이 연구의 자금 출처는 다음과 같습니다: 미국 국립보건원(NIH) R01AI 169537(S.R.W. 및 N.A.C.), NIH R01AI 140442(S.R.W.), VA Merit Review CX001717(N.A.C.), VA Merit Review BX005432(S.R.W. 및 N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens(S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation(S.R.W. 및 N.A.C.), T32 AI055400(CJO), T32 AI007324(AF).

비강 검체의 사용은 펜실베니아 대학교 기관 검토 위원회(프로토콜 # 800614) 및 필라델피아 VA 기관 검토 위원회(프로토콜 # 00781)의 승인을 받았습니다.
1. 비강 ALI 배양 감염
참고: 임상 검체의 획득과 비강 ALI 배양의 성장 및 분화는 이 논문의 범위를 벗어납니다. 일차 비강 상피 세포를 배양하기 위한 구체적인 방법은 이러한 배양물을 이용하여 최근에 발표된 연구에서 찾을 수 있다 18,22,23. 아래 프로토콜은 원하는 경우 상업적으로 이용 가능한 비강 상피 ALI 배양에 추가로 적용할 수 있습니다. 아래에 자세히 설명된 프로토콜과 용량은 24웰 플레이트 트랜스웰 인서트(직경 6.5mm, 멤브레인 표면적 0.33cm2)에 적용할 수 있습니다. 더 큰 트랜스웰(즉, 12웰 플레이트, 직경 12mm, 표면적 1.12cm2)에서 성장한 ALI 배양액을 사용하는 경우 트랜스웰 크기를 반영하도록 부피를 비례적으로 조정합니다.
<ol><li>감염 전날:<ol><li>인산염 완충 식염수(PBS)로 ALI 배양액을 3배 세척합니다(~200μL의 데워진 PBS를 추가하고 37°C 인큐베이터에 5분 동안 넣고 PBS를 흡입하고 반복).</li>
		<li>기초 배지(500μL)를 교체합니다.</li>
		<li>하룻밤 동안 감염이 수행될 온도에서 배양액이 평형을 이루도록 합니다(즉, 33°C에서 감염하는 경우 PBS 세척 후 배양액을 33°C 인큐베이터에 넣음). 참고: HCoV-229E 및 HCoV-NL63과 같은 감기와 관련된 HCoV는 33°C에서 더 효율적으로 복제되는 것으로 보고되었습니다. 또한 생체 내 비강 상피의 온도는 33°C입니다(이는 폐의 온도인 37°C와 다릅니다).</li>
	</ol></li>
	<li>혈청이 없는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 필요에 따라 바이러스를 희석하여 총 접종 용량 50μL에서 원하는 감염 다중성(MOI)을 달성합니다. 참고: 감염은 일반적으로 MOI = 5(높은 MOI)에서 수행되었습니다. 그러나 MOI = 0.5(낮은 MOI)의 감염은 SARS-CoV-2 및 일반적인 감기 관련 HCoV에도 사용되었으며, 이로 인해 유사한 피크 바이러스 역가가 발생하지만 다양한 역학(MOI 중 하나가 허용됨)이 있습니다.</li>
	<li>접종물을 정점으로 추가하고 배양액을 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.</li>
	<li>감염 시 15분마다 판을 부드럽게 돌립니다(양손으로 판을 단단히 잡고 앞뒤로 좌우로 흔들어 바이러스 접종물의 균일한 흡착을 보장함).</li>
	<li>1시간 배양 후 바이러스 접종물을 흡인하고 감염된 각 배양액을 PBS로 3회 세척하여 바이러스 접종물을 제거합니다(세척할 때마다 PBS 200μL를 추가하고 5분 동안 배양한 후 피펫으로 흡인 또는 제거).</li>
	<li>원하는 경우 세 번째 PBS 세척을 수집하여 입력 바이러스가 적절하게 제거되었는지 확인합니다.</li>
	<li>감염 기간 동안 72시간마다 감염된 ALI의 기초 배지를 새 배지로 교체합니다.</li>
</ol>2. 정점 표면 액체(ASL) 수집 및 유출된 바이러스 적정
<ol><li>감염 후 미리 결정된 시점에 200μL의 PBS를 감염된 각 트랜스웰의 정점 챔버에 추가합니다. 참고: 관련 시점은 관심 HCoV에 따라 다르며 감염 후 24시간에서 192시간 사이입니다(다양한 HCoV에 대한 바이러스 복제 데이터는 대표 결과 섹션 참조).</li>
	<li>PBS를 위아래로 5배 피펫팅하여 정점으로 흘린 바이러스를 최대한 수집하고 전체 부피를 마이크로 원심분리 튜브(ASL 샘플)에 수집합니다. 참고: ASL에는 ALI 배양액에서 분비되는 점액 및 기타 산물 외에도 흘린 바이러스 입자가 포함됩니다.</li>
	<li>표준 바이러스 플라크 분석(바이러스 입자의 농도를 정량화하기 위해 바이러스 함유 샘플을 연속적으로 희석)을 통해 ASL에서 감염성 바이러스를 정량화합니다. 참고: 플라크 분석에 사용되는 세포 유형 및 잠복기는 사용된 바이러스에 따라 다릅니다: SARS-CoV-2(VeroE6 세포); MERS-CoV(VeroCCL81 세포); HCoV-NL63(LLC-MK2 세포); HCoV-229E(Huh7 세포). 바이러스 플라크 분석을 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 이 원고의 범위를 벗어나지만 이전에 Journal of Visualized Experiments(JoVE) 간행물24에 자세히 설명되어 있습니다.</li>
	<li>원하는 경우 감염 후 여러 번 기저 배지를 수집하여 기저 방출 바이러스가 없는지 확인합니다. HCoV는 일반적으로 비강 상피 세포에서 정점으로 방출되지만 희석되지 않은 기저 배지의 플라크 분석을 통해 이를 확인합니다.</li>
	<li>채취 당일에 플라크 분석에 의한 정량이 발생하지 않는 경우 ASL 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.</li>
</ol>3. 세포내 바이러스 정량
<ol><li>ASL 검체를 채취한 후 각 트랜스웰을 2% 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 500μL의 DMEM이 사전 로드된 깨끗한 24웰 플레이트로 옮깁니다. 참고: FBS가 2% 함유된 DMEM은 후속 동결-해동 주기 동안 바이러스를 안정화하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>각 트랜스웰을 PBS로 3번 정진맥으로 세척하여 정맥으로 흘린 바이러스를 완전히 제거합니다.</li>
	<li>최종 PBS 세척을 제거하기 위해 흡인 한 후 2% FBS가 포함된 DMEM 100μL를 정점 구획에 추가합니다.</li>
	<li>정점 및 기저 배지가 모두 있는 트랜스웰이 포함된 플레이트를 -80°C 냉동고로 옮기고 3회 연속 동결-해동 주기를 완료하여 세포를 용해합니다.</li>
	<li>최종 동결-해동 사이클 후 정점(100μL)과 기저(500μL) 배지를 깨끗한 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>500× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.</li>
	<li>상층액을 수집합니다. 이것은 표준 플라크 분석을 통한 적정을 위한 세포 내 바이러스 샘플입니다. 참고: ASL 수집과 관련하여 수집 과정에서 3중 희석이 발생합니다. ASL 샘플은 200μL의 PBS에서 수집되는 반면, 세포 내 바이러스 샘플은 총 600μL로 수집됩니다.</li>
</ol>4. 경상피 전기 저항(TEER) 측정
알림: TEER 측정의 경우 칼슘과 마그네슘이 보충된 PBS(PBS + Ca 2+/Mg2+)를 사용해야 합니다. 옴 단위로 읽도록 설정된 상피 전압/저항계가 사용됩니다(재료 표 참조).
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 EVOM 기기를 청소, 평형 및 비우십시오. 블랭킹을 위해 비강 세포가 추가되지 않은 "비어있는" 트랜스웰을 사용하십시오. 빈 TEER 측정을 기록합니다. 알림: 여러 바이러스를 사용하는 경우 교차 오염을 방지하기 위해 조건 사이에 EVOM 기기를 엄격하게 세척해야 합니다(70% 에탄올로 세척한 후 탈이온수로 세척하면 충분함).</li>
	<li>감염된 각 트랜스웰을 500μL의 PBS + Ca 2+/Mg 2+ 기저가 있는 사전 라벨이 부착된 깨끗한24 웰 플레이트로 이동하여 트랜스웰에서 잔류 기저 배지를 세척합니다.</li>
	<li>200μL의 PBS + Ca 2+/Mg2+를 각 트랜스웰의 정점 구획에 추가합니다.</li>
	<li>1mL의 PBS + Ca 2+/Mg2+를 Endohm-6 측정 챔버에 추가합니다.</li>
	<li>각 트랜스웰을 Endohm-6 측정 챔버로 이동하고 정점 전극이 정점 구획의 PBS 200μL에 놓이도록 챔버의 뚜껑을 교체합니다. 기저 전극은 Endohm-6 챔버의 바닥에 내장되어 있습니다.</li>
	<li>EVOM 판독값이 안정화되도록 하고 원시 TEER 측정을 기록합니다.</li>
	<li>적정이 필요한 경우 TEER 측정을 수행한 후 위에서 설명한 대로 ASL 샘플을 수집합니다(TEER 측정을 위해 추가된 PBS + Ca 2+/Mg 2+의200μL에서 수집). 참고: ASL 샘플 수집은 상피 장벽에 미세 파열을 유도하여 TEER 판독값을 혼동할 수 있으므로 TEER 측정 후 ASL을 수집해야 합니다. 또한 기저 매체는 TEER 값에도 영향을 미칠 수 있으므로 TEER 판독 직전에 변경해서는 안 됩니다.</li>
	<li>원시 TEER 판독값을 Ohms/cm2 단위의 최종 측정값으로 변환하려면 빈 TEER 값을 빼고 방정식 (1)을 사용하여 이 값에 트랜스웰 멤브레인의 표면적을 곱합니다. TEER = [TEER 판독값 - 공백 TEER 값] ×(트랜스웰의 표면적) (1)</li>
	<li>HCoV의 경우 감염 후 24시간 또는 48시간마다 TEER을 평가합니다. TEER 변화의 동역학은 바이러스에 따라 달라지는 경우가 많으며 다양한 시점에서 문제 해결이 필요합니다.</li>
	<li>TEER을 측정할 때는 항상 모의 감염 배양을 포함하고 각 시점(음성 대조군)에서 평가합니다. 참고: 모의 배양의 경우 TEER 측정은 안정적으로 유지되거나 배양 분화가 완료된 후 기준선에서 약간 증가할 수 있습니다. 멤브레인 지지대의 표면적은 트랜스웰의 크기와 제조업체에 따라 달라집니다. 24웰 트랜스웰의 표면적은 일반적으로 0.33cm2입니다.</li>
</ol>5. 젖산 탈수소효소(LDH) 분석을 통한 감염 중 세포독성 측정
참고: 이 연구에서는 ASL 샘플의 LDH 함량을 시판되는 세포독성 검출 키트를 사용하여 정량화했습니다. 기초 배지의 LDH 신호는 종종 검출 한계 미만이었고 HCoV 감염 배양의 ASL 샘플에서 정량화된 LDH보다 재현성이 떨어지는 경우가 많았습니다.
<ol><li>LDH 분석에 필요한 추가 대조군을 준비합니다.<ol><li>배경 제어: PBS를 사용합니다(ASL 샘플이 이러한 방식으로 수집된 경우 칼슘과 마그네슘이 포함된 PBS 사용).</li>
		<li>양성 대조군(한계값): Triton X-100으로 ALI를 정점으로 처리합니다. Triton 대조군을 수집합니다(일반적으로 각 시점에서 3개의 ALI 배양을 사용합니다).<ol><li>PBS의 2% Triton X-100 200μL 200을 트랜스웰의 정점 구획에 직접 추가합니다.</li>
			<li>세포가 완전히 용해될 수 있도록 10-15분 동안 배양합니다.</li>
			<li>전체 부피를 Triton 천장 샘플로 수집합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>음성 대조군(낮은 대조군/기준선 LDH 방출): 감염된 배양물과 동일한 공여체에서 유래한 모의 감염 ALI 배양물에서 ASL을 수집합니다.<ol><li>위의 ASL 수집 절차에 따라 음성 대조군 모의 ASL을 수집합니다. 알림: 모든 시점에 대해 이 네거티브 컨트롤에 동일한 트랜스웰을 사용할 수 있는 반면, Triton 컨트롤의 경우 각 시점에 대해 새로운 트랜스웰이 필요합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>각 ASL 샘플의 LDH 판독값과 함께 흘린 바이러스를 정량화하려면 다음과 같이 광학적으로 투명한 평평한 바닥의 검은색 96웰 플레이트를 로드합니다.<ol><li>45μL의 샘플과 55μL의 PBS(총 부피 100μL)를 사용하여 모든 샘플을 PBS로 희석합니다.</li>
		<li>Triton 양성 대조군과 모의 배경 대조군 표본을 동일한 방식으로 처리합니다. 참고: 이 희석을 통해 각 실험 샘플(45μL x 3)을 3배로 로딩하고 플라크 분석을 통한 적정을 위한 충분한 잔류 ASL 부피를 얻을 수 있습니다.</li>
		<li>LDH 플레이트를 세 번 로드: Triton 천장, 모의 배경 제어, PBS 제어 및 실험 샘플.</li>
		<li>제조업체가 표시한대로 반응 혼합물을 준비합니다 (염료 용액 + 촉매).<ol><li>각 웰에 100μL의 반응 혼합물을 첨가하고 빛으로부터 보호된 상태에서 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>20분 후 492nm에서 흡광도를 측정합니다.</li>
		<li>방정식 (2)를 사용하여 Triton 천장 값에 상대적인 세포 독성 백분율을 계산합니다. 세포 독성 (%) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64868/64868eq01.jpg" style="margin: auto;"> (2)</li>
	</ol></li>
</ol>6. 면역형광(IF) 이미징을 위한 비강 ALI 배양 준비
<ol><li>트랜스웰을 새 24웰 플레이트로 옮기고 PBS로 정점으로 3회 세척합니다(역가가 있는 경우 첫 번째 PBS 세척을 ASL로 수집한 다음 두 번의 추가 PBS 세척을 수행하여 IF 품질을 저해할 수 있는 과도한 흘린 바이러스를 제거)</li>
	<li>최종 PBS 세척 후 트랜스웰을 정점과 기초 방향으로 4% PFA로 덮습니다.</li>
	<li>30분 동안 배양하여 4% PFA로 고정한 다음 제거하고 PBS로 3번 세척합니다.</li>
	<li>날카로운 면도날이나 가위를 사용하여 세포가 들어 있는 트랜스웰 지지대를 절제합니다.</li>
	<li>각 트랜스웰에 대한 IF 표적 수를 늘리려면 각 멤브레인을 반으로 자르고 각 절반을 서로 다른 항체 조합으로 염색합니다.</li>
	<li>PBS에서 0.2% Triton X-100으로 10분 동안 투과시킵니다.</li>
	<li>PBST(PBS + 0.2% Triton X-100)의 10% 정상 당나귀 혈청과 1% BSA로 실온에서 60분 동안 차단합니다. 알림: 이 단계부터 빛에 노출되지 않도록 샘플을 보호하십시오.</li>
	<li>4°C에서 1차 항체 용액에서 밤새 배양합니다. 모든 항체를 차단 완충액에 1:1,000으로 희석합니다. 참고: HCoV 뉴클레오캡시드 염색을 위한 대표적인 항체와 상피 세포 유형 마커 및 세포골격 염색은 아래에 나열되어 있습니다(제조업체 정보 및 카탈로그 번호는 재료 표 참조).<ol><li>HCoV 항원 염색의 경우 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드, MERS-CoV 뉴클레오캡시드 및 HCoV-NL63 뉴클레오캡시드를 표적으로 하는 항체를 사용합니다.</li>
		<li>상피 세포 유형을 식별하려면 잔 세포 마커 MUC5AC 및 섬모 세포 마커 유형 IV β-튜불린을 표적으로 하는 항체를 사용합니다.</li>
		<li>세포골격 마커의 경우 팔로이딘(F-액틴과 결합)에 대한 항체와 상피 세포 접착 마커인 EpCAM(CD326)을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>실온에서 60분 동안 2차 항체 용액에서 배양합니다. 차단 완충액에 1:1,000으로 희석된 2차 항체 염료를 사용합니다.</li>
	<li>염색이 완료되면 멤브레인을 주걱으로 유리 슬라이드에 옮기고 정점 쪽이 슬라이드를 향하도록 트랜스웰을 향하게 한 다음 장착 용액을 추가합니다. 가장자리 주위에 투명한 매니큐어를 바르기 전에 15-30분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>컨포칼 현미경을 사용하여 이미지 획득(Z축 단계: 0.5μm, 순차 스캐닝)1,16,17. 참고: 배양액을 4% PFA에 고정하고 PBS로 세척한 후 고정 배양액을 4°C에서 몇 주에서 몇 달 동안 보관한 후 염색 및 이미징 준비를 할 수 있습니다. 멤브레인을 염색하고 장착한 후 시료는 어두운 곳에서 4°C에서 장기간(>2년) 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>7. 서양 면역블로팅을 위한 세포 내 단백질 수집 또는 RT-qPCR 분석을 위한 RNA
<ol><li>바이러스 역가를 정량화하는 경우 위에서 설명한 대로 ASL을 수집합니다(프로토콜 섹션 2).</li>
	<li>멤브레인을 긁으면 인서트가 파손될 수 있으므로 트랜스웰을 깨끗한 24웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>웨스턴 블롯 분석의 경우, 프로테아제 억제제 및 인산가수분해효소 억제제가 보충된 125μL의 RIPA 완충액(50mM Tris, pH 8, 150mM NaCl, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 1% NP40)에서 총 단백질 용해물을 수집합니다.</li>
	<li>125 μL의 RIPA 완충액을 정점 격실에 추가하고 5-10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>P200 피펫 팁을 사용하여 멤브레인을 긁어 부착된 나머지 세포를 제거하고 전체 부피를 수집합니다(멤브레인의 전체 표면을 세게 긁은 다음 위아래로 여러 번 피펫팅하여 전체 샘플을 수집).</li>
	<li>단백질 용해물 시료를 얼음 위에서 10분 동안 배양한 다음 4°C에서 10분 동안 최대 속도(20,000 × g)로 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 4x Laemmli 샘플 버퍼와 β-메르캅토에탄올(환원제)과 제조업체 프로토콜에 따라 혼합합니다.</li>
	<li>단백질 샘플을 95°C에서 5분 동안 끓인 다음 전통적인 웨스턴 블로팅 프로토콜 1,16,17을 사용하여 실행합니다.</li>
	<li>전체 RNA를 수집하려면 시중에서 판매되는 RNA 추출 키트를 선택하십시오. 참고: 24웰 트랜스웰 인서트의 정점 격실은 최대 부피가 ~200μL입니다. 따라서 총 권장 용량에 도달하기 위해 각 배양액에 대해 두 번의 순차적 세척을 수행합니다. 아래 세부 정보는 총 부피 350μL의 RNA 샘플의 권장 수집에 해당합니다.</li>
	<li>200μL의 용해 완충액을 감염된 트랜스웰의 정점 구획에 추가합니다.</li>
	<li>5-10분 동안 그대로 두었다가 피펫 팁을 사용하여 멤브레인에 남아 있는 세포를 긁어내고 전체 부피를 라벨이 부착된 마이크로 원심분리기 튜브에 모읍니다.</li>
	<li>150μL의 추가 용해 완충액을 트랜스웰의 정점 구획에 추가하고 동일한 마이크로 원심분리기 튜브에 수집하기 전에 위아래로 피펫팅합니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 RNA를 추출합니다.</li>
</ol>

<ol>
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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+induction+of+type+I+and+III+interferons+mediates+nasal+epithelial+cell+permissiveness+to+SARS-CoV-2.">Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2.</a> Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).</li><li>Sungnak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+factors+are+highly+expressed+in+nasal+epithelial+cells+together+with+innate+immune+genes.">SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes.</a> Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+induces+double-stranded+RNA-mediated+innate+immune+responses+in+respiratory+epithelial-derived+cells+and+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).</li><li>Comar, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MERS-CoV+endoribonuclease+and+accessory+proteins+jointly+evade+host+innate+immunity+during+infection+of+lung+and+nasal+epithelial+cells.">MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).</li><li>Lee, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+D-amino+acids+suppress+sinonasal+innate+immunity+through+sweet+taste+receptors+in+solitary+chemosensory+cells.">Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells.</a> Science Signaling. 10 (495), (2017).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+nasal+and+bronchial+epithelial+cells+obtained+from+patients+with+COPD.">Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD.</a> PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).</li><li>Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+to+assess+in+vitro+immune+responses+to+respiratory+virus+infection+in+pregnant+women+with+asthma.">Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma.</a> Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).</li><li>Lee, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+aflatoxins+reduce+respiratory+mucosal+ciliary+function.">Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function.</a> Scientific Reports. 6, 33221 (2016).</li><li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+extracts+stimulate+solitary+chemosensory+cell+expansion+in+noninvasive+fungal+rhinosinusitis.">Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis.</a> International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+Using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).</li><li>Robinot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+induces+the+dedifferentiation+of+multiciliated+cells+and+impairs+mucociliary+clearance.">SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance.</a> Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).</li><li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance.">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).</li><li>Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+disrupts+the+airway+epithelial+barrier+by+decreasing+cortactin+and+destabilizing+F-actin.">Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin.</a> Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-13+impairs+tight+junctions+in+airway+epithelia.">IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).</li><li>Huang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-13+alters+tight+junction+proteins+expression+thereby+compromising+barrier+function+and+dampens+rhinovirus+induced+immune+responses+in+nasal+epithelium.">Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).</li><li>Saatian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+and+interleukin-13+cause+barrier+dysfunction+in+human+airway+epithelial+cells.">Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells.</a> Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).</li><li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia.">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).</li><li>Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air&#8722;liquid+interface+cultures+of+the+healthy+and+diseased+human+respiratory+tract:+Promises,+challenges,+and+future+directions.">Air&#8722;liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions.</a> Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).</li><li>Seibold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-13+stimulation+reveals+the+cellular+and+functional+plasticity+of+the+airway+epithelium.">Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infection+of+airway+cells+causes+intense+viral+and+cell+shedding,+two+spreading+mechanisms+affected+by+IL-13.">SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).</li></ol>

수잔 와이스(Susan Weiss)는 오큐젠(Ocugen)의 과학 자문 위원회에 소속되어 있습니다. 노암 A. 코헨(Noam A. Cohen)은 GSK, 아스트라제네카(AstraZeneca), 노바티스(Novartis), 사노피/레제론(Sanofi/Regeron), 오이스터 포인트 파마슈티컬스(Oyster Point Pharmaceuticals)의 자문을 맡고 있으며, 미국 특허인 "호흡기 감염 치료 및 진단"(10,881,698 B2, WO20913112865)을 보유하고 있으며, GeneOne Life Sciences와 라이선스 계약을 체결했습니다.

여기에 자세히 설명된 방법은 환자 유래 비강 상피 세포가 공기-액체 계면에서 성장하고 HCoV-숙주 상호 작용 연구에 적용되는 1차 상피 배양 시스템을 설명합니다. 일단 분화되면, 이러한 비강 ALI 배양은 섬모, 잔 및 기저 세포가 대표되는 이질적인 세포 집단뿐만 아니라 섬모와 점액 분비가 강력하게 박동하는 온전한 점액 섬모 기능을 포함하여 생체 내 비강 상피의 많은 특징을 요약합니다...

현재까지 7종의 인간 코로나바이러스(HCoV)가 확인되었으며 다양한 호흡기 질환을 유발합니다2. 일반적인 또는 계절성 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)는 일반적으로 상기도 병리와 관련이 있으며 매년 일반적인 감기 사례의 약 10%-30%를 유발합니다. 이는 일반적인 HCoV와 관련된 전형적인 임상 표현형이지만, 이러한 바이러스는 어린이, 노인 및 면역 저하자를 포함한 위험에 처한 인구 집단에서 더 심각한 하기도 질환을 유발할 수 있습니다 3,4. 중증급성호흡기증후군(SARS)-CoV, 중동호흡기증후군(MERS)-CoV, SARS-CoV-2 등 3가지 병원성 HCoV가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중보건 비상사태를 일으켰습니다. 치명적 HCoV는 더 심각한 호흡기 병리와 관련이 있으며, 이는 MERS-CoV 사례와 관련된 >34%의 치사율(2012년 출현 이후 2,500건 이상의 사례에서 894명 사망)5,6으로 명확하게 설명됩니다. 또한 현재 진행 중인 COVID-19 팬데믹에서 볼 수 있듯이 치명적인 HCoV는 무증상 감염에서 치명적인 폐렴에 이르기까지 다양한 호흡기 질환을 유발한다는 점에 유의해야 합니다7.
HCoV는 다른 호흡기 병원체와 마찬가지로 호흡기로 들어가 비강 상피에 생산적인 감염을 일으킨다8. 하기도로의 전이는 구강/비강에서 폐로의 흡인과 관련이 있는 것으로 생각되며, 여기서 HCoV는 더 심각한 하기도 병리를 유발한다 9,10,11. 따라서, 코는 바이러스 진입을 위한 초기 관문 역할을 하며, 강력한 점액섬모 제거 기계와 하부 기도로의 바이러스 확산을 막기 위한 독특한 선천성 면역 기전을 통해 감염에 대한 주요 장벽이 된다12,13. 예를 들어, 비강 상피세포는 항바이러스 인터페론 및 인터페론 자극 유전자의 평균 기초 수준보다 높은 발현을 하는 것으로 보고되었으며, 이는 비강 세포가 호흡기 바이러스에 대한 조기 반응을 위해 준비될 수 있음을 나타냅니다14,15,16.
우리는 이전에 HCoV 감염이 시작되는 코에서 HCoV-숙주 상호 작용을 모델링하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI)에서 성장한 환자 유래 일차 비강 상피 세포를 활용했습니다. 비강 ALI 배양은 병원성(SARS-CoV-2 및 MERS-CoV)과 일반적인 HCoV(HCoV-NL63 및 HCoV-229E) 모두에 허용되며 A549(폐 선암 세포주)16,17와 같은 기존 기도 상피 세포주에 비해 다양한 이점을 제공합니다. 분화 후, 비강 ALI 배양물은 이질적인 세포 집단을 포함하며, 점액섬모 청소 기계(mucociliary clearance mechanism)와 같은 생체 내 비강 상피에서 기대되는 많은 기능을 나타낸다18. 또한 비강 세포는 하부 기도 배양 시스템(예: 인간 기관지 상피 세포, HBEC)에 비해 이점을 제공하는데, 이는 세포학적 칫솔질을 통한 비강 상피 세포 획득이 HBECs 19,20,21을 얻기 위해 기관지 내시경과 같은 기술을 사용하는 것에 비해 훨씬 덜 침습적이기 때문입니다.
이 논문은 이 비강 ALI 배양 시스템을 활용하여 비강 상피에서 HCoV-숙주 상호작용을 특성화하는 방법을 설명합니다. SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 및 HCoV-229E를 비교하기 위해 최근 발표된 연구에서 이러한 방법을 적용했습니다 1,16,17. 이러한 방법과 대표적인 결과는 이 비강 세포 모델에서 HCoV에 대한 연구를 강조하지만, 이 시스템은 다른 HCoV 및 기타 호흡기 병원체에 매우 잘 적응합니다. 또한, 이러한 방법은 바이러스 복제 및 세포 영양성뿐만 아니라 감염 후 세포 독성 및 선천성 면역 유도를 조사하기 위해 다른 ALI 배양 시스템에 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endohm-6G measurement chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9326-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW software for imaging</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCoV-NL63 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40641-V07E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLC-MK2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-7</td>
			<td>To titrate HCoV-NL63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012)</td>
			<td>BEI Resources&#160;</td>
			<td>NR-44260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV nucleocapsid antibody</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40068-MM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC5AC antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMAB91539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647 stain</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH34000000</td>
			<td>Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>89990</td>
			<td>Can prep in-house or purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-52281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX135357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV &#946;- tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroCCL81 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>To titrate MERS-CoV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroE6 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td>To titrate SARS-CoV-2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infection of primary nasal epithelial cells grown at an air-liquid interface to characterize human coronavirus-host interactions

SARS-CoV(2002년), MERS-CoV(2012년), SARS-CoV-2(2019년)의 세 가지 고병원성 인간 코로나바이러스(HCoV)가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중 보건 위기를 초래했습니다. 매년 4개의 추가 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)가 일반적인 감기 사례의 상당 부분을 유발하며, 이는 생리학적으로 관련된 시스템에서 이러한 바이러스를 연구하는 것의 중요성을 강조합니다. HCoV는 호흡기로 들어가 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 부위인 비강 상피에 감염을 일으킵니다. 당사는 환자 유래 비강 샘플이 공기-액체 계면(ALI)에서 배양되는 1차 비강 상피 배양 시스템을 사용하여 이 중요한 감시 부위에서 숙주-병원체 상호 작용을 연구합니다. 이러한 배양은 존재하는 세포 유형, 섬모 기능 및 점액 생성을 포함하여 생체 내 기도의 많은 특징을 요약합니다. 치사량과 계절성 HCoV를 비교한 최근 연구를 예시1로 사용하여 HCoV 감염 후 비강 ALI 배양에서 바이러스 복제, 숙주 세포 영양성, 바이러스 유도 세포 독성 및 선천성 면역 유도를 특성화하는 방법을 설명합니다. 코에서 숙주-병원체 상호 작용에 대한 이해가 높아짐에 따라 HCoV 및 향후 등장할 가능성이 있는 기타 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 치료제의 새로운 표적을 제공할 수 있습니다.

대표적인 수치는 원고 Otter et al.1에서 찾을 수 있는 데이터에서 부분적으로 각색되었습니다. 4명 또는 6명의 기증자로부터 유래한 비강 ALI 배양은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 4가지 HCoV(SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 및 HCoV-229E) 중 하나에 감염되었으며, 각 바이러스에 대한 평균 정점 탈락 바이러스 역가는 그림 1A에 나와 있습니다. 이 4가지 HCoV는 모두 비강 ALI...

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Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

비강 상피는 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 장벽 부위입니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 시스템에서 인간 코로나바이러스-숙주 상호 작용을 특성화하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 성장한 일차 비강 상피 세포를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하기 위해 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포의 감염

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

1.1K 조회수.  University of Pennsylvania. 비강 상피는 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 장벽 부위입니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 시스템에서 인간 코로나바이러스-숙주 상호 작용을 특성화하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 성장한 일차 비강 상피 세포를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

비디오: Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

연구

면역학 및 감염병학

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...