Bildiğimiz kadarıyla, bu protokol fetal iskelet kasından desellülarize matrisler üreten ilk protokoldür ve utero'da gelişmeye başlayan miyopatileri incelemek için yeni bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, kas hücresi davranışını ve kontrollü bir ortamda hücre dışı matris ile etkileşimleri incelemek için kullanılabilecek gelişimsel ve dokuya özgü bir metrik oluşturur. LAMA2-CMD, doğumda ortaya çıkmaya başlayan konjenital bir kas distrofisidir.
Bu model, başlangıcında yer alan model mekanizmalarının çözülmesine yardımcı olabilir ve yeni hedef tedavilere yol açabilir. Bu protokol farklı doku ve hastalık modellerine uyarlanabilir. Matris ve hücre tiplerine bağlı olarak farklı karmaşıklık seviyeleri elde edilebilir, bu da sistemin çok yönlülüğünü gösterir.
Bu çok basit bir protokoldür. En zorlu kısım, numunelerin toplanması ve işlenmesidir. Ancak, uygulama ile teknik beceriler kolayca geliştirilebilir.
Her seferinde ötenazi yapılmış bir fetüsü buz gibi PBS içeren bir Petri kabına aktararak başlayın. Cildi ve uzuvları çıkardıktan sonra, göğüs kafesinin ventral tarafını kesin. Sternumu ve altta yatan organları çıkarın.
Fetüsleri dorsal tarafı yukarı doğru konumlandırın ve vertebral kolonun servikal kısmını çıkarın. Daha sonra, sırt yağ birikintilerini ve derin sırt kası bağ dokusunu tüketin. Şimdi, cerrahi forseps kullanarak göğüs kafesini sabitleyin.
Bir mikroneşterle, derin sırt kaslarını çevreleyen dokudan ayırmak için dikkatlice kazıyın. PBS'deki dokuları, gelecekte kullanmak üzere dört santigrat derecede 12 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında saklayın. Daha uzun bir süre boyunca, dokuyu eksi 80 santigrat derecede boş bir mikrosantrifüj tüpünde saklayın.
İlk gün, tüm epaxial kas kütlelerini kullanın. 12 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna% 1 penisilin ve streptomisin içeren üç mililitre hipotonik tampon ekleyin. Her bir kuyucuğa bir kas dokusu parçası ekleyin ve ajitasyonla 18 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.
İkinci gün, tamponu ince uçlu bir pipetle çıkarın. Şimdi numuneleri üç mililitre PBS ile üç kez yıkayın, her seferinde bir saatlik bir ajitasyonla. PBS'yi attıktan sonra, numuneleri üç mililitre% 0.05 SDS deterjan çözeltisinde 24 saat boyunca ajitasyonla inkübe edin.
Üçüncü günde, SDS deterjanını çıkarmak için ince bir uç pipeti kullanın ve parçaları her seferinde 20 dakikalık bir karıştırma ile üç mililitre hipotonik yıkama tamponu ile yıkayın. Kuyucukların çözeltisini iki mililitre DNaz çözeltisi ile değiştirin ve doku parçalarını ajitasyonla üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. DNaz çözeltisini çıkardıktan sonra, parçaları her seferinde 20 dakikalık bir ajitasyonla üç mililitre PBS ile üç kez yıkayın ve son yıkamayı gece boyunca bırakın.
Subconfluent C2C2C25 hücreleri ile tohumlanmış bir T-25 şişesine, 500 mikrolitre tripsin ekleyin ve bir mililitre tam ortamda yeniden askıya alın. Süspansiyonun 10 mikrolitresini 10 mikrolitre tripan mavisi boya ile karıştırın ve hücre sayısını saymak ve canlılığı tahmin etmek için bir hemositometreye yükleyin. Laminer akış başlığında, desellülarize matrisleri veya dECM'leri,% 1 penisilin ve streptomisin içeren PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
Bir mikroneşter ve cımbız kullanarak, matrisleri küçük parçalara ayırın. Parçaları 96 delikli bir plakanın kuyucuklarına aktarın ve kuyu başına üç ila dört parça yerleştirin. Her bir oyuğa 200 mikrolitre önceden ısıtılmış tam kültür ortamı ekleyin ve plakayı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin.
Ortamı kuyu plakasına atın ve her bir kuyucuğa 50.000 canlı C2C12 hücresi içeren 200 mikrolitre tam kültür ortamı ekleyin. Kuyu plakasını iki gün boyunca inkübe edin. dECM'leri hücrelerle birlikte 400 mikrolitre tam kültür ortamı içeren 48 kuyu plakasına aktarın.
Matris ayrılmasını önlemek için ortamı her iki günde bir dikkatlice aspire edin ve sekizinci güne kadar taze ortamla doldurun. Farklılaşma için, tüm kültür ortamını bir farklılaştırma ortamı ile değiştirin ve 12. güne kadar dört gün boyunca inkübe edin. Kas dokusu izolasyondan hemen sonra kırmızımsıydı ve hipotonik tamponda inkübasyondan sonra hücre lizisi nedeniyle beyaza döndü.
SDS kasların şeffaf hale gelmesine neden olur. DNaz tedavisinden sonra daha küçük, şeffaf bir dECM elde edildi. DNA miktarı, doğal dokuya kıyasla dECM'lerde yaklaşık% 100'lük bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır.
DECM'ler ve doğal doku, laminin alfa iki ve laminin proteini için benzer tübüler boyama gösterdi. Doğal dokunun Western blot analizi, laminin alfa iki alt birimi için iki bant gösterirken, dECM'de üç küçük bant tespit edildi. Toplam lamininler için, dECM örnekleri doğal dokuya kıyasla protein parçalanması gösterdi.
Fibronektin ve kollajen I, doğal doku hücreleri ile dECM'ler arasındaki interstisyel boşlukta mevcuttu. Her iki örnekte de benzer fibronektin bantları mevcuttu, bu da desellülarizasyondan etkilenmediğini gösteriyordu. dECM'lerde daha az kollajen I bandı gözlendi.
Kollajen IV için, her iki örnek de benzer boru şeklindeki boyama gösterdi. Bununla birlikte, dECM bantlarının moleküler ağırlığı daha düşüktü. C2C12 hücreleri dECM'lerde kolonize oldu ve çoğaldı ve çok çekirdekli miyotüplere kaynaştı.
Bunlar, farklılaşma ortamında dört günlük inkübasyondan sonra miyosin-ağır zincir proteinini ifade etti. Laminin alfa iki zinciri, total lamininler ve fibronektin için hücre içi ve perisellüler boyama gözlendi. Desellülarize fetal fare iskelet iskeleleri, ko-kültür sistemlerinde hücreleri büyütmek için kullanılabilir, bu da onu in vivo duruma yaklaştırır ve bu nedenle kas hastalığının anlaşılmasına katkıda bulunur.
