Kehanetler, bakteri genomlarına entegre olmuş bakteri fajlarıdır. Kehanetlerin bakteri konakçılarının biyolojisi üzerindeki etkisini kapsamlı bir şekilde araştırmak için transkriptomik bir yaklaşım kullanıyoruz. Burada açıklanan yöntemler, kehanet litik döngüsünün spontan indüksiyonunun temel zorluğunu ele almaktadır.
Kültür koşullarının dikkatli bir şekilde optimizasyonu, kehanet durumu sırasında gen ekspresyonunun temiz bir şekilde profillenmesini sağlar. Kehanetler çoğu bakteriyel patojende bulunur, ancak önemi genellikle anlaşılmamıştır. Bu araçlar, kehanetlerin çoklu bakteri fonksiyonlarının düzenleyicileri olarak rolünü aydınlatabilir.
Çalışılmamış kalan neredeyse sınırsız kehanet ev sahibi ilişkileri vardır. Bu, bu protokollerin tahmin edilmesine yardımcı olabileceği, kullanılmayan büyük bir potansiyel terapötik hedef kaynağını temsil eder. Temel zorluk, lizojen büyümesini ve spontan kehanet indüksiyonunu dengelemek için doğru kültür koşulunu bulmaktır.
İyi bilinen ikincil zorluk, lyson, aşağı akış çalışmaları için RNA bütünlüğünü korur. Başlamak için, gece kültürlerini 100 mililitre LB'de bire 100 oranında aşılayarak taze lizojen ve indikatör konakçı kültürleri oluşturun. 180 RPM'de çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin.
Lizojen büyümesini izlemek için, aşılama noktasından sekiz saat boyunca her saat başı bir mililitre numune toplayın. Seri olarak, 900 mikrolitre AG ortamına 100 mikrolitre ekleyerek kültürü seyreltin. Maksimum hızda girdap yapın ve seyreltme serisine 10'dan eksi bire 10'dan eksi dokuza kadar devam edin.
Gerekli seyreltmenin 10 mikrolitresini bir LB burgu plakasına yerleştirin. Kurumaya bırakın ve 30 santigrat derecede 18 ila 24 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, koloni sayısını sayın ve verilen formülü kullanarak canlı bakteri hücrelerinin sayısını hesaplayın.
Daha sonra, temporal numunedeki enfektif faj parçacıklarını numaralandırmak için, rifampisin ile birlikte erimiş üst burguya 100 mikrolitre log faz rifampisine dirençli indikatör konakçı hücre ekleyin. Aşılanmış üst burgu tabakasına 10 mikrolitre seri olarak seyreltilmiş lizojen kültürü yerleştirin. Kurumaya bırakılır ve 37 santigrat derecede 18 ila 24 saat inkübe edilir.
İnkübasyondan sonra, plak sayısını sayın ve verilen formülü kullanarak enfektif faj parçacıklarını hesaplayın. İlk şişeyi indüklenmemiş ve diğerlerini indüklenmiş olarak etiketleyin ve her bir numunenin hasat edilmesi gereken zaman noktalarını işaretleyin. Daha sonra, gece boyunca yetiştirilen lizojenik kültürleri, sekiz adet 250 mililitrelik şişelerde bir ila 100 oranında 80 mililitre LB içinde alt kültürleyin.
Şişeleri 37 santigrat derecede 180 RPM'de çalkalayarak inkübe edin. 90 dakika sonra, 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.1 ile 0.2 arasında olduğunda, indüklenmemiş şişeye dört mikrolitre% 1 buzlu asetik asit ekleyin. İndüklenmemiş şişeden 80 mililitrelik kültürü 720 mililitre LB'ye ekleyin ve RNA transkriptlerini stabilize etmek için şişeyi 30 dakika boyunca buza koymadan önce hemen 160 mililitre durdurma çözeltisi ekleyin.
Daha sonra, 80 mililitre kültür içeren indüklenmiş etiketli şişeye mililitre başına bir mikrogramlık bir son konsantrasyonda norfloksasin ekleyin. İyice karıştırın ve 37 santigrat derecede 180 RPM'de bir saat çalkalayarak inkübe edin. 720 mililitre LB'ye 80 mililitre indüklenmiş kültür ekleyerek hücrelerin iyileşmesine izin verin. Bir durdurma çözeltisi ekleyerek her şişeden bakteri hücrelerini her 10 dakikada bir sıfırdan bir saate kadar hasat edin.
Dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ayarlanabilir otomatik pipeti kullanarak peleti kalan sıvıda nazikçe yeniden süspanse etmeden önce. Süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede bir dakika boyunca 13.000 G'de santrifüjleyin.
Kalan süpernatanı atın ve peletleri sıvı nitrojene hızlı dondurmadan önce mikrofüj tüpünü kapatın. Her donmuş pelete bir mililitre Trizol ekleyin ve pipetleme ile süspansiyonu homojenize edin. İlgilenilen fajın replikasyonunun her aşaması için belirteç görevi görebilecek bir dizi hedef gen belirledikten sonra, ilgili primerleri kullanarak genomik DNA'dan hedef genlerin her birini çoğaltın.
Metin makalesinde açıklanan amplifikasyon koşullarını kullanarak PCR gerçekleştirin. PCR'den sonra, bir PCR saflaştırma kiti kullanarak her bir amplikonu saflaştırın ve üreticinin talimatlarına göre bir TA klonlama vektöründe klonlayın. Klonlanan her ürünün sırasını Sanger dizilimi ile doğrulayın.
Dört ayrı plazmitin kopya sayısını hesapladıktan sonra, plazmit DNA'yı nükleaz içermeyen suda seri olarak seyrelterek her bir işaretleyici gen için standart bir şablon hazırlayın. 96 oyuklu bir plakada her hedef için bir mikrolitre CDNA ve ilgili plazmit standartlarını ekleyin. Ve üreticinin talimatlarına göre kantitatif PCR gerçekleştirin.
PCR'den sonra, günlük DNA kopya numarasını döngü eşiğine göre çizmek için Excel programını kullanın. Belirleme katsayısını ve doğrusal bir denklemi görüntülemek için doğrusal bir regresyon hesaplaması gerçekleştirin. Ardından, doğrusal regresyondan türetilen doğrusal denklemi kullanarak her hedef için kopya sayısını tahmin edin.
Ardından, standart eğrinin doğrusal regresyonundan ve verilen denklemden elde edilen parametreleri kullanarak PCR amplifikasyonunun etkinliğini hesaplayın. Primerleri yüzde verimlilikleri açısından doğruladıktan sonra, DNA'nın mutlak kopya sayısını hesaplayın. Spontan daha az kehanet üretiminin zamansal sayımı, hücre başına en düşük PFU sayılarını iki saatte ve hücre başına en yüksek PFU sayılarını altı saatte önerdi.
Lizojen daha sonra iki saatte en stabildi. Bu nedenle bu koşul QRTPCR profillemesi için kullanıldı. İndüklenmemiş kültürlerde 2.31 kez 10'dan dokuzuncu kopyaya litik replikasyonun erken bir belirteci olan cro geninin ekspresyonunda, indüksiyondan 30 dakika sonra 3.02 kez 10 ila 11. kopyalara belirgin bir artış gözlendi.
Benzer şekilde, litik replikasyonun orta aşama belirteci olan P ve O proteinleri de sırasıyla 1.74 çarpı 10'dan sekizinciye 1.25 çarpı 10'a ve 6.05 çarpı 10'dan ikinciye 5.68 çarpı 10'dan beşinci kopyaya önemli bir yukarı regülasyon gösterdi. Litik replikasyon döngüsünün geç belirteci, indüklenmemiş kültürlerde ekspresyonda indüksiyondan 30 dakika sonra önemli bir artış gösterdi. Test edilen dahili kontroller arasında RPOD, 16 SRNA veya ProC genine kıyasla en kararlı ekspresyona sahipti.
Litik replikasyon belirteçleri ile karşılaştırıldığında, C-on geninin ekspresyonu nispeten stabildi. Yine de, C-one geninin kopya sayısı, indüklenmemiş kültürlerde, litik replikasyon belirteçlerine kıyasla güven verici derecede yüksekti. Kötü hazırlanmış bir RNA kütüphanesinden iyi bir veri veya yorum gelemez.
Spontan indüksiyon ve RNA bütünlüğünü kontrol etmek en önemli şeylerdir. Herhangi bir genin zamansal dinamiği, ekspresyon profili kullanılarak incelenebilir. Doğru deneysel koşulları ve zaman noktalarını uyarlamak, herhangi bir uyarana biyolojik tepkileri doğru bir şekilde haritalamak için önemlidir.
Bu teknik, iki farklı kehanet konak ortaklığı arasında daha önce bilinmeyen etkileşimleri tanımlamıştır. Çoğu bakteri çalışılmamış kehanetleri barındırdığından, bu yaklaşım birçok yeni terapötik hedefin veya uygulamanın keşfedilmesine yardımcı olabilir.
