Bu çalışma aşağıdaki finansman kaynaklarına sahiptir: Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01AI 169537 (SRW ve NAC), NIH R01AI 140442 (SRW), VA Merit İnceleme CX001717 (NAC), VA Merit İnceleme BX005432 (SRW ve NAC), Penn Koronavirüsler ve Diğer Ortaya Çıkan Patojenler Araştırma Merkezi (SRW), Laffey-McHugh Vakfı (SRW ve NAC), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

Nazal örneklerin kullanımı Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (protokol # 800614) ve Philadelphia VA Kurumsal İnceleme Kurulu (protokol # 00781) tarafından onaylanmıştır.
1. Nazal ALI kültürlerinin enfeksiyonu
NOT: Klinik örneklerin elde edilmesinin yanı sıra nazal ALI kültürlerinin büyümesi ve farklılaşması bu yazının kapsamı dışındadır. Primer nazal epitel hücrelerinin kültürlenmesi için spesifik yöntemler, bu kültürleri kullanan yakın zamanda yayınlanmış çalışmalarda bulunabilir 18,22,23. Aşağıdaki protokoller, istenirse ticari olarak temin edilebilen nazal epitelyal ALI kültürlerine ek olarak uygulanabilir. Aşağıda ayrıntıları verilen protokoller ve hacimler, 24 oyuklu plakalı transwell ekleri (6,5 mm çap, 0,33cm2 membran yüzey alanı) için geçerlidir. Daha büyük transwell'lerde (yani 12 oyuklu plakalar, 12 mm çap, 1.12cm2 yüzey alanı) yetiştirilen ALI kültürleri kullanılıyorsa, hacimleri transwell boyutunu yansıtacak şekilde orantılı olarak ayarlayın.
<ol><li>Enfeksiyondan önceki gün:<ol><li>ALI kültürlerini 3x fosfat tamponlu salin (PBS) ile apikal olarak yıkayın (~ 200 μL ısıtılmış PBS ekleyin, 37 ° C inkübatöre 5 dakika koyun, PBS'yi aspire edin ve tekrarlayın).</li>
		<li>Bazal ortamı (500 μL) değiştirin.</li>
		<li>Kültürlerin, enfeksiyonların gece boyunca gerçekleştirileceği sıcaklıkta dengelenmesine izin verin (yani, 33 ° C'de enfekte oluyorsa, kültürleri PBS yıkamalarından sonra 33 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin). NOT: HCoV-229E ve HCoV-NL63 gibi soğuk algınlığı ile ilişkili HCoV'lerin 33 °C'de daha verimli bir şekilde çoğaldığı bildirilmektedir. Ek olarak, in vivo nazal epitelin sıcaklığı 33 °C'dir (bu, 37 °C olan akciğer sıcaklığından farklıdır).</li>
	</ol></li>
	<li>Toplam 50 μL'lik bir aşı hacminde istenen enfeksiyon çeşitliliğini (MOI) elde etmek için serumsuz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) gerektiği kadar virüsü seyreltin. NOT: Enfeksiyonlar tipik olarak MOI = 5'te (yüksek MOI) gerçekleştirilmiştir; bununla birlikte, MOI = 0.5'teki (düşük MOI) enfeksiyonlar, SARS-CoV-2 ve soğuk algınlığı ile ilişkili HCoV'ler için de kullanılmıştır ve bunlar, karşılaştırılabilir pik viral titrelerle sonuçlanır, ancak değişken kinetiklerle (MOI kabul edilebilir).</li>
	<li>Apikal olarak aşı ekleyin ve kültürleri 1 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.</li>
	<li>Enfeksiyon sırasında her 15 dakikada bir hafifçe kaya plakaları (viral inokulumun düzgün adsorpsiyonunu sağlamak için plakayı iki elinizle sıkıca tutun, ileri ve geri ve yan yana sallayın).</li>
	<li>1 saatlik inkübasyondan sonra, viral inokulum aspire edin ve viral inokulumun çıkarılmasını sağlamak için her enfekte kültürü 3x PBS ile yıkayın (her yıkama için 200 μL PBS ekleyin, 5 dakika inkübe edin ve bir pipetle aspire edin veya çıkarın).</li>
	<li>İstenirse, giriş virüsünün yeterli şekilde çıkarıldığını doğrulamak için üçüncü PBS yıkamasını toplayın.</li>
	<li>Enfeksiyon sırasında her 72 saatte bir enfekte ALI'lerde bazal ortamı taze ortamla değiştirin.</li>
</ol>2. Apikal yüzey sıvısının (ASL) toplanması ve dökülen virüsün titrasyonu
<ol><li>Enfeksiyonu takiben önceden belirlenmiş zaman noktalarında, enfekte olmuş her transwell'in apikal odasına 200 μL PBS ekleyin. NOT: İlgili zaman noktaları, ilgilenilen HCoV'ye bağlı olarak değişir ve enfeksiyondan 24 saat ila 192 saat sonra değişir (çeşitli HCoV'ler için viral replikasyon verileri için temsili sonuçlar bölümüne bakın).</li>
	<li>Apikal olarak dökülen virüsün maksimum toplanmasını sağlamak için PBS'yi 5 kat yukarı ve aşağı pipetleyin ve tüm hacmi bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın (bu ASL örneğidir). NOT: ASL, ALI kültürlerinden apikal olarak salgılanan mukus ve diğer ürünlere ek olarak dökülen viral partikülleri içerir.</li>
	<li>Standart viral plak tahlili ile ASL'deki enfeksiyöz virüsü ölçün (viral partiküllerin konsantrasyonunu ölçmek için virüs içeren numuneleri seri olarak seyreltin). NOT: Plak testi için kullanılan hücre tipleri ve kuluçka süresi, kullanılan virüse bağlı olacaktır: SARS-CoV-2 (VeroE6 hücreleri); MERS-CoV (VeroCCL81 hücreleri); HCoV-NL63 (LLC-MK2 hücreleri); HCoV-229E (Huh7 hücreleri). Viral plak tahlillerinin nasıl yapılacağına ilişkin ayrıntılar bu makalenin kapsamı dışındadır, ancak daha önce Journal of Visualized Experiments (JoVE) yayın24'te ayrıntılı olarak açıklanmıştır.</li>
	<li>İstenirse, bazal olarak salınan virüsün olmadığını doğrulamak için enfeksiyondan sonra çeşitli zamanlarda bazal ortamı toplayın. HCoV'ler tipik olarak nazal epitel hücrelerinden apikal olarak salınır, ancak bunu seyreltilmemiş bazal ortamın plak tahlili ile doğrular.</li>
	<li>ASL numunelerini −80 °C'de saklayın, eğer toplama gününde plak tahlili ile miktar tayini yapılmayacaksa.</li>
</ol>3. Hücre içi virüsün ölçülmesi
<ol><li>ASL örneğini topladıktan sonra, her bir transwell'i temel olarak% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren 500 μL DMEM ile önceden yüklenmiş 24 oyuklu temiz bir plakaya taşıyın. NOT: %2 FBS'li DMEM, sonraki donma-çözülme döngüleri sırasında virüsü stabilize etmek için kullanılır.</li>
	<li>Apikal olarak dökülen virüsün tamamen çıkarılmasını sağlamak için her bir transwell'i apikal olarak 3x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Son PBS yıkamasını çıkarmayı aspire ettikten sonra, apikal bölmeye% 2 FBS ile 100 μL DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hem apikal hem de bazal ortam içeren transwells içeren plakayı −80 °C'lik bir dondurucuya taşıyın ve hücreleri parçalamak için art arda üç donma-çözülme döngüsünü tamamlayın.</li>
	<li>Son donma-çözülme döngüsünden sonra, apikal (100 μL) ve bazal (500 μL) ortamı temiz bir tüpte toplayın.</li>
	<li>Herhangi bir hücresel kalıntıyı toplamak için 500 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı topla. Bu, standart plak testi yoluyla titrasyon için hücre içi virüs örneğidir. NOT: ASL toplamaya göre toplama işlemi sırasında üç kat seyreltme meydana gelir; ASL örnekleri 200 μL PBS'de toplanırken, hücre içi virüs örneği toplam 600 μL hacimde toplanır.</li>
</ol>4. Transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümü
NOT: TEER ölçümü için kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş PBS (PBS + Ca 2+/Mg 2+) kullanılmalıdır. Ohm cinsinden okumak için ayarlanmış bir epitelyal volt/ohmmetre kullanılır (Malzeme Tablosuna bakınız).
<ol><li>EVOM cihazını üreticinin talimatlarına göre temizleyin, dengeleyin ve boşaltın; Boşluk için burun hücresi eklenmemiş "boş" bir transwell kullanın. Boş TEER ölçümünü kaydedin. NOT: Birden fazla virüs kullanılıyorsa, çapraz kontaminasyonu önlemek için EVOM cihazı koşullar arasında sıkı bir şekilde temizlenmelidir (%70 etanol ve ardından deiyonize su ile yıkamalar yeterlidir).</li>
	<li>Enfekte olmuş her bir transwell'i, transwell'lerden kalan bazal ortamı yıkamak için temel olarak 500 μL PBS + Ca 2 + / Mg2 + içeren önceden etiketlenmiş, temiz 24 oyuklu bir plakaya taşıyın.</li>
	<li>Her bir transwell'in apikal bölmesine 200 μL PBS + Ca 2 + / Mg2 + ekleyin.</li>
	<li>Endohm-6 ölçüm odasına 1 mL PBS + Ca 2+/Mg2+ ekleyin.</li>
	<li>Her bir transwell'i Endohm-6 ölçüm odasına taşıyın ve apikal elektrot apikal bölmedeki 200 μL PBS'de duracak şekilde odanın kapağını değiştirin; bazal elektrot Endohm-6 odasının altına yerleştirilmiştir.</li>
	<li>EVOM okumasının stabilize olmasına izin verin ve ham TEER ölçümünü kaydedin.</li>
	<li>Titre isteniyorsa, TEER ölçümünü aldıktan sonra yukarıda açıklandığı gibi ASL numunesi toplayın (TEER ölçümü için eklenen 200 μL PBS + Ca 2 + / Mg2 + 'da toplayın). NOT: ASL numunesinin toplanması, epitel bariyerinde TEER okumalarını karıştırabilecek mikro yırtılmalara neden olabilir, bu nedenle TEER ölçümünden sonra ASL toplanmalıdır. Ayrıca, TEER değerlerini de etkileyebileceğinden, TEER okumalarından hemen önce bazal ortam değiştirilmemelidir.</li>
	<li>Ham TEER okumalarını Ohm/cm2 cinsinden son ölçümlere dönüştürmek için, boş TEER değerini çıkarın ve denklem (1)'i kullanarak bu değeri transwell membranının yüzey alanıyla çarpın: TEER = [TEER okuması - boş TEER değeri] × (transwell'in yüzey alanı) (1)</li>
	<li>HCoV'ler için, enfeksiyondan sonra her 24 saat veya 48 saatte bir TEER'i değerlendirin; TEER değişikliklerinin kinetiği genellikle virüsler arasında farklılık gösterir ve çeşitli zaman noktalarında sorun gidermeyi gerektirir.</li>
	<li>TEER'i ölçerken, her zaman sahte enfekte kültürleri dahil edin ve her zaman noktasında değerlendirin (negatif kontrol). NOT: Sahte kültürler için, TEER ölçümleri sabit kalmalıdır veya kültürlerin farklılaşması tamamlandıktan sonra taban çizgisinden biraz artabilir. Membran desteklerinin yüzey alanı, transwell'lerin boyutuna ve üreticisine bağlı olarak değişecektir; 24 kuyulu transwelller tipik olarak 0.33cm2'lik bir yüzey alanına sahiptir.</li>
</ol>5. Laktat dehidrojenaz (LDH) testi ile enfeksiyon sırasında sitotoksisitenin ölçülmesi
NOT: Bu çalışmada, ASL numunelerindeki LDH içeriği, ticari olarak temin edilebilen bir sitotoksisite tespit kiti kullanılarak ölçülmüştür. Bazal ortamdaki LDH sinyali genellikle tespit sınırının altındaydı ve HCoV ile enfekte kültürlerden alınan ASL örneklerinde ölçülen LDH'den genellikle daha az tekrarlanabilirdi.
<ol><li>LDH testi için gerekli ek kontrolleri hazırlayın.<ol><li>Arka plan kontrolü: PBS kullanın (ASL örnekleri bu şekilde toplanmışsa kalsiyum ve magnezyum içeren PBS kullanın).</li>
		<li>Pozitif kontrol (tavan değeri): ALI'leri apikal olarak Triton X-100 ile tedavi edin. Triton kontrol kuyularını toplayın (tipik olarak her zaman noktasında bunun için üç ALI kültürü kullanın).<ol><li>PBS'de 200 μL% 2 Triton X-100'ü doğrudan transwell'in apikal bölmesine ekleyin.</li>
			<li>Hücrelerin tamamen parçalanmasına izin vermek için 10-15 dakika inkübe edin.</li>
			<li>Tüm hacmi bir Triton tavan örneği olarak toplayın.</li>
		</ol></li>
		<li>Negatif kontrol (düşük kontrol / başlangıç LDH salınımı): enfekte kültürlerle aynı donörden türetilen sahte enfekte ALI kültürlerinden ASL toplayın.<ol><li>Yukarıdaki ASL toplama prosedürünü izleyerek negatif kontrol sahte ASL'yi toplayın. NOT: Bu negatif kontrol için tüm zaman noktaları için aynı transwell'ler kullanılabilirken, Triton kontrolü için her zaman noktası için yeni transwell'ler gerekli olacaktır.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Her ASL örneğinden LDH okumalarına ek olarak dökülen virüsün miktarının belirlenmesine izin vermek için, aşağıdaki gibi optik olarak net düz tabanlı siyah 96 oyuklu bir plaka yükleyin:<ol><li>45 μL numune ve 55 μL PBS (100 μL toplam hacim) kullanarak tüm numuneleri PBS'de seyreltin.</li>
		<li>Triton pozitif kontrol ve sahte arka plan kontrol örneklerini aynı şekilde tedavi edin. NOT: Bu seyreltme, her deneysel numunenin (45 μL x 3) üçlü yüklenmesine ve plak tahlili yoluyla titre için yeterli kalıntı ASL hacmine izin verir.</li>
		<li>LDH plakasını üç kopya halinde yükleyin: Triton tavan, sahte arka plan kontrolü, PBS kontrolü ve deneysel numuneler.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını üretici tarafından belirtildiği gibi hazırlayın (boya çözeltisi + katalizör).<ol><li>Her bir oyuğa 100 μL reaksiyon karışımı ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ışıktan koruyarak inkübe edin.</li>
		</ol></li>
		<li>20 dakika sonra, absorbansı 492 nm'de ölçün.</li>
		<li>Denklem (2)'yi kullanarak Triton tavan değerine göre yüzde sitotoksisiteyi hesaplayın. Sitotoksisite (%) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64868/64868eq01.jpg" style="margin: auto;"> (2)</li>
	</ol></li>
</ol>6. İmmünofloresan (IF) görüntüleme için nazal ALI kültürlerinin hazırlanması
<ol><li>Transwell'i 24 oyuklu yeni bir plakaya taşıyın ve PBS ile apikal olarak 3 kez yıkayın (titre ediyorsanız ilk PBS yıkamasını ASL olarak toplayın; daha sonra, IF kalitesini engelleyebilecek fazla dökülen virüsü çıkarmak için iki ek PBS yıkaması yapın)</li>
	<li>Son PBS yıkamasından sonra, transwell'i apikal ve bazal olarak% 4 PFA ile kaplayın.</li>
	<li>% 4 PFA'da sabitlemek için 30 dakika inkübe edin ve ardından 3x'i çıkarın ve PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Keskinleştirilmiş bir tıraş bıçağı veya makas kullanarak hücreleri içeren transwell desteğini kesin.</li>
	<li>Her transwell için IF hedeflerinin sayısını artırmak için, her bir zarı ikiye bölün ve her bir yarıyı farklı antikor kombinasyonları ile boyayın.</li>
	<li>PBS'de% 0.2 Triton X-100 ile 10 dakika geçirgen.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca PBST'de (PBS +% 0.2 Triton X-100) %10 normal eşek serumu ve% 1 BSA ile bloklayın. NOT: S'yi koruyunampbu adımdan itibaren ışığa maruz kalmaktan.</li>
	<li>Birincil antikor çözeltisi içinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Tüm antikorları bloke edici tamponda 1: 1.000 oranında seyreltin. NOT: HCoV nükleokapsid boyaması için temsili antikorların yanı sıra epitel hücre tipi belirteçleri ve hücre iskeleti boyaları aşağıda listelenmiştir (üretici bilgileri ve katalog numaraları için Malzeme Tablosuna bakın).<ol><li>HCoV antijen boyaması için SARS-CoV-2 nükleokapsid, MERS-CoV nükleokapsid ve HCoV-NL63 nükleokapsidi hedefleyen antikorlar kullanın.</li>
		<li>Epitel hücre tiplerini tanımlamak için, goblet hücre belirteci MUC5AC ve kirpikli hücre belirteci tip IV β-tubulini hedefleyen antikorlar kullanın.</li>
		<li>Hücre iskeleti belirteçleri için, falloidine (F-aktini bağlar) ve epitel hücre adezyon belirtecine karşı yönlendirilmiş antikorlar kullanın: EpCAM (CD326).</li>
	</ol></li>
	<li>İkincil antikor çözeltisinde oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin; Bloke edici tamponda 1: 1.000 oranında seyreltilmiş ikincil antikor boyaları kullanın.</li>
	<li>Boyama tamamlandıktan sonra, membranı bir spatula ile bir cam slayt üzerine aktarın, transwell'i apikal tarafı slayta doğru yönlendirin ve montaj solüsyonu ekleyin. Kenarlara şeffaf oje sürmeden önce 15-30 dakika bekletin.</li>
	<li>Konfokal mikroskop kullanarak görüntü elde edin (Z ekseni adımı: 0,5 μm; sıralı tarama)1,16,17. NOT: Kültürlerin %4 PFA'da fiksasyonundan ve PBS ile yıkanmasından sonra, sabit kültürler boyama ve görüntüleme için hazırlanmadan önce haftalar ila aylar boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Membranların boyanması ve montajından sonra, numuneler karanlıkta 4 °C'de uzun süreli (>2 yıl) saklanabilir.</li>
</ol>7. Batı immünoblotlama için hücre içi protein veya RT-qPCR analizi için RNA toplanması
<ol><li>Viral titreleri ölçerken yukarıda açıklandığı gibi ASL'yi toplayın (protokol bölüm 2).</li>
	<li>Membranın kazınması ek parçanın kırılmasına neden olabileceğinden, transwell'i 24 oyuklu temiz bir plakaya taşıyın.</li>
	<li>Western blot analizi için, proteaz inhibitörleri ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenmiş 125 μL RIPA tamponunda (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl,% 0.5 deoksikolat,% 0.1 SDS,% 1 NP40) toplam protein lizatı toplayın.</li>
	<li>Apikal bölmeye 125 μL RIPA tamponu ekleyin ve 5-10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Kalan bağlı hücreleri çıkarmak için bir P200 pipet ucu kullanarak membranı kazıyın ve tüm hacmi toplayın (membranın tüm yüzeyini kuvvetlice kazıyın ve ardından tüm numuneyi toplamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin).</li>
	<li>Protein lizat örneklerini buz üzerinde 10 dakika inkübe edin ve ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca maksimum hızda (20.000 × g) santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı, üretici protokollerine göre β-merkaptoetanol (indirgeyici ajan) ile 4x Laemmli numune tamponu ile karıştırın.</li>
	<li>Protein örneklerini 95 °C'de 5 dakika kaynatın ve ardından geleneksel batı kurutma protokollerini 1,16,17 kullanarak çalıştırın.</li>
	<li>Toplam RNA'nın toplanması için, piyasada bulunan bir RNA ekstraksiyon kitini kullanın. NOT: 24 oyuklu transwell eklerinin apikal bölmesi maksimum ~200 μL hacme sahiptir; Böylece, önerilen toplam hacme ulaşmak için her kültürde iki ardışık yıkama gerçekleştiriyoruz. Aşağıdaki ayrıntılar, 350 μL toplam hacimde önerilen RNA örneklerinin toplanmasına karşılık gelir.</li>
	<li>Enfekte transwell'in apikal bölmesine 200 μL lizis tamponu ekleyin.</li>
	<li>5-10 dakika bekletin, bir pipet ucu kullanarak zardan kalan hücreleri kazıyın ve tüm hacmi etiketli bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.</li>
	<li>Transwell'in apikal bölmesine 150 μL ek lizis tamponu ekleyin ve aynı mikrosantrifüj tüpüne toplamadan önce yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>RNA'yı üreticinin protokolüne göre çıkarın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Otter, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+primary+nasal+epithelial+cells+differentiates+among+lethal+and+seasonal+human+coronaviruses.">Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).</li><li>Fehr, A., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses:+An+overview+of+their+replication+and+pathogenesis.">Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).</li><li>Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+clinical+presentations+of+the+four+human+coronaviruses+229E,+HKU1,+NL63,+and+OC43+detected+over+3+years+using+a+novel+multiplex+real-time+PCR+method.">Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).</li><li>Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+on+the+seven+pathogenic+human+coronaviruses.">An overview on the seven pathogenic human coronaviruses.</a> Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).</li><li>MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update">https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update</a> (2022)</li><li>Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+clinical+features+of+patients+with+2019+novel+coronavirus+SARS-CoV-2:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+Soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses.">The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).</li><li>Farzal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+simulated+nebulized+and+spray+particle+deposition+in+chronic+rhinosinusitis+patients.">Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients.</a> International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).</li><li>Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oral-lung+axis:+The+impact+of+oral+health+on+lung+health.">The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health.</a> Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+reverse+genetics+reveals+a+variable+infection+gradient+in+the+respiratory+tract.">SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract.</a> Cell. 182, 429-446 (2020).</li><li>Hariri, B. M., Cohen, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+upper+airway+innate+immunity.">New insights into upper airway innate immunity.</a> American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).</li><li>Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+function+of+airway+epithelial+cells+in+inflammatory+lung+disease.">The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease.</a> European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).</li><li>Hatton, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+induction+of+type+I+and+III+interferons+mediates+nasal+epithelial+cell+permissiveness+to+SARS-CoV-2.">Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2.</a> Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).</li><li>Sungnak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+factors+are+highly+expressed+in+nasal+epithelial+cells+together+with+innate+immune+genes.">SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes.</a> Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+induces+double-stranded+RNA-mediated+innate+immune+responses+in+respiratory+epithelial-derived+cells+and+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).</li><li>Comar, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MERS-CoV+endoribonuclease+and+accessory+proteins+jointly+evade+host+innate+immunity+during+infection+of+lung+and+nasal+epithelial+cells.">MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).</li><li>Lee, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+D-amino+acids+suppress+sinonasal+innate+immunity+through+sweet+taste+receptors+in+solitary+chemosensory+cells.">Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells.</a> Science Signaling. 10 (495), (2017).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+nasal+and+bronchial+epithelial+cells+obtained+from+patients+with+COPD.">Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD.</a> PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).</li><li>Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+to+assess+in+vitro+immune+responses+to+respiratory+virus+infection+in+pregnant+women+with+asthma.">Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma.</a> Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).</li><li>Lee, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+aflatoxins+reduce+respiratory+mucosal+ciliary+function.">Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function.</a> Scientific Reports. 6, 33221 (2016).</li><li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+extracts+stimulate+solitary+chemosensory+cell+expansion+in+noninvasive+fungal+rhinosinusitis.">Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis.</a> International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+Using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).</li><li>Robinot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+induces+the+dedifferentiation+of+multiciliated+cells+and+impairs+mucociliary+clearance.">SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance.</a> Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).</li><li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance.">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).</li><li>Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+disrupts+the+airway+epithelial+barrier+by+decreasing+cortactin+and+destabilizing+F-actin.">Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin.</a> Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-13+impairs+tight+junctions+in+airway+epithelia.">IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).</li><li>Huang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-13+alters+tight+junction+proteins+expression+thereby+compromising+barrier+function+and+dampens+rhinovirus+induced+immune+responses+in+nasal+epithelium.">Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).</li><li>Saatian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+and+interleukin-13+cause+barrier+dysfunction+in+human+airway+epithelial+cells.">Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells.</a> Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).</li><li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia.">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).</li><li>Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air&#8722;liquid+interface+cultures+of+the+healthy+and+diseased+human+respiratory+tract:+Promises,+challenges,+and+future+directions.">Air&#8722;liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions.</a> Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).</li><li>Seibold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-13+stimulation+reveals+the+cellular+and+functional+plasticity+of+the+airway+epithelium.">Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+of+airway+cells+causes+intense+viral+and+cell+shedding,+two+spreading+mechanisms+affected+by+IL-13.">SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).</li></ol>

Susan Weiss, Ocugen'in Bilimsel Danışma Kurullarında yer almaktadır. Noam A. Cohen, GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron ve Oyster Point Pharmaceuticals'a danışmanlık yapmaktadır ve "Solunum Yolu Enfeksiyonu için Tedavi ve Teşhis" (10,881,698 B2, WO20913112865) ABD Patentine ve GeneOne Life Sciences ile bir lisans anlaşmasına sahiptir.

Burada detaylandırılan yöntemler, hasta kaynaklı nazal epitel hücrelerinin bir hava-sıvı arayüzünde büyütüldüğü ve HCoV-konakçı etkileşimlerinin incelenmesine uygulandığı bir primer epitel kültürü sistemini tanımlamaktadır. Farklılaştıktan sonra, bu nazal ALI kültürleri, siliatlı, kadeh ve bazal hücrelerin temsil edildiği heterojen bir hücresel popülasyonun yanı sıra sağlam bir şekilde atan kirpikler ve mukus sekresyonu ile bozulmamış mukosiliyer fonksiyon da dahil olmak üzere <...

Bugüne kadar yedi insan koronavirüsü (HCoV) tanımlanmıştır ve bir dizi solunum yolu hastalığına neden olmaktadır2. Yaygın veya mevsimsel HCoV'ler (HCoV-NL63, -229E, -OC43 ve -HKU1) tipik olarak üst solunum yolu patolojisi ile ilişkilidir ve yıllık soğuk algınlığı vakalarının tahminen %10-30'una neden olur. Bu, yaygın HCoV'lerle ilişkili tipik klinik fenotip olmasına rağmen, bu virüsler çocuklar, yaşlı yetişkinler ve bağışıklığı baskılanmış bireyler dahil olmak üzere risk altındaki popülasyonlarda daha önemli alt solunum yolu hastalığına neden olabilir 3,4. Son 20 yılda şiddetli akut solunum sendromu (SARS)-CoV, Orta Doğu solunum sendromu (MERS)-CoV ve SARS-CoV-2 dahil olmak üzere üç patojenik HCoV ortaya çıkmış ve önemli halk sağlığı acil durumlarına neden olmuştur. Ölümcül HCoV'ler, MERS-CoV vakalarıyla ilişkili %>34 vaka-ölüm oranı (2012'de ortaya çıkmasından bu yana 2.500'den fazla vakadan 894 ölüm) ile açıkça gösterilen daha şiddetli solunum yolu patolojisi ile ilişkilidir5,6. Ölümcül HCoV'lerin, devam eden COVID-19 pandemisinde görüldüğü gibi, asemptomatik enfeksiyonlardan ölümcül pnömoniye kadar bir dizi solunum yolu hastalığına da neden olduğunu belirtmek önemlidir7.
HCoV'ler, diğer solunum yolu patojenleri gibi, solunum yollarına girer ve burun epitelinde üretken bir enfeksiyon oluşturur8. Alt solunum yoluna yayılımın, HCoV'lerin daha önemli alt solunum yolu patolojisine neden olduğu ağız/nazal boşluktan akciğere aspirasyon ile ilişkili olduğu düşünülmektedir 9,10,11. Bu nedenle burun, viral giriş için ilk portal görevi görür ve sağlam mukosiliyer klirens mekanizması ve alt solunum yoluna daha fazla viral yayılmayı önlemeyi amaçlayan benzersiz doğuştan gelen bağışıklık mekanizmaları ile enfeksiyona karşı birincil bariyerdir12,13. Örneğin, nazal epitel hücrelerinin, antiviral interferonların ve interferon ile uyarılan genlerin ortalama bazal seviyelerinden daha yüksek eksprese ettiği bildirilmiştir, bu da nazal hücrelerin solunum yolu virüslerine erken tepkiler için hazırlanabileceğini gösterir14,15,16.
Daha önce, HCoV enfeksiyonlarının başladığı burundaki HCoV-konakçı etkileşimlerini modellemek için bir hava-sıvı arayüzünde (ALI) büyütülen hasta kaynaklı primer nazal epitel hücrelerini kullandık. Nazal ALI kültürleri hem patojenik (SARS-CoV-2 ve MERS-CoV) hem de yaygın HCoV'lere (HCoV-NL63 ve HCoV-229E) izin verir ve A549 (bir akciğer adenokarsinomu hücre hattı) gibi geleneksel hava yolu epitel hücre hatlarına göre çeşitli avantajlar sunar16,17. Farklılaşmadan sonra, nazal ALI kültürleri heterojen bir hücresel popülasyon içerir ve mukosiliyer klirens mekanizması gibi in vivo nazal epitelden beklenen fonksiyonların çoğunu sergiler18. Nazal epitel hücrelerinin sitolojik fırçalama yoluyla elde edilmesi, HBEC'lere ulaşmak için bronkoskopi gibi tekniklerin kullanılmasına kıyasla önemli ölçüde daha az invaziv olduğundan, nazal hücreler ayrıca alt solunum yolu kültür sistemlerine (insan bronşiyal epitel hücreleri, HBEC'ler gibi) göre avantajlar sunar 19,20,21.
Bu yazıda, nazal epitelde HCoV-konakçı etkileşimlerini karakterize etmek için bu nazal ALI kültür sistemini kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntemleri SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 ve HCoV-229E 1,16,17'yi karşılaştırmak için yakın zamanda yayınlanan çalışmalarda uyguladık. Bu yöntemler ve temsili sonuçlar, bu nazal hücre modelinde HCoV'lerin incelenmesini vurgulasa da, sistem diğer HCoV'lere ve diğer solunum yolu patojenlerine oldukça uyarlanabilir. Ayrıca, bu yöntemler, viral replikasyon ve hücresel tropizmin yanı sıra enfeksiyonu takiben sitotoksisite ve doğuştan gelen immün indüksiyonu araştırmak için diğer ALI kültür sistemlerine daha geniş bir şekilde uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endohm-6G measurement chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9326-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW software for imaging</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40641-V07E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLC-MK2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-7</td>
			<td>To titrate HCoV-NL63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012)</td>
			<td>BEI Resources&#160;</td>
			<td>NR-44260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40068-MM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC5AC antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMAB91539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647 stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH34000000</td>
			<td>Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>89990</td>
			<td>Can prep in-house or purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-52281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX135357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV &#946;- tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroCCL81 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>To titrate MERS-CoV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroE6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td>To titrate SARS-CoV-2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infection of primary nasal epithelial cells grown at an air-liquid interface to characterize human coronavirus-host interactions

SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) ve SARS-CoV-2 (2019) olmak üzere üç yüksek patojenik insan koronavirüsü (HCoV) ortaya çıkmış ve son 20 yılda önemli halk sağlığı krizlerine neden olmuştur. Dört ek HCoV, her yıl soğuk algınlığı vakalarının önemli bir kısmına neden olur (HCoV-NL63, -229E, -OC43 ve -HKU1), bu virüslerin fizyolojik olarak ilgili sistemlerde incelenmesinin önemini vurgulamaktadır. HCoV'ler solunum yoluna girer ve tüm solunum yolu patojenlerinin karşılaştığı birincil bölge olan burun epitelinde enfeksiyon oluşturur. Bu önemli sentinel bölgedeki konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için hastadan türetilen burun örneklerinin bir hava-sıvı arayüzünde (ALI) büyütüldüğü bir birincil nazal epitel kültürü sistemi kullanıyoruz. Bu kültürler, mevcut hücre tipleri, siliyer fonksiyon ve mukus üretimi dahil olmak üzere in vivo hava yolunun birçok özelliğini özetler. HCoV enfeksiyonunu takiben nazal ALI kültürlerinde viral replikasyon, konak hücre tropizmi, virüs kaynaklı sitotoksisite ve doğuştan gelen immün indüksiyonu karakterize etmek için yöntemleri, ölümcül ve mevsimsel HCoV'leri karşılaştıran son çalışmaları örnek olarak kullanarak açıklıyoruz1. Burundaki konak-patojen etkileşimlerinin daha iyi anlaşılması, HCoV'lere ve gelecekte ortaya çıkması muhtemel diğer solunum yolu virüslerine karşı antiviral terapötikler için yeni hedefler sağlama potansiyeline sahiptir.

Temsili rakamlar kısmen Otter ve ark.1 el yazmasında bulunabilecek verilerden uyarlanmıştır. Dört veya altı donörden türetilen nazal ALI kültürleri, yukarıda açıklanan protokollere göre dört HCoV'den (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 ve HCoV-229E) biri ile enfekte edildi ve her virüs için ortalama apikal olarak dökülen viral titreler Şekil 1A'da gösterilmiştir. Bu HCoV'lerin dördü de nazal ALI kültürlerinde verimli bir şekilde çoğalırken,...

Watch this Scientific Journal Video about Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions at JoVE.com

Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

Nazal epitel, tüm solunum yolu patojenlerinin karşılaştığı birincil bariyer bölgesidir. Burada, fizyolojik olarak ilgili bir sistemde insan koronavirüs-konakçı etkileşimlerini karakterize etmek için hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri olarak büyütülen birincil nazal epitel hücrelerini kullanma yöntemlerini özetliyoruz.

İnsan Koronavirüs-Konakçı Etkileşimlerini Karakterize Etmek için Hava-Sıvı Arayüzünde Büyütülen Primer Nazal Epitel Hücrelerinin Enfeksiyonu

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

infection-primary-nasal-epithelial-cells-grown-at-an-air-liquid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

1.1K Görüntüleme.  University of Pennsylvania. Nazal epitel, tüm solunum yolu patojenlerinin karşılaştığı birincil bariyer bölgesidir. Burada, fizyolojik olarak ilgili bir sistemde insan koronavirüs-konakçı etkileşimlerini karakterize etmek için hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri olarak büyütülen birincil nazal epitel hücrelerini kullanma yöntemlerini özetliyoruz.

Video: Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...