Bu protokol, in vivo çalışmalardan önce aşı immünojenitesini ölçmek için sığır monosit türevi dendritik hücrelerin kullanıldığı fonksiyonel bir in vitro tahlili temsil eder. Bu nedenle, hayvancılık aşısında mevcut bir boşluğu doldurmak. Dendritik hücrelerin üretilmesi ve uygulanmasıdır.
En güçlü antijen sunan hücreler olan dendritik hücreler, aşı etkinliği de dahil olmak üzere hücre içi bağışıklık mekanizmalarını anlamak için kilit bir araştırma hedefi haline gelmiştir. Bu tahlil, aşı adaylarının taranmasında bir araç olarak, aşı üretimi için bir kalite kontrol durumu olarak ve antijen ve adjuvan seçimi için uygulanabilir. Prosedürü gösteren, hayvansal üretim ve sağlık laboratuvarında bilim adamı Richard Kangethe olacak.
Baldırın juguler ven delinmesinden elde edilen kanı heparinize vakumerlerle ters çevirerek ve karıştırarak başlayın. Daha sonra 20 mililitre heparinize kanı steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ile seyreltin. Pipet, 15 mililitre lenfosit izolasyon ortamını steril 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve tüpü 45 derecelik bir konuma getirin.
25 mililitrelik bir pipet kullanarak lenfosit izolasyonunun üzerine 30 mililitre kan PBS ortamını dikkatlice katlayın ve santrifüj etmeden önce tüpü yavaşça dikey konuma getirin. Daha sonra bir Pasteur pipeti kullanarak ince beyaz periferik kan mononükleer hücre tabakasını veya PBMC tabakasını toplayın ve yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Hasat edilen PBMC'leri yıkama başına 40 mililitre PBS kullanarak iki kez yıkayın ve iyice karıştırın.
Santrifüjlemeden sonra, pelet 15 mililitre amonyum klorür potasyum tamponu veya ACK tamponunda tekrar askıya alın. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakikalık inkübasyondan sonra, 40 mililitreye kadar PBS ekleyin ve tüpü maksimum hızlanma ve yavaşlama ile santrifüj edin. Peleti 10 mililitre tam kültür ortamında tekrar askıya alın.
Daha sonra 10 milyon hücre başına beş mikrolitre CD14 MicroBead tamponu ekleyin ve bir pipet kullanarak iyice karıştırın. Akış sitometri analizi için, PBMC'lere 10 mikrolitre CD14 floresein izotiyosiyanat veya FITC boyama antikoru ekleyin ve akış sitometrisine devam etmeden önce dört ila sekiz santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin. Lekesiz PBMC'lere, bir mililitre faks arabelleği ekleyin ve 500 g ve dört santigrat derecede yedi dakika boyunca santrifüj edin.
Daha sonra peleti 100 milyon hücre başına 500 mikrolitre faks tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra, immünomanyetik hücre ayırma kolonunu separatöre yerleştirin ve akışı toplamak için kolon çıkışının altına 50 mililitrelik bir toplama tüpü yerleştirin. Kolonu bir mililitre gazdan arındırılmış faks tamponu ile yıkadıktan sonra, kullanılmış 15 mililitrelik tüpü yenisiyle değiştirin.
Bir seferde 500 mikrolitre tamponda yüz milyon hücreyi pipetleyin, hücre süspansiyonunun kolondan geçmesine izin verin. Ardından, her seferinde üç mililitre gazdan arındırılmış faks arabelleği ile sütunu üç kez durulayın. Akış boyunca toplandıktan sonra, ilk salınımlı naif lenfosit fraksiyonunu CD14 negatif hücre fraksiyonu olarak etiketleyin.
Kolonu separatörden çıkarın ve atık su toplama için kolonun altına yeni bir steril 15 mililitrelik tüp yerleştirin. Sütuna beş mililitre faks arabelleği ekleyin ve pistonu kullanarak hemen itin. İkinci akış veya naif monosit fraksiyonunu CD14 pozitif hücre fraksiyonu olarak toplayın ve etiketleyin.
Mililitre başına 1 milyon hücreye ulaşmak için hasat edilen CD14 pozitif monositlere tam kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, steril 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna, her bir kuyucuğu kit içinde sağlanan 40 mikrolitre sitokin kokteyli ile takviye etmeden önce bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. İkinci günde, her bir kuyucuğun içeriğinin yarısını bir pipet kullanarak ayrı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.
1.5 mililitrelik tüpleri yedi dakika boyunca 500g'de santrifüj ettikten sonra, süpernatantı atın ve peleti 500 mikrolitre taze tam kültür ortamında yeniden askıya alın. Bu yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini karşılık gelen kuyucuklara geri aktarın, böylece kuyudaki son hacim bir mililitre olur. Her bir kuyucuğu 20 mikrolitre sitokin kokteyli ile zenginleştirin.
Antijen darbeli MoDC'ler üretmek için, 24 kuyucuklu plakadaki bir mililitre naif MoDC kültürüne mililitre kuduz virüsü aşısı veya RV süspansiyonu başına bir mikrolitre ekleyin ve plakayı% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede 48 saat boyunca inkübe edin. Yedinci günde, antijen darbeli MoDC'leri içeren 24 kuyucuklu plakayı, kuyu başına bir mililitre buz gibi soğuk PBS eklemeden ve iyice karıştırmadan önce 10 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Kuyucukları iki mililitre buz gibi PBS ile yıkayın. Her bir kuyucuktaki artık hücreleri toplayın ve yıkanmış içeriği kendi tüplerine aktarın. Hücre süspansiyonunu yedi dakika boyunca 500g'de santrifüj edin.
Süpernatanı attıktan sonra, mililitre başına 100.000 hücrenin nihai konsantrasyonunu ayarlamak için antijen darbeli MoDCs hücre peletini tam bir kültür ortamında yeniden askıya alın. MoDC-lenfosit ko-kültürü için, antijen nabzının yedinci gününde steril 24 delikli bir plakanın kuyularını, bir mililitre naif lenfosit hücre süspansiyonu ve bir mililitre antijen darbeli veya antijen darbeli olmayan MoDC süspansiyonu ile tohumlayın. İki günlük inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğu mililitre rekombinant interlökin-2 başına 20 nanogram ile destekleyin ve inkübasyona 120 saat daha devam edin.
14. günde, ortak kültürün bir mililitresini steril 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü santrifüj edin. Daha sonra hücre peletini bir mililitre antijen darbeli veya darbesiz MoDC'lerle yeniden askıya alın. İyice karıştırın ve hücre süspansiyonlarını karşılık gelen kuyucuklarına aktarın.
PBMC'lerin ve naif lenfositlerin ve monositlerin hücre yüzeyinde boyanmasından sonra, hücre süspansiyonunun bir mililitresini bir pipet ve santrifüj kullanarak 500 g'da 10 dakika boyunca steril 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra peleti bir mililitre PBS'de tekrar askıya alın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ayrıca artık hücreleri ve ilgili tüpleri bir mililitre PBS kullanarak toplayın.
Daha sonra hücreleri içeren 15 mililitrelik tüpe 10 mililitre PBS ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Tüpü 850g'de yedi dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, süpernatantı çıkarın ve süpernatanı boşalttıktan sonra kalan artık süspansiyonla hücre peletini dikkatlice yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu V tabanlı 96 delikli bir plakaya aktarın ve dökülmeyi önlemek için kuyucukları kapatın.
Boyama tamamlandıktan sonra, akış sitometresi analizini gerçekleştirin. Gerçek zamanlı önizlemeden, voltaj, kazanç ve hücre boyutu dahil olmak üzere floresan eşiğini ayarlayarak sonunda herhangi bir hücresel enkazı hariç tutarken istenen hücre popülasyonunun etrafına kapılar çizin. CD14 hücre boyama ve akım sitometrisi, naif monosit fraksiyonunun %98 CD14 pozitif monosit hücreden oluştuğunu ve fonksiyonel olarak antijen alımı yapabildiğini göstermiştir.
MHC Sınıf 2 ve yardımcı uyarıcı CD86 ve CD40 hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirerek fenotipik olarak karakterize edilen naif MoDC'ler, dendritik hücreleri veya DC benzeri fenotipi doğruladı. Dokuzuncu günde MoDC lenfosit ko-kültürü sırasında, RV darbesinde MoDC'lere dendrit yayılımını gösteren morfolojik bir değişiklik gözlendi. Darbeli olmayan MoDC lenfosit kültürü ile karşılaştırıldığında, pulse MoDC lenfosit ko-kültüründe 16. günde CD4 pozitif ve CD8 pozitif T-hücreleri üzerindeki Ki67 ve CD25 aktivasyon belirteçlerinin upregülasyonu ile lenfosit proliferasyonunda anlamlı bir artış gösterilmiştir.
Olgun RV darbeli MoDC ko-kültürlerinden CD8 pozitif T hücreleri, spesifik olmayan gruba kıyasla Ki67'nin sekiz kat yukarı regülasyonunu sergiledi. Aynı kokültürdeki CD4 pozitif hücreler, kontrollere kıyasla Ki67'de yedi kat artış gösterdi, bu da RV astarlanmış MoDC'lerin RV antijenini naif lenfositlere sunma ve bunları in vitro bir durumda aktive etme yeteneğini gösterdi. Ko-kültürlerin qPCR ölçümü, GAPDH'yi kalibratör olarak kullanan tüm ko-kültürlerde interferon gama ekspresyonunda% 30'dan fazla artış ve Ki67 ekspresyonunda% 5'ten fazla artış göstermiştir.
RV darbeli MoDC lenfosit ko-kültüründe, spesifik olmayan tedavi grubuna kıyasla anlamlı derecede daha yüksek salgılanan interferon gama konsantrasyonu gözlendi. Katmanlama adımını çok yavaş ve dikkatli bir şekilde gerçekleştirin, kanın lenfosit izolasyon ortamının üzerine serilmesini sağlayın. Diğer katmanlardan çok fazla malzeme toplamadan tüm PBMC'leri toplamak için ekstra dikkatli olun.
Flow sitometri, ELISA ve kantitatif PCR gibi diğer yöntemler, diğerlerinin yanı sıra, immün belirteçlerin aktivasyonunu değerlendirmek için bu işlemden sonra uygulanabilir.
