Plantago türleri, bitki vasküler biyolojisi ve stres fizyolojisi için model bitkiler olarak kullanılabilir. Bir transformasyon protokolünün oluşturulması, genler ve ilişkili fenotipleri arasındaki ilişkileri araştırmak için bu bitkiler üzerinde derinlemesine çalışmalara olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, dar yapraklı muzları yüksek verimlilikle dönüştürmek için gıdaları eksplant olarak kullanmasıdır.
Başlamak için, ticari olarak temin edilebilen yabani tip Plantago lanceolata tohumlarını, istenen bitki sayısına bağlı olarak, 5 mililitre işaretine kadar 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tohumları 60 saniye boyunca% 75 etanol içine batırın. Etanol atıldıktan sonra, tüpü yavaşça ters çevirerek tohumları taze hazırlanmış% 20 sodyum hipoklorite 40 dakika batırın.
Bir laminat akış davlumbazının altında, sodyum hipoklorit çözeltisini atın, ardından tohumları damıtılmış suyla beş kez yıkayın. Son durulamadan sonra tohumlara az miktarda su ekleyin, çünkü bu, bitkilerin plakalara hareketine yardımcı olabilir. Steril forseps kullanarak, çimlenen fidelerin aşırı kalabalıklaşmasını önlemek için tohumları plakanın yüzeyine eşit bir şekilde, her bir tohum arasında yaklaşık 1 santimetre yayarak tohumları katı MS ortamına sahip önceden hazırlanmış bir Petri kabına aktarın.
Kirlenmeyi önlemek için plakayı iki kat parafin film ile kapatın ve oda sıcaklığında serin beyaz bir büyüme ışığı altında inkübe edin. Fideler çimlendikten ve aktarılacak kadar büyük olduğunda, tipik olarak iki veya üç günlük çimlenmeden sonra, steril forseps kullanın ve fideleri 50 ila 100 mililitre MS Medium içeren steril kutulara aktarın. Kutuları cerrahi bantla kapatın ve bitkilerin yaklaşık üç ila dört hafta boyunca soğuk beyaz büyüme ışığı altında büyümesine izin verin.
İstenilen plazmidi içeren Agrobacterium tumefaciens'i uygun seçim maddesi ile hazırlanmış katı bir LB plakasına çizin. Parafin kaplı plakayı 28 santigrat derecede 48 saate kadar veya bakteriler toplanacak kadar büyüyene kadar inkübe edin. İnkübasyondan sonra, dönüşümden iki gün önce bir pipet ucu kullanarak bir bakteri kolonisi seçin ve uygun seçim maddesi ile altı mililitre sıvı LB içeren 15 mililitrelik yuvarlak bir alt tüpe aşılayın.
OD 600 0,6 ila 0,7'ye ulaşana kadar gece boyunca 28 santigrat derecelik bir masa üstü çalkalayıcıda 200 RPM'de çalkalayın. Bakteriler gerekli OD'ye ulaştığında, bakteri kültürünün 200 mikrolitresini, seçim maddesi ile 100 mililitre LB içeren steril bir şişeye aktarın. Gece boyunca 28 santigrat derecede 200 RPM'de sallayın.
Daha sonra bakteri kültürünü 50 mililitre steril santrifüj tüplerine aktarın ve bakterileri toplamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.200G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve bakteri peletini pipetleme yoluyla oda sıcaklığında beş mililitre taze hazırlanmış süspansiyon çözeltisi veya SS içinde yeniden askıya alın. Ardından 50 mililitre işaretine kadar daha fazla SS ekleyin ve birkaç kez karıştırmak için ters çevirin.
Bitkiler dönüşüm için ideal aşamaya ulaştığında, yaklaşık üç hafta içinde, kökleri bitkiden ayırmak ve yaprak ve kök malzemesini atmak için steril forseps ve makas kullanın. Kesimden hemen sonra, kök parçalarını aseptik olarak hidratlı tutmak için forseps kullanarak steril su içeren kutulara aktarın. Daha sonra, SS askıya alınmış Agrobacterium tumefaciens bakteri kültürünü steril 150 x 15 milimetrelik tek kullanımlık Petri kaplarına dökün.
Kesilmiş kökleri bakteri kültürüne aktarın ve en az 20 dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, kökleri birincil kökleri yanal köklerden ayıran bir santimetre parçalarına ayırmak için keskin bir bıçakla steril bir neşter kullanın. Daha sonra bakterilerin bitkiyi enfekte etmesine izin vermek için köklerin yüzeyinde ince sığ kesimler yapın.
Kuluçkadan sonra, fazla bakterileri gidermek için kök parçalarını steril kağıt havlulara aktarın. Daha sonra kurutulmuş kökleri, köklerin büyüklüğüne bağlı olarak plaka başına yaklaşık 10 ila 20 kök içeren katı ko-kültür ortamı içeren hazırlanmış Petri kaplarına aktarın. Plakaları iki kat şeffaf plastik film ile ve daha sonra üç gün boyunca oda sıcaklığında inkübe etmek için alüminyum folyo ile kapatın.
Üç günlük inkübasyondan sonra. Ko-kültür ortamında, kök parçalarını katı sürgün indüksiyon ortamı veya litre temetin başına 500 miligram ile SIM ve uygun antibiyotik seçimi ile hazırlanmış Petri kaplarına aktarın. Şeffaf plastik film sızdırmaz plakaları bir ay boyunca veya sürgünler ortaya çıkmaya başlayana kadar büyüyen bir ışık altında inkübe edin.
Fidancıklar 1,5 ila 2,0 santimetre uzunluğunda büyüdükten sonra. Onları hazırlanan steril kutulara aktarın. Katı kök indüksiyon ortamı ile.
Kökleri oluşana kadar bitkileri birkaç hafta boyunca bir büyüme ışığı altında büyütün. Tipik olarak, bir hafta sonra, kök sistemleri tipik olarak bir aylık büyümeden sonra aktarılacak kadar büyüdüğünde, bitkiyi alın ve köklere yapışan herhangi bir ortamı çıkarmak için kökleri suyla hafifçe yıkayın. Daha sonra bitkileri, önceden ıslatılmış çok amaçlı toprak içeren 3,5 inçlik kare saksılara aktarın BM yedi, bitkileri plastik bir saksı örtüsü ve daha sonra bitkilerin nemli bir ortamda kalmasını sağlamak için şeffaf bir plastik torba ile örtün.
Bu yöntem kök yaprağı ve küçük eski doku üzerinde test edildi. Ön deneyde, tüm doku tiplerinde duygusuz indüklenebilmesine rağmen, sadece kök dokusu üretilen kök dokusu SIM'de bir ay sonra sürgün baş harflerini üretti, yaprak ve pedal kahverengiye döndü ve öldü. Transforme dokudan çıkan sürgün baş harflerinin ilerlemesi ilk günden itibaren gözlendi.
Kökler, sürgünler köklenmeye hazır olduğunda SIM'e yerleştirildi. Bir hafta sonra kök dokusunun başlangıçta duygusuz bir şekilde oluştuğu sürgün baş harfleri gözlenebiliyordu. Sürgünler iki ve üç hafta boyunca ortaya çıkmaya devam etti ve dört hafta sonra sürgünler kök indüksiyon ortamına aktarılmaya hazırdı.
Cezalandırıcı transgenik bitkilerin tanımlanması, sürgünler yaklaşık 0.5 santimetre uzunluğunda olduğunda alınan yaprak segmentleri kullanılarak beta glukuronidaz GUS Histokimyasal testi kullanılarak gerçekleştirildi. Boş vektörlerle dönüşümdeki vahşi tip, lekelenme deseni göstermez. GUS geninin yokluğu nedeniyle, beta glukuronidaz GUS geni ile yapılan dönüşüm, bitkilerin transgenik olduğunu doğrulayan damarlarda açık mavi bir boyama paterni gösterdi İşlem sırasında kurumayı önlemek için kökler her zaman hidratlı tutulmalıdır.
