Bu çalışma, Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri R01HL105826 ve K02HL114749 (Dr Sadayappan) ve Amerikan Kalp Derneği Midwest Arkadaş grupları tarafından finanse edildi; 11PRE7240022 (Bay Barefield) ve 13POST14720024 (Dr Govindan). Yazarlar minnetle tahlil gelişmekte olan kendi mükemmel teknik ve edebiyat destek için Dr Jimmy Page, Jill Clampit ve Dr John Hudson, MSD, yardımı kabul.

1. UNIPLEX cMyBP-C Testi <ol><li> Yakalama antikor ile deney, kat 96-MSD çıplak standart plaka önceki gün. CMyBP-C, 5 mg / fosfat içinde seyreltilmiş ml &#39;lik bir konsantrasyonda, fare monoklonal anti-cMyBP-C antikoru (jelatin serbest) bir 30 ul hacim kullanımı salin (PBS) tamponlu. </li><li> Iyi hidrofobik olduğu için, kuyunun dibinde köşeye çözüm pipetle, daha sonra tüm aşkın çözüm yaymak için plaka yanlarına dokunun. </li><li> Plaka plaka örtücü ile kaplı ve sallayarak olmadan 4 ° C&#39;de O / N inkübe edilir. </li><li> Bir lavabonun üzerinde ve sonra kağıt havlu bir yığın çözüm dokunarak yakalama antikor çözüm çıkarın. Plakasına Spesifik olmayan bağlanma,% 5 (w / v) engelleyici her oyuğa PBS içinde bir (yüksek dereceli BSA) çözeltisi 150 ul ilave edilerek bloke edilmiştir. </li><li> 700 rpm&#39;de çalkalayarak, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe plakası ve Seal. </li><li> Bloke adım sırasında, standart hazırlama ve Sdepas&#39;lar. 1% 2.000 ng / ml (k / h) engelleyici bir PBS / bir başlangıç ​​konsantrasyonuna - Rekombinant cMyBP-C protein parçası (271 amino asit 1) seyreltilmesi ile standart seri olun. Daha sonra seri olarak% 1 (w / v) &#39;engelleyici ° C&#39;de PBS / 5 oranında seyreltilir. 7 standartları toplam + 1 boş (% 1 (w / v) &#39;engelleyici A / PBS) kullanılmıştır. </li><li> Bloke etme çözeltisi uzaklaştırılır ve 150 ul% 0.05 (v / v) ile 3 kez Tween-20/PBS plaka yıkayın. Her zaman, bir lavabo üzerinde ters plaka ile yıkama solüsyonu çıkarın. Üçüncü yıkama adımdan sonra, şiddetle bir lavabonun üzerinde plaka fiske ve tamamen kuruyana kadar kağıt havlu tabakası üzerinde şiddetle plaka pat. Kuluçka hacimleri küçük gibi bu, çok önemli bir adımdır, ve kalan yıkama solüsyonu önemli ölçüde bir sonraki kuluçka sulandırmak olur. </li><li> Kuyulara standartlar ve numuneler bir pipetle 25 ul. 1 saat boyunca 700 rpm&#39;de çalkalayarak, oda sıcaklığında plaka ve inkübe Seal. </li><li> % 1 engelleyici / PBS içinde 1 ug / ml &#39;de tespit antikor çözeltisi hazırlayın. Bir CuMSD sülfo-TAG etiketleme algılama antikoru olarak hizmet ile - zel cMyBP-C antikoru (14 epitop amino asitler 2) yapılmıştır. Kitler, herhangi bir antikor etiketlemek için nispeten basit bir işlem yapmak, sülfo-TAG etiketleme için kullanılabilir. </li><li> , Adım 1.4 &#39;de tarif edilen yıkama adımı tekrar edin. </li><li> Her kuyucuğa algılama antikor çözeltisi 25 ul ekle çalkalayıcı 700 rpm&#39;de bir plaka üzerine, 1 saat boyunca oda sıcaklığında ve plaka ve inkübe mühür. </li><li> Kuluçka döneminde, Sektör Görüntüleyici ve yazılım (Reaktif bölüm bakınız) uygun çalışmasını sağlamak için MSD demo-levha (LED ışıkları ile plaka) çalıştırın. Aynı zamanda, 15 ml distile su ile 4x salt tampon 5 ml eklenerek MSD tarafından sağlanan salt tampon, seyreltin. </li><li> , Adım 1.4 &#39;de tarif edilen yıkama adımı tekrar edin. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak her bir kuyunun salt tampon 150 ul ekleyin. Hava kabarcıkları (ters pipetleme uygun bir yöntemdir) önlemek için emin olun. Salt tamponu ilave edildikten sonra hemen Sektördeki plaka taramaGörüntüleyici. </li></ol> 2. 3-karmaşık cMyBP-C, CK-MB ve cTnI Testi <ol><li> 96 oyuklu bir plaka 3-Plex ve bir seyreltici solüsyonların kullanımı daha önce oda sıcaklığına kadar denge sağlaması için izin verilmiştir. Bu plaka MSD tarafından cMyBP-C, CK-MB ve cTnI için yakalama antikorlar ile ön kaplı. </li><li> % 1 (w / v) &#39;engelleyici her bir A / PBS içinde 25 ul ekle. Tüm iyi çözüm kapalı olduğundan emin olmak için plaka yanlarına dokunun. </li><li> Bir tabak mühürleyen ile plaka mühür, bir plaka çalkalayıcı plaka yerleştirin ve 30 dakika için 700 rpm&#39;de sallayın. </li><li> Bu arada, bireysel kalibratörlerin bir seyreltme serisi hazırlanır. Her iyi üç yakalama antikorlar olduğu için üç kalibratör karışık olması ve seri olarak kullanılmadan önce seyreltilmiş gerekir. 2.000 ng / ml &#39;cMyBP-C, 100 ng / ml&#39; si ile bir örnek oluşturmak için% 1 birlikte yeniden birleştirici cMyBP-C, CK-MB (MSD) ve cTnl (MSD) (w / v) &#39;engelleyici A / PBS ile seyreltilir CK- MB ve 25 ng / ml cTnI (örnek A). </li><li> En az 100 ul son hacim, her bir standart için hazırlanmıştır. KarşıStandart seri tamamlamak, seri örneklerin 5 kat olan sulandırmak. Örnek, 25 ul kullanarak bir 100 ul% 1 (w / v) &#39;engelleyici örnek oluşturmak C için 100 ul% 1 (w / v)&#39; engelleyici A / PBS içinde örnek B 25 ul kullanımı, daha sonra örnek B&#39;yi oluşturmak için A / PBS içinde ve benzeri. MI ile 16 konu ve 16 kontrol grubu insan serum örneklerinde cMyBP-C, CK-MB ve cTnI düzeylerini ölçmek için kullanıldı. Bu örnekler,% 1 (w / v) &#39;engelleyici A / PBS içinde 2x seyreltilmiştir. </li><li> 3-Plex plaka gözenekleri içinde zaten mevcut olan 25 ul standart ve seyreltilmiş numune, 25 ul ekle. Ayrıca, boş (sadece seyreltici) dahil edilmesi önemlidir. Tekniğin kurmak için, numuneler teknik üçlü olarak yüklenir. Aksi takdirde, çiftleri yeterlidir. </li><li> Tekrar plaka Seal (plaka örtücü yeniden kullanılabilir) ve 2 saat oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcı (700 rpm) üzerinde kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Kuluçka tamamlandıktan hemen sonra, algılama antikoru çözeltisi hazırlanır. Kullanılan seyreltici, PBS içinde% 1 (w / v) &#39;engelleyici. Tüm thrEE sülfo-etiketli antikorlar tespit 1 ug / ml her biri bir son konsantrasyon halinde bir araya seyreltilir. Algılama antikorlar tipik bir 50x stok konsantrasyonu sağlanır. </li><li> Tam 96 oyuklu plaka için, toplam seyreltik çözeltinin 2.700 ul (hata dahil pipetleme ile) gereklidir. 2.538 ul% 1 (w / v) &#39;engelleyici bir PBS / her bir algılama antikoru 54 ul ekle. </li><li> 2 saat sonra, şiddetle bir lavabo üzerinde plaka hafifçe vurarak çözümler çıkarın. PBS içinde% 0.05 Tween-20 150 ul ile kuyu 3x yıkayın. Algılama antikor çözeltisi 25 ul her bir çok kanallı bir pipet kullanarak, ve plaka iki tüm iyi çözelti ile kapalı olduğundan emin olmak için aday edilir. </li><li> Plaka sızdırmaz ve 700 rpm&#39;de çalkalayarak, 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Kuluçka döneminde, Sektör Görüntüleyici ve yazılım düzgün çalışmasını sağlamak için MSD demo-levha (LED ışıkları ile plaka) çalıştırın. Ayrıca 4x oku-5 ml eklenerek MSD tarafından sağlanan salt tampon, seyreltik15 ml distile su için tampon. </li><li> Adım 2.8 &#39;de tarif edilen yıkama adımı tekrar edin. </li><li> De, çok kanallı bir pipet kullanarak her bir salt tampon 150 ul ekleyin. Hava kabarcıkları kaçınmak önemlidir (ters pipetleme uygun bir yöntemdir). Salt tamponu ilave edildikten sonra hemen Sektör Imager plaka tarama. </li></ol>

<ol>
	<li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third+universal+definition+of+myocardial+infarction.">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li><li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research.">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li><li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains.">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li><li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+measurement:+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays.">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li><li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis.">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li><li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction.">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).</li><li>Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiplex+immunoassay+platforms.">Comparison of multiplex immunoassay platforms.</a> Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).</li><li>Mahajan, V. S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels.">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li><li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction.">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li><li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease.">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li><li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease.">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li><li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+redefining+its+structure+and+function.">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li><li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+a+potential+early-stage,+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury.">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid:+a+multicenter+study.">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li><li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases.">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li></ol>

İnsan vücut sıvısı içine cMyBP-C bozulması ve serbest bırakılması ile ilişkili risk faktörleri belirlemek için: Tam patent başvurusu (05/04/12. Başvuru Seri 13 No&#39;lu / 464, 466, Birahane No US 2012 / 0.282.618 A1 ve tarihi) beklemede ve insan vücut sıvısında cMyBP-C düzeyini nicelendirmek.

Bu çalışmada, hastalarda serum birden fazla kardiyak biyolojik tespiti için bir multipleks immunoassay uygulanabilirliğini göstermektedir. Bu teknik, geleneksel ELISA üzerinde birçok avantajı vardır. İlk olarak, test kiti ECL kolorimetrik tespit yerine kullanılır. ECL olarak, bir elektrik sinyali 14 azaltır, böylece arka plan sinyali, ikinci uyarım durumunda ayrılmasının, ölçülen özelliği (ışık) yerel üretimini uyarır. Bu durum, Tablo 2&#39;de de görülebileceği...

Örneğin, serum gibi karmaşık biyolojik örnekler, protein düşük miktarda ölçümü hasta yönetimi, hem de temel bilim için artan bir klinik önem taşımaktadır. Örneğin, bir klinik ortamda bu troponin I gibi kardiyak biyolojik serum, artış akut miyokard infarktüsü (Mİ) 1 ile tutarlıdır. Bu yüksek hassasiyete sahiptir ve analit ölçümü için mutlak izin verdiği serum örneklerinde proteinleri saptamak için, standart bir enzim-linked immunosorbent assay (ELISA), en sık kullanılan bir tekniktir. Ancak, geleneksel ELISA, örneğin nispeten büyük miktarda (tipik olarak 100 ul) gerektiren bazı biyolojik akışkanlar içinde yüksek bir arka plan sinyali, ve ELISA 2 başına sadece bir analit ölçümü ile sınırlıdır. Son zamanlarda, yeni bir immunoassay tekniği bu sakıncaları birçok circumvents geçilmiştir. Bu modifiye tahlil, MSD tarafından geliştirilen, electrochemiluminesc kullanırKüçük bir numune hacimlerinin kullanımını mümkün kılmak için çok düşük arka plan ve artan bir hassasiyet sağlayan sinyal tespiti için etkisiyle (ECL). Elektro algılama antikorlara bağlı raportör molekülün rutenyum (II) &#39;trisbipyridal esas alınmaktadır. Bu, raportör molekülün bunları 3 entegre karbon elektrot olan 96-kuyulu plakanın alt elektriksel stimülasyonu üzerine 620 nm&#39;de ışık yayar. Ayrıca, spot kaplama kullanılarak, birden çok yakalama antikorları, tek bir örnek 4, farklı proteinlerinin aynı anda ölçümü sağlayan, iyi bir (en fazla 10, 96 oyuklu plaka) halinde kaplanabilir. Bu teknik en son serum 5,6 proinflamatuar sitokin profilleri ölçmek için kullanılmıştır. MSD gelen çok katlı levhalar olumlu diğer çok katlı testi platformlara 7 karşılaştırmak. Birincil test platformu olarak MSD kullanarak, daha fazla 3-karmaşık plaka yapılmış bir özel geliştirilen cbir anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C (cMyBP-C), kreatin-kinaz MB (CK-MB) ve kardiyak troponin I (cTnI) seviyesini ölçmek ve sonuçları cMyBP-C Monoplex tespiti ile karşılaştırıldı. CK-MB ve cTnI MI için köklü biyolojik bulunmaktadır. Ancak bu biyolojik artışlar örneğin miyokardit veya böbrek yetmezliği 8, MI dışındaki patolojiler neden olabilir. Bu MI tanı özgünlüğünü artırmak için ek biyolojik eklenmesi için savunuyor. Son zamanlarda cMyBP-C de mi 9 için potansiyel bir biyolojik olduğunu göstermiştir. cMyBP-C kalp, iskelet veya değil, düz kaslarda, 10-12 olarak ifade edilir, kalın filaman ilişkili bir proteindir. Bu nedenle, kan dolaşım sistemi içinde cMyBP-C artan seviyesi kalp hasarı 13 belirli bir göstergesidir. Bu çalışmada, serum seviyelerinin ölçülmesi için özel bir 3-Plex tahlilin kullanımı ile cMyBP-C UNIPLEX tespiti görecMyBP-C, CK-MB ve MI hastaların serum cTnI. Gelecekte, bu imza teknik acil serviste göğüs ağrısı ile başvuran hastalarda MI teşhis etmek için kullanılabilir. Loyola University Chicago kurumu inceleme kurulu (KİK) deidentified insan örneklerinin kullanımı ve immunoassay ve kullanımı (LU # 20392) için çalışmayı onayladı.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R92TC-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R93BA-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-137180L</td>
			<td>For coating, antibody has to be gelatin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plates and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well standard plate</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>L15XA-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>N452A-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermaSeal Sealing Film</td>
			<td>Life Science Products Inc.</td>
			<td>ST-3098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3208001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

Biyolojik hem de temel bilim, karar verme klinik giderek daha önemli hale gelmektedir. Teşhis miyokard infarktüsü (Mİ) büyük ölçüde miyokard hasarının bir göstergesi olarak hastaların serum veya plazma kardiyak-spesifik proteinlerin tespit ile tahrik edilir. Son zamanlarda kardiyak miyosin bağlayıcı protein-C (cMyBP-C), MI sonrası serum içinde tespit olduğunu göstermiştir, biz MI için potansiyel bir biyolojik olarak önerilmiştir. Biyolojik genellikle geleneksel sandviç enzim-bağlı immünosorbent testleri ile tespit edilir. Ancak, bu teknik, büyük bir örnek hacmi gerektiren küçük bir dinamik aralık vardır ve bir seferde sadece bir protein ölçebilirsiniz. Burada üç kalp proteinler yüksek hassasiyet ile eş zamanlı olarak ölçülebilir hangi çok katlı bir bağışıklık göstermektedir. Kreatin kinaz MB ve kardiyak troponin ile UNIPLEX veya birlikte cMyBP-C Ölçüm ben karşılaştırılabilir duyarlılık gösterdi. Bu teknik Mezo Ölçeği Discovery kullanırTespiti için elektro ile birlikte bir 96 oyuklu plaka çoğullama (MSD) yöntemi. Sadece küçük bir örnek hacimleri gerekli iken, yüksek hassasiyet ve geniş dinamik aralık elde edilir. Bu tekniği kullanarak, cMyBP-C, kreatin kinaz MB ve kardiyak troponin MI ile 16 denekten serum örneklerinde Ben düzeyleri ölçüldü ve 16 kontrol grubu ile sonuçlar karşılaştırıldı. Biz bu örnekleri her üç işaretleri tespit başardık ve MI sonrası artmış olduğu üç biyolojik bulundu. Bu teknik, bu nedenle, serum numuneleri kalp biyolojik arasında hassas bir şekilde tespit uygundur.

3-Plex tahlilinin temel ilkeler ve akışı Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir ve genel akışı Tablo 1&#39; de tarif edilmektedir. UNIPLEX deneyleri tüm alt iyi bir yakalama antikor ile kaplı olması dışında aynı prensip boyunca çalışır. Sinyal algılama bir elektrik sinyali kuyunun dibine uygulandığı ECL yapılır. Bu da, algılama antikoru üzerindeki sülfo-etiketi ile salt tampon, bir kimyasal reaksiyon yoluyla bir ışık yerel üretimini başlatır....

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay at JoVE.com

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

a-sensitive-specific-quantitation-method-for-determination-serum

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Görüntüleme.  Loyola University Chicago. Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.

Video: A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Biyoloji

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within the brain, ascorbate acts in a neuroprotective and neuromodulatory manner that involves ascorbate cycling between neurons and vicinal astrocytes - a relationship that appears to be crucial for brain ascorbate homeostasis. Additionally, emerging evidence strongly suggests that ascorbate has a greatly expanded role in regulating cellular and systemic iron metabolism than is classically recognized. The increasing recognition of the integral role of ascorbate in normal and deregulated cellular and organismal physiology demands a range of medium-throughput and high-sensitivity analytic techniques that can be executed without the need for highly expensive specialist equipment. Here we provide explicit instructions for a medium-throughput, specific and relatively inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Ascorbate plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. Here we describe a medium-throughput, specific and inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Kültür Hücrelerinin Intra-ve Ekstrasellüler Askorbat Belirlenmesi için hızlı ve spesifik bir Mikroplate Deneyi

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

Yordam ve anahtar optimizasyon stratejileri için bir otomatik Kapiler elektroforetik tabanlı Immunoassay yöntemi

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...