.3'ten çıkarın. Akciğeri ince makasla küçük parçalara ayırın.</li>
		<li>Akciğer parçalarını spatula ile 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 4 mL akciğer sindirim ortamı ekleyin (Tablo 1).</li>
		<li>37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, 250 rpm'de sallayın. İşiniz bittiğinde, her numune işlenene kadar buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Her numuneyi, 6 delikli bir kültür plakasının tek bir kuyucuğuna yerleştirilmiş 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. Dokuyu bir şırınga pistonu ile ayırın.</li>
		<li>Her numuneyi 15 mL'lik bir konik tüpte geri kazanın ve 4 mL R-2 ortamı ekleyin (Tablo 1). Diğer numuneler işlenirken buz üzerinde tutun.</li>
		<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL R-5 ortamında yeniden askıya alın (Tablo 1).</li>
		<li>Santrifüj yaparken, hematopoetik hücre fraksiyonu 15,16'yı zenginleştirmek için numune başına 4 mL% 27.5 yoğunluk-gradyan çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın. Tek hücreli ayırma stratejisi, diğer benzer yoğunluk gradyan ortamlarına kıyasla daha verimli, uygun maliyetli ve daha az toksiktir17.</li>
		<li>Adım 4.10.7'den itibaren 1 mL'lik hücre süspansiyonuna 4 mL% 27.5 yoğunluk gradyanı çözeltisi ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın.</li>
		<li>İki faz oluşturmak için karışık süspansiyonun üzerine yavaşça 1 mL R-5 ortamı (Tablo 1) ekleyin.</li>
		<li>RT'de 20 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj, düşük hızlanma ve fren kapalı. İki faz arasında oluşan halkayı gözlemleyin.</li>
		<li>İki faz arasında oluşan halkayı 1 mL mikropipet ile geri kazanın ve 4 mL R-2 ortamında yeniden askıya alın.</li>
		<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Süper natantı atın. Hücre peletini 1 mL ACK tamponunda (Tablo 1) yeniden askıya alın ve RT'de 1 dakika inkübe edin.</li>
		<li>4 mL R-5 orta ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun, akış sitometrisi için lekelenene kadar ışıktan koruyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyon preparatı<ol><li>Lenf düğümlerini 3.2.2 veya 3.3.3 adımlarından iki ağ parçası arasına 6 delikli bir kültür plakasından bir kuyucuk içine yerleştirin ve bir şırınga pistonu ile ayrışın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir konik tüpte geri kazanın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 1 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun, akış sitometrisi için lekelenene kadar ışıktan koruyun. NOT: Kümeler görülebiliyorsa, numuneyi 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Akım sitometrisi için hücre boyama (Şekil 2 ve Şekil 3)
NOT: Lenf nodu hücre süspansiyonlarını 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de 4.11.3 adımından santrifüj edin ve hücre peletini 500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın (Tablo 1).
<ol><li>ILC2'lerin tanımlanması için hücre boyama (Şekil 3 ve Ek Şekil 2) NOT: Bu boyama prosedürü, IL-9 eksprese eden ILC2 hücrelerinin tanımlanması için spesifiktir.<ol><li>Adım 4.10.14'ten akciğer örneği başına plaka 150 μL (yaklaşık 1.8 x 10 6 hücre) ve 4.11.3 adımından itibaren lenf nodu örneği başına 50 μL (sırasıyla mediastinalve mezenterik lenf nodu örnekleri için yaklaşık 0.7 x 10 6 ve 2.2 x 106 hücre) 96 kuyucuklu konik alt kültür plakasında. 100 μL FACS tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>İnce bağırsak numunesi başına plaka 100 μL (intraepitelyal ve lamina propria örnekleri için sırasıyla yaklaşık 2.7 x 10 6 ve 0.6 x 10 6 hücre)96 kuyucuklu bir konik alt kültür plakasında 4.8.3ve 4.9.7 adımlarından. 150 μL FACS tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatanı atın ve her hücre peletini FACS tamponunda seyreltilmiş biyotinile antikor kokteylinin 50 μL'sinde (Tablo 2) yeniden askıya alın. Işıktan korunan 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. NOT: İntraepitelyal ve lamina propria numuneleri için 20 μg/mL DNaz içeren FACS tamponu kullanın.</li>
		<li>150 μL FACS tamponu ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatarı atın.</li>
		<li>Hücre peletini antikor/leke kokteylinin 50 μL'sinde yeniden askıya alın (Tablo 2) ve ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>150 μL FACS tamponu ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatarı atın. Yıkamayı tekrarlayın (adım 5.1.7) ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Hücre peletini 300 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile analiz edin.</li>
		<li>İnce bağırsak ve akciğer örnekleri için geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, hematopoetik hücreler, CD90 + Soy hücreleri, ST2 + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 3A, B ve Ek Şekil 2A). Lenf nodu örnekleri için geçit stratejisini kullanın: canlı hücreler, tek hücreler, CD90 + Soy hücreleri, ST2 + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Ek Şekil 2B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>IL-9 üreten lenfositlerin tanımlanması için hücre boyama (Şekil 2 ve Ek Şekil 3)<ol><li>Akciğer örneği başına 800 μL'yi adım 4.10.14'ten 1.5 mL'lik bir tüpe (yaklaşık 14.6 x 106 hücre) aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Süper natantı atın.</li>
		<li>Lenf nodu örnekleri için, 4.11.3 adımından itibaren hücre süspansiyonunun 400 μL'lik plakası (mediastinal ve mezenterik lenf nodu örnekleri için sırasıyla yaklaşık 5.6 x 10 6ve 17.5 x 106 hücre) iki adımda 96 kuyucuklu konik bir alt plakada.<ol><li>Önce 200 μL aktarın, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
			<li>İlgili kuyuya 200 μL daha aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
		</ol></li>
		<li>Hücre peletini antikor/leke kokteylinin 50-400 μL'sinde yeniden askıya alın (Tablo 3) ve ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. NOT: Akciğer örnekleri 400 μL'de, mediastinal lenf nodu örnekleri 50 μL'de ve mezenterik lenf nodu örnekleri boyama kokteylinin 100 μL'sinde yeniden askıya alınmalıdır.</li>
		<li>Mediastinal lenf nodu örneklerine 150 μL FACS tamponu ve mezenterik lenf nodu örneklerine 100 μL ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Akciğer ve lenf nodu örneklerini, peletleri sırasıyla 1 mL ve 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alarak yıkayın. 4 °C'de 5dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Supernatant'ı atın ve yıkamayı tekrarlayın.</li>
		<li>Akciğer örneklerini 600 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve bunları akış sitometrisi ile analiz edin. Geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, hematopoetik hücreler, CD4 + TCRβ + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 2A).</li>
		<li>Lenf nodu örneklerini 300 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile analiz edin. Geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, CD4 + TCRβ + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 2B ve Ek Şekil 3A).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Tek hücreli süspansiyonlarda mutlak hücre sayısının belirlenmesi
<ol><li>4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 ve 4.11.3 numaralı izolasyon adımlarından alınan numuneleri PBS ile 1:20 oranında (10 μL numune + 190 μL PBS) seyreltin.</li>
	<li>Adım 6.1'den itibaren seyreltilmiş her numunenin 10 μL'sini 10 μL Tripan Mavisi ile karıştırın. Bir hemositometreye 10 μL yükleyin ve her seyreltmeyi göz önünde bulundurarak canlı hücreleri sayın.</li>
	<li>Akış sitometrisi (canlılık boyası negatif hücreleri) ile belirlenen canlı hücrelerden gelen ilgili popülasyonun yüzdesini, izolasyondan sonra tek hücreli süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısıyla çarparak ve bu sayıyı 100'e bölerek mutlak hücre sayılarını elde edin (Ek Şekil 4, Ek Şekil 5 ve Ek Şekil 6). Mutlak sayı = (Akış sitometrisi ile belirlenen canlı hücrelerden gelen ilgi popülasyonunun yüzdesi x Tek hücreli süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısı)/100</li>
</ol>

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasites - Hookworm. , (2022).</li><li>Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+of+Nippostrongylus+brasiliensis+and+Heligmosomoides+polygyrus.">Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Mearns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4-promoted+T+helper+2+responses+enhance+Nippostrongylus+brasiliensis-induced+pulmonary+pathology.">Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology.</a> Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).</li><li>Licona-Limon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th9+cells+drive+host+immunity+against+gastrointestinal+worm+infection.">Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection.</a> Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).</li><li>Ferrer-Font, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+intestinal+immune+cells+during+helminth+infection.">High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection.</a> Elife. 9, 51678 (2020).</li><li>Kharwadkar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+efficiency+of+multiple+IL9+reporter+alleles+Is+determined+by+cell+lineage.">Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage.</a> Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).</li><li>Wilhelm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+IL-9+fate+reporter+demonstrates+the+induction+of+an+innate+IL-9+response+in+lung+inflammation.">An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).</li><li>Gerlach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH9+cells+that+express+the+transcription+factor+PU.1+drive+T+cell-mediated+colitis+via+IL-9+receptor+signaling+in+intestinal+epithelial+cells.">TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).</li><li>Olson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+IL-2+is+required+for+optimal+type+2+effector+cytokine+production.">Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate-buffered+saline+(PBS).">Phosphate-buffered saline (PBS).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).</li><li>Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th9+cells+and+parasitic+inflammation:+Use+of+Nippostrongylus+and+Schistosoma+models.">Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models.</a> Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).</li><li>Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+isoflurane+and+CO2+inhalation+on+plasma+levels+of+inflammatory+markers+associated+with+collagen-induced+arthritis+in+DBA+mice.">Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice.</a> International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).</li><li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic,+behavioral,+and+histologic+responses+to+various+euthanasia+methods+in+C57BL/6Ntac+male+mice.">Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).</li><li>old Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hank's+balanced+salt+solution+(HBSS)+without+phenol+red.">Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).</li><li>Bielecki, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-resident+innate+lymphoid+cells+converge+on+a+pathogenic+effector+state.">Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state.</a> Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).</li><li>Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+effects+of+TGF-beta+and+IL-15+cytokines+control+the+number+of+short-lived+effector+CD8++T+cells.">Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells.</a> Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).</li><li>Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single-cell+encapsulation+efficiency+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspension.">Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension.</a> Micromachines. 11 (1), 94 (2020).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-25-responsive,+lineage-negative+KLRG1(hi)+cells+are+multipotential+'inflammatory'+type+2+innate+lymphoid+cells.">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S1P-dependent+interorgan+trafficking+of+group+2+innate+lymphoid+cells+supports+host+defense.">S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense.</a> Science. 359 (6371), 114-119 (2018).</li><li>Flamar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-33+induces+the+enzyme+Tryptophan+hydroxylase+1+to+promote+inflammatory+group+2+innate+lymphoid+cell-mediated+immunity.">Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity.</a> Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).</li><li>Olgu&#237;n-Mart&#237;nez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-33+and+the+PKA+pathway+regulate+ILC2+populations+expressing+IL-9+and+ST2.">IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2.</a> Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).</li><li>Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+molecular+markers+and+heterogeneity+in+type+2+innate+lymphoid+cells.">Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells.</a> Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).</li><li>Noelle, R. J., Nowark, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+sources+and+immune+functions+of+interleukin-9.">Cellular sources and immune functions of interleukin-9.</a> Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

İntestinal parazit-konakçı etkileşimlerinin ve helmint enfeksiyonuna karşı immün yanıtların tam olarak anlaşılması, doku yeniden şekillenmesi ve solucan kovulmasının indüksiyonu için anahtar olan farklı hücre popülasyonlarının ve efektör moleküllerinin tanımlanmasını ve analiz edilmesini gerektirir. Topraktan bulaşan helmint enfeksiyonları, dünyadaki gelişmekte olan ülkelerde büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bununla birlikte, yakın zamana kadar, bu enfeksiyondan etkilenen ana organ o...

Kancalı kurtlar, çoğunlukla az gelişmiş ülkelerdeki tropikal bölgelerde, dünya çapında yaklaşık 700 milyon insanı enfekte eden bağırsak parazitleridir. İnsanlarda en sık görülen kancalı kurt parazitleri olan Ancylostoma duodenale ve Necator americanus ile yüksek yoğunluklu enfeksiyonlar, gecikmiş büyüme ve zihinsel gelişime neden olabilecek anemi ve proteineksikliğine neden olur 1. N. americanus ve kemirgen paraziti Nippostrongylus brasiliensis, konakçılarında prototipik bir tip 2 immün yanıtı indükler ve yaşam döngülerinde benzerlikleri paylaşırlar. Bu nedenle, farelerin N. brasiliensis ile enfeksiyonu, insan kancalı kurt enfeksiyonları için en yaygın kullanılan modeldir. Evre 3 (L3) N. brasiliensis enfektif larvaları, enfeksiyondan sonraki ilk birkaç saat içinde deriden akciğere hareket eder. Akciğere girdikten sonra, L4 olurlar ve yutulmak, mideden geçmek ve 4-5 gün içinde yetişkin olmak için bağırsağa ulaşmak için trakeadan yukarı göç ederler (L5). Bağırsakta, L5 solucanları, parazit yaşam döngüsünü2 yeniden başlatmak için dışkıda atılan yumurtaları bırakır.
N. brasiliensis tarafından indüklenen immün yanıt, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 ve IL-13 dahil olmak üzere çeşitli tip 2 sitokinlerde bir artışın yanı sıra eozinofili, bazofili, kadeh ve mast hücresi hiperplazisi ve artmış IgG1 ve IgE üretimi ile karakterizedir. N. brasiliensis enfeksiyonu üzerine ortaya çıkan immün yanıtları tanımlamaya ve tanımlamaya çalışan çalışmaların çoğu, IL-4 veya IL-13'ün bu model3'teki rolüne odaklanmıştır. Bununla birlikte, IL-9 eksprese eden hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu ve bu sitokinin işlevi, Licona-Limón ve ark., IL-9'un N. brasiliensis'e karşı bağışıklık tepkisinde kritik bir rol oynadığını gösteren ilk çalışmayı yayınlayana kadar büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Muhabir fareleri kullanan bu çalışma, T hücrelerini (çoğunlukla T yardımcı 9) ve tip 2 doğuştan gelen lenfoid hücreleri (ILC2'ler), enfeksiyon4 üzerine IL-9'u eksprese eden ana hücresel alt kümeler olarak tanımlamıştır.
Helmint ile enfekte akciğerlerden immün hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu mümkündür ve kapsamlı bir şekilde rapor edilmiştir 3,4. Bununla birlikte, doğal doku yeniden şekillenmesi ve mukus üretimi nedeniyle, Ferrer-Font ve ark.5'in yakın zamanda yayınlanmasına kadar, enfekte bağırsakta bunu yapmanın teknik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır. Grup, Heligmosomoides poligyrus ile enfekte murin bağırsaklarından immün alt kümelerin tek hücreli süspansiyonlarını izole etmek ve analiz etmek için bir protokol özetledi. Buna dayanarak, şimdi N. brasiliensis ile enfekte olmuş bağırsaktan IL-9 eksprese eden lenfoid hücrelerin izolasyonu ve sitometrik analizi için bir protokol standartlaştırdık. Ek olarak, enfeksiyon boyunca farklı hücresel kaynaklardan ve anatomik konumlardan IL-9 kinetiği oluşturduk.
Bu enfeksiyonda yer alan farklı hücre popülasyonlarını karakterize etmek, parazite karşı bağışıklık tepkisinin ve konakçı ile etkileşiminin daha geniş bir şekilde anlaşılması için hayati öneme sahiptir. Bu kapsamlı protokol, IL-9 üreten hücreleri ilgilenilen hastalık aşamalarında istenen organlardan izole etmek ve analiz etmek için net bir yol sağlar ve bu hücrelerin N. brasiliensis enfeksiyonu ve genel olarak parazit enfeksiyonlarındaki rolü hakkındaki bilgilerin keskin bir şekilde iyileştirilmesini sağlar.

<table><tbody><tr><td>ACK buffer</td><td>Homemade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attune Nxt cytometer</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>CD11c&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td></td></tr><tr><td>CD19&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>CD4 (BV421)</td><td>Biolegend</td><td>100443</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2</td><td>Biolegend</td><td>109846</td><td></td></tr><tr><td>CD8&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>100703</td><td></td></tr><tr><td>CD90.2</td><td>Biolegend</td><td>105314</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td>Specific activity: &amp;ge;10 000 units/mg&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Facs ARIA II sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Melody cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc-Block</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>Fc&amp;epsilon;RI</td><td>eBioscience</td><td>13589885</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td></td><td>Flow cytometry analysis data software</td></tr><tr><td>Gr-1</td><td>Tonbo</td><td>305931</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Homemade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-9</td><td>biolegend</td><td>514103</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>108704</td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh</td><td>&amp;nbsp;&amp;lrm; lba</td><td>B07HYHHX5V</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Homemade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Siglec F&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>155512</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Biolegend</td><td>405206</td><td></td></tr><tr><td>TCR-&amp;beta;&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>109203</td><td></td></tr><tr><td>TCR-&amp;beta; (PE/Cy7)</td><td>Biolegend</td><td>109222</td><td></td></tr><tr><td>TCR-&amp;gamma;&amp;delta;&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td></td></tr><tr><td>Ter119</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Tricine buffer&amp;nbsp;</td><td>Homemade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability Dye</td><td>Biolegend</td><td>423101</td><td></td></tr></tbody></table>

a strategy for the study of il-9-producing lymphoid cells in the nippostrongylus brasiliensis infection model

IL-9, antitümör bağışıklığı, alerjik patolojilerin indüklenmesi ve parazitin atılmasında önemli bir rol oynadığı helmint enfeksiyonlarına karşı bağışıklık tepkisi dahil olmak üzere çeşitli süreçlerle ilişkili pleiotropik bir sitokindir. Nippostrongylus brasiliensis enfeksiyonunun murin modelinde, IL-9 esas olarak CD4 + T lenfositleri ve akciğer, ince bağırsak ve drenaj lenf düğümlerinde bulunan doğuştan gelen lenfoid hücreler tarafından üretilir. IL-9'un hücre içi boyanmasında yer alan teknik zorlukların yanı sıra hematopoetik hücrelerin enfeksiyon üzerine ince bağırsaktan izole edilmesinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, bu modelde farklı lenfoid ve lenfoid olmayan dokularda IL-9 ekspresyonunu analiz etmek için kapsamlı ama basit bir protokole acil bir ihtiyaç vardır. Burada tarif edilen protokol, CD4 + T hücreleri tarafından üretilen IL-9'un kinetiğini ve enfeksiyon boyunca N. brasiliensis tarafından hedeflenen ana organlar olan akciğer ve ince bağırsaktaki doğuştan gelen lenfoid hücrelerin, ayrıca mediastinal ve mezenterik lenf düğümlerinin ana hatlarını çizmektedir. Ek olarak, hücre tipine ve ilgilenilen organa bağlı olarak enfeksiyon için gerekli larva sayısını detaylandırır. Bu protokol, N. brasiliensis enfeksiyon modelinde ilgi çekici spesifik hücrelere, organlara ve hastalık aşamalarına odaklanma fırsatı sunarak zamandan ve kaynaklardan tasarruf etmek için tahlillerin standardizasyonuna yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

Farelere deri altından 200 L3 evre N. brasiliensis larvası veya sahte kontroller için PBS enjekte edildi. Bu protokolde kullanılan larva sayısı, canlı hücreleri akciğerlerden, lenfoid dokudan ve ince bağırsaktan izole etmek için ayarlandı, lenfoid dokulardaki ve akciğerlerdeki hücreleri tespit etmek için daha yüksek solucan yüklerinin kullanıldığı önceki raporların aksine, sadece4. Akciğerler, mediastinal lenf nodları, mezenterik lenf nodları ve ince bağırsak,...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model at JoVE.com

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 eksprese eden T ve ILC2 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında indüklenir, ancak düşük frekansları ve diferansiyel kinetik olmaları nedeniyle enfekte bağırsakta karakterizasyonları büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Bu protokol, bu hücrelerin farklı hedef organlardan izole edilmesini ve farklı enfeksiyon aşamalarında akış sitometrisi yoluyla kimliklerinin doğrulanmasını açıklar.

Nippostrongylus brasiliensis Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

a-strategy-for-study-il-9-producing-lymphoid-cells-nippostrongylus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

1.3K Görüntüleme.  Universidad Nacional Autónoma de México. IL-9 eksprese eden T ve ILC2 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında indüklenir, ancak düşük frekansları ve diferansiyel kinetik olmaları nedeniyle enfekte bağırsakta karakterizasyonları büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Bu protokol, bu hücrelerin farklı hedef organlardan izole edilmesini ve farklı enfeksiyon aşamalarında akış sitometrisi yoluyla kimliklerinin doğrulanmasını açıklar.

Video: A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

Gelen Yumurta kullanma<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Bir şekilde<em&gt; In vivo</emHelmint bağlı Akciğer iltihabı ve&gt; Model

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Deneysel Enfeksiyon<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Ana İnterferon-γ Yanıtları incelenmesi için Bir Model Olarak

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Listeria monocytogenes enfeksiyonu sonrasında Mouse dalağında In situ Interferon gama üretiminin görüntülenmesi

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

CD226 Ekspresyonunu Saptamak için Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin Fare Burun Mukozasından İzolasyonu

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Nippostrongylus brasiliensis Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Gelen Yumurta kullanma

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu

Deneysel Enfeksiyon

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli

Listeria monocytogenes enfeksiyonu sonrasında Mouse dalağında In situ Interferon gama üretiminin görüntülenmesi

CD226 Ekspresyonunu Saptamak için Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin Fare Burun Mukozasından İzolasyonu

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi