Bu çalışmada Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı Hibe 5-2007-97 (VEP), Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen hibe R01DK064973 (VEP), R01DK48494 (LHP), T32DK07074 (SCE destekleyen), K01DK083552 (MDK) ve Chicago Üniversitesi Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi için P60DK20595 tarafından. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIDDK veya NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Pre-enjeksiyon Hazırlıkları <ol><li> Enjeksiyon için en az 24 saat önce Hızlı balık. Bu bağırsak ampul (mide) içeriğini boşaltmak olacaktır. Temel açlık protokol temiz bir tank, kendi normal yoğunlukta balık transferi için, daha sonra gıda kesintisi. (Örneğin, kan şekeri çalışmaları için) daha sıkı şartlar gerektirir, uzun süreli açlık, Tartışma ek konuları bakın. </li><li> Cortland tuz solüsyonu (Perry ve ark, 1984) hazırlayın. Distile su ile 100 mL hacim için aşağıdaki çözülür: 725 mg NaCl (124.1 mM) 38 mg KCl (5.1 mM) 41 mg Na 2 HPO 4 (2.9 mM) 24 mg MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1.9 mM) 16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1.4 mM) 100 mg NaHCO 3 (11.9 mM) 4 g Polyvinylpyrrolidone (PVP) (% 4) 1.000 USP birimleri Heparin Filtre, sterilize ve 4 saklamak ° C </li><li> Mikroskop hazırlayın. <ul><li> Mikroskop tabanı dökülmeleri durumunda koruma için naylon ile örtün. </li><li> Plastik wrap üstüne bir kağıt havlu koyun. Cerrahi tablo kağıt havlu üstüne oturacak. </li><li> Ön ayarlamak cerrahi tablo görüntüleme ve sünger odaklanarak odağı. </li></ul> İpucu: sünger üstüne parmağınızı koyun ve odaklanın. Balık cerrahi masaya bir kez Bu odak ayarı ortadan kaldırmak veya en aza indirecektir. </li><li> Balık tartılır. <ul><li> , Yaklaşık 1 / 3 balık tesisi su ile dolu bir 500 ml beher doldurun. </li><li> Dara dengesi. </li><li> Net kullanarak balık toplayın. Net ve kısa bir süre kağıt havlu üzerinde net dabbing balık uzak aşırı su Wick. Balık behere aktarın. </li><li> Balık tartılır. </li><li> Temiz bir tank için balık aktarın. </li><li> Kendi etiketli tankına her tartılır balık aktarın. </li><li> Balık ağırlığına göre her bir balık için enjeksiyon hacmi hesaplayın. </li></ul></li><li> Şırınga ve enjeksiyon ekipmanı hazırlayın. Enjeksiyon için, 35G Eğimli çelik iğne ve 10 ul NanoFil mikroenjektör tavsiye ederiz. Üreticinin talimatları izleyerek NanoFil şırınga ve silflex tüp hazırlayın. Şırınga ve tüp herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için önemlidir. Şırınga ve tüp dolum sonra, pompa şırınga monte ve program ilk balık için enjeksiyon hacmi. </li><li> Cerrahi bir tablo hazırlayın. <ul><li> Yüksekliği yaklaşık 20 mm, böylece yumuşak bir sünger (# L800-Ge, Jaece Industries gibi) kesin. Düz yüz, 10-15 mm derinliğinde bir kesim olun. Bu kesim, enjeksiyon için balık tutacak çukur. </li><li> 60 mm Petri kabı içine sünger ayarlayın. </li><li> Petri kabı, uygun büyüklükte bir pipet ucu kutusu kapağının içine sünger ile ayarlayın. Kapak sünger sıcaklık korumaya yardımcı olmak için su tutmak için yeterli büyüklükte olması gerekiyor, ancak bu şekilde almak için yeteri kadar sığ olmalıdır. Biz 11,4 cm L x 7,7 cm G x 1,5 cm olan bir P200 uç kutusu kapağı D. </li></ul> (Petri kutusu kapağı sünger) birlikte monte Bu üç öğe, cerrahi tablo oluşturmaktadır. </li><li> Anestezik hazırlayın. <ul><li> Balık tesisi su ezilmiş buz küpleri kullanarak olun. </li></ul> İpucu: Tipik bir buz küpü tepsisi kullanarak, 10-12 balık uyutmak için 3 tepsi alacak. <ul><li> Temiz bir buz kovası ezilmiş buz doldurun. </li><li> Cerrahi tablo 2.4 litre Rubbermaid gıda saklama kabı gibi daha büyük bir kap içine koyun. </li><li> Tesisin su (sıcak) bazı dış kabı ve cerrahi tablo içine dökün. Ayrıca, sıcak tesisi su rezervi Yakın tutun. </li><li> Dış kabı içine bir termometre koyun. </li></ul></li></ol> 2. Anestezi, Enjeksiyon ve Kurtarma <ol><li> Anestezik dış kabı artı mikroskop bitişik cerrahi tablo yerleştirin. Yakındaki kova buz yongaları var. </li><li> Için su sıcaklığı 17 ° C buz yongaları ekleyerek getir. Önemli: Bu adım için 17 ° C altına gitmeyin. </li><li> Net dış kabı balık aktarmak için kullanın. </li><li> Yavaş yavaş, 12 ila sıcaklığı düşürmek için ° C, birkaç dakika boyunca. Konteyner buz yongaları eklemek </li><li> Monitör balık davranış: 17 ° C veya biraz daha düşük, balık, genellikle yatay pektoral yüzgeçler yaymak gasp ve hızlı operculum&#39;un hareketleri var. Sıcaklığı düşer gibi, balık yüzme molası daha yavaş ve nihayet yüzebilir. Anestezi, cerrahi düzlemine yaklaştı olduğu gibi, nefes nefese duracak ve operculum&#39;un hareketleri yavaş olacaktır. Ele alınması tepki vermezse ne zaman balık enjeksiyon için hazır. En çok balık, 12 ° C yeterlidir. Büyük balık, soğuk wa gerekebilirter. </li><li> Gerekli sıcaklık doyurmak için sünger (~ 12 ° C veya soğuk), basın ulaşılır. </li><li> Parmaklarınızı balık sıcak ve taşıma sırasında anestezi çıkarmak olacağını yeterince soğuk su tutun. </li><li> Soğuk parmakları ile hafifçe çukur sünger balık transferi. Çukur, karın ve solungaçları ile balık yerleştirin. </li><li> Mikroskop aşamasına cerrahi tablo hızla aktarın. </li><li> Hızlı çalışma, dikkatle pelvik yüzgeçler arasındaki orta hat içine iğne takın. İğne cranially işaret etmelidir ve anüs daha yakın pelvis eklenebilir. Iğne vücut duvarına derin hissetmek gerekir. Uygun hacim enjekte edilir ve iğneyi çıkartın. </li><li> Enjeksiyondan sonra, hemen geri balık transferi sıcak su (~ 28.5 ° C), tank su üzerine sünger balık serbest kurtarma için tankı. İpucu: balık yüzme hemen başlamazsa, solungaçları doğru yavaşça su dönen kurtarmak için yardımcı olur. </li><li> Iğne kontrol edin. Bazen bir ölçekte bağlı olabilir ve bir sonraki enjeksiyon önce çıkarılmalıdır. </li><li> Sonraki enjeksiyon için geri anestezi odasına su sıcaklığı 17 ° C sonraki balık tanıtmadan önce getirmek için, sıcak tesisi su kullanmayın. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1, 0.5 mg / g glikoz veya araç intraperitoneal aşağıdaki Temsilcisi sonuçları . Balık enjeksiyon için 72 saat önceden içirildi. X-ekseni zamanı, enjeksiyon sonrası gösterir. Ortalama ± SEM.

<ol>
	<li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G., Hoar, W. S., Randall, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+methods+for+the+study+of+gill+physiology.">Perfusion methods for the study of gill physiology.</a> Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. , 325-388 (1984).</li><li>Brown, L. A., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+restraint.">Anesthesia and restraint.</a> Fish Medicine. , 79-90 (1993).</li><li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis.">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li><li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L.">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li><li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish.">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li><li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A., Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetics.">Anaesthetics.</a> Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. , 1-15 (1994).</li><li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish.">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li><li>Stoskopf, M. K., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery.">Surgery.</a> Fish Medicine. , 91-97 (1993).</li></ol>

Intraperitoneal beş adımları içerir:, açlık, tartma,, enjeksiyon ve kurtarma anestezi. Her adım için en iyi uygulamaların başarıya ulaşmasını sağlamak olabilir vardır. Başarı, sağlıklı bir balık hasta yanı sıra iyi bir deneysel sonuç içerir. Oruç: 24-saatlik hızlı bağırsak ampul boşaltmak gerekir. Bu uygulama balık veteriner edebiyatı (örneğin, Brown 1993) alınmıştır. Ek açlık hususlar aşağıda tartışılmıştır. Uzun vadeli oruç: Biz bir 72 saatlik hızlı enjeksiyondan önce temel düzeyde kan şekeri azaltmak için gerekli olduğunu bulduk (Eames ve ark, 2010). Ayrıca glikoz çalışmalar için balık düzgün oruç tuttuklarını olduğundan emin olmak için gerekli olan çok sayıda prosedür olduğunu bulduk. (Alt kısmında hiçbir enkaz) temiz bir tank ile başlayın. Tanklar açıkça &#39;açlık&#39; olarak etiketlenmiş, çevrimdışı olmalıdır ve bir yerde coşkulu balık bakım personeli onları beslemek olmaz. Tankın dış çevre değerlendirin ve stres, kan şekeri (Chavin ve Young, 1970; Groff ve ark, 1999) yükseltmek için bilindiği gibi bozuklukları vurguladı olan balık önlemek için adımlar atması . Örneğin, bir radyo, her gün balık tankları tutuyordu bankta ameliyat edildi açlık deney vardı. Biz kan şekeri alışılmadık derecede yüksek olduğu ve balık titreşimler tarafından vurgulandı olduğu sonucuna varıldı bulundu. Başka bir stres aşırı kalabalık. Balık, iyi balık yetiştiriciliği uygulamaları ile uyumlu bir yoğunluk tutulmalıdır. Öneriler için, bkz. Brand ve ark . (2002) ve Westerfield (1995). Biz, 9 litrelik tank (3 kat mermerler bu hacim kaplıyor ile) 10-12 balık bir yoğunlukta balık açlık iyi sonuçlar oldu. Cinsiyetlerin ayrılması strese neden olabilir, bu yüzden hızlı sırasında seks karışık bir nüfusu korumak öneririz. Bu yumurta döşenebilir anlamına gelir ve yumurta yedikleri olmayacak böylece sekestre gerekir. Yumurta ayırmak için basit bir yolu, 2-3 kat mermer ile tank alt kapağı. Su kalitesi, yumurta ve atık kaldırma ve günlük yaklaşık% 10-15, tank suyu değiştirerek bakıma ihtiyacı vardır. Sifon, yumurta ve atık çıkarmak için iyi çalışır. Tartım: anestezi değil balık tartım, hassas tartım sağlamak için, beher içine net su transferi en aza indirmek için alınması olmalıdır. Net (balık), kağıt havlu, lekelenen ise, aşırı su çoğunluğu kaldırılmış olabilir ve ağırlığını doğru olarak ölçülebilir. Önce ağırlığında balık uyutmak için daha kolay olabilir, ama biz bir gün içinde iki kez balık anestezi olası etkileri test etmedim. Biz anestezi yapıldıktan sonra yeniden ağırlığında balık daha sonra file / blot yöntemi ile ilk balık ağırlığında bizim teknik test ve hafifçe kuru lekelenen. Ağırlık yöntemleri arasında anlamlı bir fark bulundu (P = 0,7927, t-testi). Ayrıca, biz bu file / (yok blot) düşülmektedir gibi sadece en kısa sürede beher balık transferi ile karşılaştırıldığında, blot yöntemi etkilenen kan şekeri olmadığını test etti. Biz iki transfer yöntemleri arasında kan glikoz düzeyi açısından anlamlı bir fark bulundu (P = 0,2241, t-testi). Anestezi: Kimyasal anestezi birçok çalışmalar için uygun olabilir. Burada birçok anesteziklerin (tricaine/MS-222 (Brown, 1993) dahil), kan şekeri yükseltmek için, alternatif olarak soğuk su anestezi göstermiştir. Daha önceki çalışmalarda, soğuk su kan şekeri (Eames ve ark, 2010) zebrafish yükseltmek değil yaptığı tespit ettik. Soğuk su anestezi için, sıcaklık yavaş yavaş azaltılmalıdır. Düşüş oranı, küçük balık büyük balık daha hızlı altında gidiyor, balığın büyüklüğüne bağlı görünüyor. Enjeksiyonu takiben, balık (aşağıya bakın) anestezi çok yavaş iyileşmekte olduğunu gözlemleyebiliriz. Başlangıç ​​sıcaklığı sıcaklığı çok hızlı bir şekilde azalmıştır çok düşük, ya da zaman zaman da yol açabilir. Başlangıç ​​sıcaklığı suya girdikten sonra eğer yanal balık virajlarda çok düşük. Başlangıç ​​sıcaklığı doğruysa, balık başlangıçta dengesini koruyacaktır. Pektoral yüzgeçler, yatay konumda döndürmek gasp ve hızlı operculum&#39;un hareketleri var. Genellikle, yüzmek. Sıcaklık düştükçe, hareketleri azalacak ve balık denge kaybedersiniz. Balık tepki olmadan işlenebilir bir cerrahi anestezi düzlemine ulaşılır. Cerrahi anestezi altında balık korumak için, parmaklarınızı, soğuk olabilir, bu yüzden balık işleme önce su tutmak gerekir. Sünger balık anestezi için kullanılan suyun aynı sıcaklıkta soğuk muhafaza edilmelidir. Sufficie su ile sünger doyurmak için önemlidir.balık üzerine konulduğunda anesteziyi idame ettirmek için ntly soğuk. Enjeksiyon: üstlenen enjeksiyonları öncesinde, vücut duvar kalınlığı bir anlamda almak için en az bir balık incelemek isteyebilirsiniz. Bu karın boşluğuna girmek için iğne eklemek için ne kadar ihtiyacı yargılamak için yardımcı olabilir. Ayrıca, iğneyi, iğne karın boşluğuna girdiğinde vücut duvarı &quot;vermek&quot; hissedebilirsiniz. Enjeksiyon sırasında, hasta mutlu etmek için adımlar atın. Sünger enjeksiyon sırasında canlandırılması balık önlemek için doğru sıcaklık soğuk su ile doymuş olduğundan emin olun. Iyi doymuş ve yumuşak bir sünger, ölçekler ve cildi kaplayan mukus zarar en aza indirmek için önemlidir. İyi doymuş sünger solungaçları gazlı tutmak için de önemlidir. Biz çok Malzemeleri altında aşağıda listelenmiştir köpük sünger tavsiye ederiz. Son olarak, bir kez balık anestezi, balık altında olduğu zaman en aza indirmek için hızlı çalışır. Kurtarma: balık hemen hemen sıcak bir tankın su girdikten sonra anestezi kurtarmak gerekir. Balık kurtarma hız solungaçları doğru girdap su yavaşça hemen yüzme başlamazsa. Eğer toparlanmanın yavaş, sonra balık çok çabuk altında gitti ve uygun anestezi prosedürü ayarlamanız gerekir. Anestezi altında yavaş toparlanma olası nedenleri tartışılmıştır.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foam Sponge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jaece Industries</td>
<td>L800-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 mm Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipet tip box lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>not too deep, e.g. 1.5 cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic storage container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>deep, e.g. 7 cm </td>
</tr>
<tr>
<td>Thermometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crushed ice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>made from facility water</td>
</tr>
<tr>
<td>Warm facility water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 liter or more</td>
</tr>
<tr>
<td>500 ml beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for weighing</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoFil syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
<td>NANOFIL</td>
<td>or Hamilton syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>35 gauge needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>NF35BV-2</td>
<td>beveled</td>
</tr>
<tr>
<td>Silflex tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>SILFLEX-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III and Micro4 controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>UMPS-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foot switch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15867</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cortland salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intraperitoneal injection into adult zebrafish

Kimyasal zebrafish tedavi için uygun bir yöntem balık tarafından ele alınacak tank su, reaktif tanıtmak. Ancak, bu yöntem reaktif emilir veya balık başına ne kadar zor biliyor yapar. Metabolik çalışmalar özellikle de ilgili bazı deneysel sorular, ağırlığına göre her bir balık için belirli bir miktar sunarak daha iyi ele alınabilir. Burada yetişkin zebrafish içine intraperitoneal (IP) enjeksiyon için bir yöntem mevcut. Enjeksiyon, karın boşluğuna pelvis posterior. Bu prosedür, büyük balıklar için kullanılan veteriner yöntemler uyarlanmıştır. Biz sıfır mortalite gibi, güvenli. Ayrıca, 127 enjeksiyonlar sadece 5 enjeksiyon yerinde kanama, kanama ve bu vakaların her biri, kısa süreli, kalıcı birkaç saniye idi ve kan kaybı miktarı küçüktü. Bu yordamı ile Başarı, anestezi, enjeksiyon ve kurtarma ağırlığında, oruç da dahil olmak üzere birkaç adım ile balık nazik işleme gerektirir. Önlemler prosedür boyunca stresi en aza indirmek için gereklidir. Önlemler küçük bir enjeksiyon hacmi ve 35G iğne ile içerir. Biz Cortland tuz çözeltisi ozmotik tatlı su balıkları için dengeli bir araç olarak kullanırlar. Solungaçları Havalandırma, enjeksiyon sırasında suya doymuş bir sünger içinde bir çukur balık tutarak, yavaş operculum&#39;un hareketleri sağlayan bir cerrahi anestezi uçak, ilk balık getirerek enjeksiyon işlemi sırasında tutulur ve ikinci sırada yer alıyor. Biz, şekeri enjekte ve kan glikoz düzeyi yükselmeye ve normal bir sonraki geri izleme IP enjeksiyon yararını göstermektedir. Stres, teleost balık kan şekeri artırmak için ve Bilindiği gibi, araç-enjekte ve non-enjekte yetişkinlerde kan şekeri düzeylerini karşılaştırmak ve yordam kan şekeri önemli bir artışa neden olmadığını göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish at JoVE.com

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Biz yetişkin zebrafish intraperitoneal göstermektedir. Biz bir Micro4 denetleyicisi ve UltraMicroPump III tarafından kontrol edilen bir 10 ul NanoFil mikroenjektör kullanın. Bu gösteri, bir anestezik olarak soğuk su kullanımını içerir.

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

56.8K Görüntüleme.  The University of Chicago. Biz yetişkin zebrafish intraperitoneal göstermektedir. Biz bir Micro4 denetleyicisi ve UltraMicroPump III tarafından kontrol edilen bir 10 ul NanoFil mikroenjektör kullanın. Bu gösteri, bir anestezik olarak soğuk su kullanımını içerir.

Video: Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biyoloji

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Bayan A. aegypti Sivrisinek içine dsRNA enjeksiyon

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebra balığı Beyin Ventrikül Enjeksiyon

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...