Questo studio ha le seguenti fonti di finanziamento: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. e N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. e N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. e N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

L'uso di campioni nasali è stato approvato dall'Institutional Review Board dell'Università della Pennsylvania (protocollo # 800614) e dal Philadelphia VA Institutional Review Board (protocollo # 00781).
1. Infezione delle colture nasali di ALI
NOTA: L'acquisizione di campioni clinici, così come la crescita e la differenziazione di colture ALI nasali, non rientrano nell'ambito di questo documento. Metodi specifici per la coltura di cellule epiteliali nasali primarie possono essere trovati in lavori pubblicati di recente che utilizzano queste colture 18,22,23. I protocolli seguenti possono essere applicati anche alle colture ALI epiteliali nasali disponibili in commercio, se lo si desidera. I protocolli e i volumi descritti di seguito sono applicabili agli inserti transwell su piastra a 24 pozzetti (diametro 6,5 mm, superficie della membrana 0,33 cm2). Se si utilizzano colture ALI coltivate su pozzetti più grandi (ad es. piastre a 12 pozzetti, diametro 12 mm, superficie 1,12 cm2), regolare i volumi proporzionalmente per riflettere la dimensione del pozzetto.
<ol><li>Il giorno prima dell'infezione:<ol><li>Lavare le colture ALI 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per via apicale (aggiungere ~200 μL di PBS riscaldato, porre in incubatore a 37 °C per 5 minuti, aspirare PBS e ripetere).</li>
		<li>Sostituire il terreno basale (500 μL).</li>
		<li>Lasciare che le colture si equilibrino alla temperatura alla quale verranno condotte le infezioni durante la notte (cioè, se si infetta a 33 °C, posizionare le colture in un incubatore a 33 °C dopo i lavaggi PBS). NOTA: È stato riportato che gli HCoV associati al comune raffreddore come HCoV-229E e HCoV-NL63 si replicano in modo più efficiente a 33 °C. Inoltre, la temperatura dell'epitelio nasale in vivo è di 33 °C (questo differisce dalla temperatura del polmone, che è di 37 °C).</li>
	</ol></li>
	<li>Diluire il virus secondo necessità nel terreno di Dulbecco modificato (DMEM) privo di siero per ottenere la molteplicità di infezione (MOI) desiderata in un volume totale di inoculo di 50 μL. NOTA: Le infezioni sono state in genere condotte a MOI = 5 (MOI alto); tuttavia, le infezioni a MOI = 0,5 (MOI basso) sono state utilizzate anche per SARS-CoV-2 e HCoV associati al raffreddore comune, e queste si traducono in titoli virali di picco comparabili, ma con cinetica variabile (entrambi i MOI sono accettabili).</li>
	<li>Aggiungere l'inoculo per via apicale e rimettere le colture nell'incubatrice per 1 ora.</li>
	<li>Scuotere delicatamente le piastre ogni 15 minuti durante l'infezione (tenendo saldamente la piastra con entrambe le mani, oscillare avanti e indietro e da un lato all'altro per garantire un adsorbimento uniforme dell'inoculo virale).</li>
	<li>Dopo 1 ora di incubazione, aspirare l'inoculo virale e lavare ogni coltura infetta 3 volte con PBS per garantire la rimozione dell'inoculo virale (per ogni lavaggio, aggiungere 200 μL di PBS, incubare per 5 minuti e aspirare o rimuovere con una pipetta).</li>
	<li>Se lo si desidera, raccogliere il terzo lavaggio PBS per confermare l'adeguata rimozione del virus in ingresso.</li>
	<li>Sostituire il terreno basale con terreno fresco sugli ALI infetti ogni 72 ore durante l'infezione.</li>
</ol>2. Prelievo del liquido superficiale apicale (ASL) e titolazione del virus
<ol><li>In momenti predeterminati dopo l'infezione, aggiungere 200 μL di PBS alla camera apicale di ciascun transwell infetto. NOTA: I punti temporali rilevanti variano a seconda dell'HCoV di interesse e vanno da 24 ore a 192 ore dopo l'infezione (vedere la sezione dei risultati rappresentativi per i dati di replicazione virale per vari HCoV).</li>
	<li>Pipettare il PBS su e giù 5 volte per garantire la massima raccolta del virus apicalmente e raccogliere l'intero volume in una provetta per microcentrifuga (questo è il campione ASL). NOTA: L'ASL include le particelle virali sparse oltre al muco e ad altri prodotti secreti apicalmente dalle colture ALI.</li>
	<li>Quantificare il virus infettivo nell'ASL tramite il test standard della placca virale (diluire in serie campioni contenenti virus per quantificare la concentrazione di particelle virali). NOTA: I tipi di cellule e il periodo di incubazione utilizzati per il test della placca dipenderanno dal virus utilizzato: SARS-CoV-2 (cellule VeroE6); MERS-CoV (cellule VeroCCL81); HCoV-NL63 (cellule LLC-MK2); HCoV-229E (cellule Huh7). Le specifiche su come condurre i saggi delle placche virali esulano dallo scopo di questo manoscritto, ma sono state dettagliate in precedenza in una pubblicazione del Journal of Visualized Experiments (JoVE)24.</li>
	<li>Se lo si desidera, raccogliere il terreno basale in vari momenti dopo l'infezione per confermare l'assenza di virus rilasciato per via basale. Gli HCoV sono tipicamente rilasciati apicalmente dalle cellule epiteliali nasali, ma lo confermano attraverso il dosaggio della placca del terreno basale non diluito.</li>
	<li>Conservare i campioni ASL a -80 °C se il giorno del prelievo non si verifica la quantificazione mediante test della placca.</li>
</ol>3. Quantificazione del virus intracellulare
<ol><li>Dopo aver raccolto il campione di ASL, spostare ciascun transwell in una piastra pulita a 24 pozzetti precaricata con 500 μL di DMEM contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) per via basale. NOTA: DMEM con FBS al 2% viene utilizzato per stabilizzare il virus durante i successivi cicli di gelo-disgelo.</li>
	<li>Lavare ogni transwell 3 volte per via apicale con PBS per garantire la completa rimozione del virus apicale.</li>
	<li>Dopo l'aspirazione per rimuovere il lavaggio finale del PBS, aggiungere 100 μL di DMEM con FBS al 2% nello scomparto apicale.</li>
	<li>Spostare la piastra contenente i pozzetti con terreni apicali e basali in un congelatore a -80 °C e completare tre cicli consecutivi di gelo-disgelo per lisare le cellule.</li>
	<li>Dopo l'ultimo ciclo di gelo-disgelo, raggruppare i terreni apicali (100 μL) e basali (500 μL) in una provetta pulita.</li>
	<li>Centrifugare a 500 × g per 10 minuti a 4 °C per pellettare eventuali detriti cellulari.</li>
	<li>Raccogli il surnatante. Questo è il campione di virus intracellulare per la titolazione tramite il test della placca standard. NOTA: Durante il processo di raccolta si verifica una diluizione tripla rispetto alla raccolta ASL; I campioni di ASL vengono raccolti in 200 μL di PBS, mentre i campioni di virus intracellulari vengono raccolti in un volume totale di 600 μL.</li>
</ol>4. Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)
NOTA: Per la misurazione del TEER, è necessario utilizzare PBS integrato con calcio e magnesio (PBS + Ca 2+/Mg2+). Viene utilizzato un volt/ohmmetro epiteliale impostato per leggere in ohm (vedere la tabella dei materiali).
<ol><li>Pulire, equilibrare e svuotare lo strumento EVOM secondo le istruzioni del produttore; Utilizzare un pozzetto "vuoto" senza cellule nasali aggiunte per il blanking. Registrare la misurazione del TEER in bianco. NOTA: Se si utilizzano più virus, lo strumento EVOM deve essere pulito rigorosamente tra una condizione e l'altra per evitare la contaminazione incrociata (sono sufficienti lavaggi con etanolo al 70% seguiti da acqua deionizzata).</li>
	<li>Spostare ciascun transwell infetto in una piastra a 24 pozzetti pulita e premarcata con 500 μL di PBS + Ca 2+/Mg2+ per via basale per lavare il terreno basale residuo dai pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di PBS + Ca 2+/Mg2+ al compartimento apicale di ciascun transwell.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS + Ca 2+/Mg2+ alla camera di misurazione Endohm-6.</li>
	<li>Spostare ciascun transwell nella camera di misura Endohm-6 e riposizionare il coperchio della camera in modo che l'elettrodo apicale poggi nei 200 μL di PBS nel compartimento apicale; l'elettrodo basale è integrato nella parte inferiore della camera Endohm-6.</li>
	<li>Consenti alla lettura EVOM di stabilizzarsi e registra la misurazione TEER grezza.</li>
	<li>Raccogliere il campione ASL come descritto sopra dopo aver effettuato la misurazione del TEER, se si desidera titolare (raccogliere i 200 μL di PBS + Ca 2+/Mg2+ che sono stati aggiunti per la misurazione del TEER). NOTA: La raccolta del campione ASL può indurre micro-lacerazioni nella barriera epiteliale che possono confondere le letture TEER, quindi l'ASL deve essere raccolto dopo la misurazione del TEER. Inoltre, il terreno basale non deve essere cambiato immediatamente prima delle letture TEER, in quanto ciò potrebbe influire sui valori TEER.</li>
	<li>Per convertire le letture TEER grezze in misurazioni finali in Ohm/cm2, sottrarre il valore TEER vuoto e moltiplicare questo valore per l'area della superficie della membrana del pozzetto utilizzando l'equazione (1): TEER = [Lettura TEER - valore TEER in bianco] × (superficie del pozzetto) (1)</li>
	<li>Per gli HCoV, valutare il TEER ogni 24 o 48 ore dopo l'infezione; la cinetica delle modifiche di TEER spesso varia tra i virus e richiede la risoluzione dei problemi in vari momenti.</li>
	<li>Quando si misura il TEER, includere sempre colture finte infette e valutarle in ogni momento (controllo negativo). NOTA: Per le colture simulate, le misurazioni TEER devono rimanere stabili o possono aumentare leggermente rispetto al basale dopo il completamento della differenziazione delle colture. L'area superficiale dei supporti a membrana varia a seconda delle dimensioni e del produttore dei pozzetti; I transwell a 24 pozzetti hanno in genere una superficie di 0,33 cm2.</li>
</ol>5. Misurazione della citotossicità durante l'infezione tramite il saggio della lattato deidrogenasi (LDH)
NOTA: In questo lavoro, il contenuto di LDH nei campioni di ASL è stato quantificato utilizzando un kit di rilevamento della citotossicità disponibile in commercio. Il segnale LDH in terreno basale era spesso al di sotto del limite di rilevabilità e spesso meno riproducibile rispetto all'LDH quantificato nei campioni ASL provenienti da colture infette da HCoV.
<ol><li>Preparare i controlli aggiuntivi necessari per il dosaggio dell'LDH.<ol><li>Controllo di fondo: utilizzare PBS (utilizzare PBS contenente calcio e magnesio se i campioni ASL sono stati raccolti in questo modo).</li>
		<li>Controllo positivo (valore massimo): trattare gli ALI apicalmente con Triton X-100. Raccogliere i pozzi di controllo Triton (in genere utilizzare tre colture ALI per questo in ogni punto temporale).<ol><li>Aggiungere 200 μL di Triton X-100 al 2% in PBS direttamente nel compartimento apicale del transwell.</li>
			<li>Incubare per 10-15 minuti per consentire alle cellule di lisarsi completamente.</li>
			<li>Raccogli l'intero volume come campione di soffitto Triton.</li>
		</ol></li>
		<li>Controllo negativo (basso controllo/rilascio basale di LDH): raccogliere ASL da colture ALI finte-infette derivate dallo stesso donatore di colture infette.<ol><li>Raccogliere l'ASL simulato del controllo negativo seguendo la procedura di raccolta ASL di cui sopra. NOTA: Gli stessi transwell possono essere utilizzati per questo controllo negativo per tutti i punti temporali, mentre saranno necessari nuovi transwell per ogni punto temporale per il controllo Triton.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Per consentire la quantificazione del virus sparso oltre alle letture LDH da ciascun campione ASL, caricare una piastra nera a 96 pozzetti a fondo piatto otticamente trasparente come segue:<ol><li>Diluire tutti i campioni in PBS, utilizzando 45 μL di campione e 55 μL di PBS (100 μL di volume totale).</li>
		<li>Trattare allo stesso modo i campioni di controllo positivo Triton e di controllo dello sfondo simulato. NOTA: Questa diluizione consente il carico triplicato di ciascun campione sperimentale (45 μL x 3) e un volume ASL residuo sufficiente per la titolazione tramite il test della placca.</li>
		<li>Caricare la piastra LDH in triplice: soffitto Triton, controllo dello sfondo simulato, controllo PBS e campioni sperimentali.</li>
		<li>Preparare la miscela di reazione come indicato dal produttore (soluzione colorante + catalizzatore).<ol><li>Aggiungere 100 μL di miscela di reazione a ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti al riparo dalla luce.</li>
		</ol></li>
		<li>Dopo 20 minuti, misurare l'assorbanza a 492 nm.</li>
		<li>Calcolare la percentuale di citotossicità rispetto al valore del limite di Triton utilizzando l'equazione (2). Citotossicità (%) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64868/64868eq01.jpg" style="margin: auto;"> (2)</li>
	</ol></li>
</ol>6. Preparazione di colture nasali di ALI per l'imaging in immunofluorescenza (IF)
<ol><li>Spostare il transwell in una nuova piastra a 24 pozzetti e lavare 3 volte apicalmente con PBS (raccogliere il primo lavaggio PBS come ASL se si titolano; quindi, eseguire altri due lavaggi PBS per rimuovere il virus in eccesso che potrebbe ostacolare la qualità del digiuno intermittente)</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale del PBS, coprire il transwell apicale e basale con PFA al 4%.</li>
	<li>Incubare per 30 minuti per fissare in PFA al 4%, quindi rimuovere e lavare 3 volte con PBS.</li>
	<li>Eseguire l'asportazione del supporto del pozzetto contenente le celle utilizzando una lama di rasoio affilata o delle forbici.</li>
	<li>Per aumentare il numero di bersagli IF per ciascun transwell, tagliare ciascuna membrana a metà e colorare ogni metà con diverse combinazioni di anticorpi.</li>
	<li>Permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 10 min.</li>
	<li>Bloccare con il 10% di siero d'asina normale e l'1% di BSA in PBST (PBS + 0,2% Triton X-100) per 60 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Proteggere i campioni dall'esposizione alla luce da questo passaggio in avanti.</li>
	<li>Incubare in soluzione di anticorpi primari per una notte a 4 °C. Diluire tutti gli anticorpi 1:1.000 in tampone bloccante. NOTA: Di seguito sono elencati gli anticorpi rappresentativi per la colorazione del nucleocapside HCoV, nonché i marcatori del tipo di cellula epiteliale e le colorazioni del citoscheletro (vedere la Tabella dei materiali per le informazioni sul produttore e i numeri di catalogo).<ol><li>Per la colorazione dell'antigene HCoV, utilizzare anticorpi mirati al nucleocapside SARS-CoV-2, al nucleocapside MERS-CoV e al nucleocapside HCoV-NL63.</li>
		<li>Per identificare i tipi di cellule epiteliali, utilizzare anticorpi che hanno come bersaglio il marcatore delle cellule caliciformi MUC5AC e il marcatore delle cellule ciliate di tipo IV β-tubulina.</li>
		<li>Per i marcatori del citoscheletro, utilizzare anticorpi diretti contro la falloidina (lega la F-actina) e il marcatore di adesione delle cellule epiteliali: EpCAM (CD326).</li>
	</ol></li>
	<li>Incubare in soluzione anticorpale secondaria per 60 minuti a temperatura ambiente; Utilizzare coloranti anticorpali secondari diluiti 1:1.000 in tampone bloccante.</li>
	<li>Al termine della colorazione, trasferire la membrana su un vetrino con una spatola, orientare il pozzetto con il lato apicale verso il vetrino e aggiungere la soluzione di montaggio. Lasciare riposare per 15-30 minuti prima di applicare lo smalto trasparente intorno ai bordi.</li>
	<li>Acquisizione di immagini con microscopio confocale (passo dell'asse Z: 0,5 μm; scansione sequenziale)1,16,17. NOTA: Dopo la fissazione delle colture in PFA al 4% e il lavaggio con PBS, le colture fissate possono essere conservate a 4 °C per settimane o mesi prima della colorazione e della preparazione per l'imaging. Dopo la colorazione e il montaggio delle membrane, i campioni possono essere conservati a lungo termine (>2 anni) a 4 °C al buio.</li>
</ol>7. Raccolta di proteine intracellulari per l'immunoblotting occidentale o di RNA per l'analisi RT-qPCR
<ol><li>Raccogliere l'ASL come descritto sopra se si quantificano i titoli virali (sezione 2 del protocollo).</li>
	<li>Spostare il pozzetto su una piastra pulita a 24 pozzetti, poiché la raschiatura della membrana può portare alla rottura dell'inserto.</li>
	<li>Per l'analisi western blot, raccogliere il lisato proteico totale in 125 μL di tampone RIPA (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5% desossicolato, 0,1% SDS, 1% NP40) integrato con inibitori della proteasi e della fosfatasi.</li>
	<li>Aggiungere 125 μL di tampone RIPA al compartimento apicale e incubare per 5-10 minuti.</li>
	<li>Raschiare la membrana utilizzando un puntale per pipetta P200 per rimuovere eventuali cellule attaccate rimanenti e raccogliere l'intero volume (raschiare energicamente su tutta la superficie della membrana, quindi pipettare su e giù più volte per raccogliere l'intero campione).</li>
	<li>Incubare i campioni di lisato proteico su ghiaccio per 10 minuti, quindi centrifugare alla massima velocità (20.000 × g) per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Miscelare il surnatante con 4 tamponi per campioni Laemmli con β-mercaptoetanolo (agente riducente) secondo i protocolli del produttore.</li>
	<li>Far bollire i campioni proteici a 95 °C per 5 minuti, quindi eseguire utilizzando i tradizionali protocolli di western blotting 1,16,17.</li>
	<li>Per la raccolta dell'RNA totale, utilizzare un kit di estrazione dell'RNA disponibile in commercio a scelta. NOTA: Il compartimento apicale degli inserti transwell a 24 pozzetti ha un volume massimo di ~200 μL; Pertanto, eseguiamo due lavaggi sequenziali su ciascuna coltura per raggiungere il volume totale raccomandato. I dettagli riportati di seguito corrispondono alla raccolta raccomandata di campioni di RNA in un volume totale di 350 μL.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di tampone di lisi al compartimento apicale del pozzetto infetto.</li>
	<li>Lasciare riposare per 5-10 minuti, raschiare le cellule rimanenti dalla membrana utilizzando un puntale per pipette e raccogliere l'intero volume in una provetta per microcentrifuga etichettata.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di tampone di lisi aggiuntivo al compartimento apicale del transwell e pipettare su e giù prima di raccogliere nella stessa provetta per microcentrifuga.</li>
	<li>Estrarre l'RNA secondo il protocollo del produttore.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Otter, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+primary+nasal+epithelial+cells+differentiates+among+lethal+and+seasonal+human+coronaviruses.">Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).</li><li>Fehr, A., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronaviruses:+An+overview+of+their+replication+and+pathogenesis.">Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).</li><li>Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MERS-CoV+endoribonuclease+and+accessory+proteins+jointly+evade+host+innate+immunity+during+infection+of+lung+and+nasal+epithelial+cells.">MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).</li><li>Lee, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+D-amino+acids+suppress+sinonasal+innate+immunity+through+sweet+taste+receptors+in+solitary+chemosensory+cells.">Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells.</a> Science Signaling. 10 (495), (2017).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+nasal+and+bronchial+epithelial+cells+obtained+from+patients+with+COPD.">Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD.</a> PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).</li><li>Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+to+assess+in+vitro+immune+responses+to+respiratory+virus+infection+in+pregnant+women+with+asthma.">Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma.</a> Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).</li><li>Lee, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+aflatoxins+reduce+respiratory+mucosal+ciliary+function.">Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function.</a> Scientific Reports. 6, 33221 (2016).</li><li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+extracts+stimulate+solitary+chemosensory+cell+expansion+in+noninvasive+fungal+rhinosinusitis.">Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis.</a> International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+Using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).</li><li>Robinot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+induces+the+dedifferentiation+of+multiciliated+cells+and+impairs+mucociliary+clearance.">SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance.</a> Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).</li><li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance.">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).</li><li>Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+disrupts+the+airway+epithelial+barrier+by+decreasing+cortactin+and+destabilizing+F-actin.">Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin.</a> Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-13+impairs+tight+junctions+in+airway+epithelia.">IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).</li><li>Huang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-13+alters+tight+junction+proteins+expression+thereby+compromising+barrier+function+and+dampens+rhinovirus+induced+immune+responses+in+nasal+epithelium.">Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).</li><li>Saatian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+and+interleukin-13+cause+barrier+dysfunction+in+human+airway+epithelial+cells.">Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells.</a> Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).</li><li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia.">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).</li><li>Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air&#8722;liquid+interface+cultures+of+the+healthy+and+diseased+human+respiratory+tract:+Promises,+challenges,+and+future+directions.">Air&#8722;liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions.</a> Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).</li><li>Seibold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-13+stimulation+reveals+the+cellular+and+functional+plasticity+of+the+airway+epithelium.">Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+of+airway+cells+causes+intense+viral+and+cell+shedding,+two+spreading+mechanisms+affected+by+IL-13.">SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).</li></ol>

Susan Weiss fa parte del comitato consultivo scientifico di Ocugen. Noam A. Cohen è consulente per GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron e Oyster Point Pharmaceuticals e ha un brevetto statunitense, "Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection" (10.881.698 B2, WO20913112865), e un accordo di licenza con GeneOne Life Sciences.

I metodi qui descritti descrivono un sistema di coltura epiteliale primaria in cui le cellule epiteliali nasali derivate dal paziente vengono coltivate ad un'interfaccia aria-liquido e applicate allo studio delle interazioni HCoV-ospite. Una volta differenziate, queste colture nasali di ALI ricapitolano molte caratteristiche dell'epitelio nasale in vivo, tra cui una popolazione cellulare eterogenea con cellule ciliate, caliciformi e basali rappresentate, nonché una funzione mucociliare intatta con ciglia e secrezione di...

Ad oggi sono stati identificati sette coronavirus umani (HCoV) che causano una serie di malattie respiratorie2. Gli HCoV comuni o stagionali (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1) sono tipicamente associati alla patologia del tratto respiratorio superiore e causano circa il 10%-30% dei casi di raffreddore comuni ogni anno. Sebbene questo sia il tipico fenotipo clinico associato ai comuni HCoV, questi virus possono causare malattie più significative del tratto respiratorio inferiore nelle popolazioni a rischio, inclusi bambini, anziani e individui immunocompromessi 3,4. Negli ultimi 20 anni sono emersi tre HCoV patogeni che hanno causato significative emergenze di salute pubblica, tra cui la sindrome respiratoria acuta grave (SARS)-CoV, la sindrome respiratoria mediorientale (MERS)-CoV e SARS-CoV-2. Gli HCoV letali sono associati a una patologia del tratto respiratorio più grave, il che è chiaramente illustrato dal tasso di mortalità del >34% associato ai casi di MERS-CoV (894 decessi su oltre 2.500 casi dalla sua comparsa nel 2012)5,6. È importante notare che gli HCoV letali causano anche una serie di malattie del tratto respiratorio, dalle infezioni asintomatiche alla polmonite letale, come si è visto con la pandemia di COVID-19 in corso7.
Gli HCoV, come altri patogeni respiratori, entrano nel tratto respiratorio e stabiliscono un'infezione produttiva nell'epitelio nasale8. Si ritiene che la diffusione alle vie aeree inferiori sia associata all'aspirazione dalla cavità orale/nasale al polmone, dove gli HCoV causano una patologia più significativa del tratto respiratorio inferiore 9,10,11. Pertanto, il naso funge da portale iniziale per l'ingresso virale ed è la barriera primaria all'infezione con il suo robusto meccanismo di clearance mucociliare e meccanismi immunitari innati unici volti a prevenire un'ulteriore diffusione virale alle vie aeree inferiori12,13. Ad esempio, è stato riportato che le cellule epiteliali nasali esprimono livelli basali superiori alla media di interferoni antivirali e geni stimolati dall'interferone, indicando che le cellule nasali possono essere innescate per risposte precoci ai virus respiratori14,15,16.
In precedenza abbiamo utilizzato cellule epiteliali nasali primarie derivate da pazienti cresciute in un'interfaccia aria-liquido (ALI) per modellare le interazioni HCoV-ospite nel naso, dove iniziano le infezioni da HCoV. Le colture nasali di ALI sono permissive sia per gli HCoV patogeni (SARS-CoV-2 e MERS-CoV) che per quelli comuni (HCoV-NL63 e HCoV-229E) e offrono vari vantaggi rispetto alle tradizionali linee cellulari epiteliali delle vie aeree come A549 (una linea cellulare di adenocarcinoma polmonare)16,17. Dopo il differenziamento, le colture nasali di ALI contengono una popolazione cellulare eterogenea e presentano molte delle funzioni attese dall'epitelio nasale in vivo, come il meccanismo di clearance mucociliare18. Le cellule nasali offrono anche vantaggi rispetto ai sistemi di coltura delle vie aeree inferiori (come le cellule epiteliali bronchiali umane, HBEC), poiché l'acquisizione di cellule epiteliali nasali tramite spazzolamento citologico è significativamente meno invasiva rispetto all'utilizzo di tecniche come la broncoscopia per ottenere HBEC 19,20,21.
Questo documento descrive i metodi per l'utilizzo di questo sistema di coltura ALI nasale per caratterizzare le interazioni HCoV-ospite nell'epitelio nasale. Abbiamo applicato questi metodi in lavori pubblicati di recente per confrontare SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 e HCoV-229E 1,16,17. Sebbene questi metodi e risultati rappresentativi enfatizzino lo studio degli HCoV in questo modello di cellule nasali, il sistema è altamente adattabile ad altri HCoV, così come ad altri patogeni respiratori. Inoltre, questi metodi possono essere applicati in modo più ampio ad altri sistemi di coltura ALI al fine di studiare la replicazione virale e il tropismo cellulare, nonché la citotossicità e l'induzione immunitaria innata a seguito di infezione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endohm-6G measurement chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9326-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW software for imaging</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40641-V07E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLC-MK2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-7</td>
			<td>To titrate HCoV-NL63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012)</td>
			<td>BEI Resources&#160;</td>
			<td>NR-44260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40068-MM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC5AC antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMAB91539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647 stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH34000000</td>
			<td>Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>89990</td>
			<td>Can prep in-house or purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-52281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX135357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV &#946;- tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroCCL81 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>To titrate MERS-CoV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroE6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td>To titrate SARS-CoV-2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infection of primary nasal epithelial cells grown at an air-liquid interface to characterize human coronavirus-host interactions

Negli ultimi 20 anni sono emersi tre coronavirus umani ad alta patogenicità (HCoV) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) e SARS-CoV-2 (2019) - che hanno causato significative crisi di salute pubblica. Quattro HCoV aggiuntivi causano una parte significativa dei casi di raffreddore comune ogni anno (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1), evidenziando l'importanza di studiare questi virus in sistemi fisiologicamente rilevanti. Gli HCoV entrano nel tratto respiratorio e stabiliscono l'infezione nell'epitelio nasale, il sito primario incontrato da tutti i patogeni respiratori. Utilizziamo un sistema di coltura epiteliale nasale primaria in cui i campioni nasali derivati dal paziente vengono coltivati in un'interfaccia aria-liquido (ALI) per studiare le interazioni ospite-patogeno in questo importante sito sentinella. Queste colture ricapitolano molte caratteristiche delle vie aeree in vivo , compresi i tipi di cellule presenti, la funzione ciliare e la produzione di muco. Descriviamo i metodi per caratterizzare la replicazione virale, il tropismo della cellula ospite, la citotossicità indotta dal virus e l'induzione immunitaria innata in colture nasali di ALI a seguito di infezione da HCoV, utilizzando un recente lavoro che confronta HCoV letali e stagionali come esempio1. Una maggiore comprensione delle interazioni ospite-patogeno nel naso ha il potenziale per fornire nuovi bersagli per terapie antivirali contro HCoV e altri virus respiratori che probabilmente emergeranno in futuro.

Le cifre rappresentative sono parzialmente adattate dai dati che si possono trovare nel manoscritto Otter et al.1. Le colture nasali di ALI derivate da quattro o sei donatori sono state infettate con uno dei quattro HCoV (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 e HCoV-229E) secondo i protocolli sopra descritti e i titoli virali medi apicali per ciascun virus sono illustrati nella Figura 1A. Mentre tutti e quattro questi HCoV si replicano in modo produttivo nelle colture ALI n...

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Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

L'epitelio nasale è il sito di barriera primario incontrato da tutti i patogeni respiratori. Qui, descriviamo i metodi per utilizzare le cellule epiteliali nasali primarie cresciute come colture di interfaccia aria-liquido (ALI) per caratterizzare le interazioni coronavirus-ospite umano in un sistema fisiologicamente rilevante.

Infezione di cellule epiteliali nasali primarie cresciute in un'interfaccia aria-liquido per caratterizzare le interazioni uomo-coronavirus-ospite

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

1.1K Views.  University of Pennsylvania. L'epitelio nasale è il sito di barriera primario incontrato da tutti i patogeni respiratori. Qui, descriviamo i metodi per utilizzare le cellule epiteliali nasali primarie cresciute come colture di interfaccia aria-liquido (ALI) per caratterizzare le interazioni coronavirus-ospite umano in un sistema fisiologicamente rilevante.

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Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infezione da modello per lo studio<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Valutazione dell'interfaccia sinaptica primaria umana delle cellule di T dal sangue periferico e tessuto linfoide

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

Infezione da pneumococco delle cellule primarie endoteliali nel flusso costante

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...