Platformumuz, aynı anda 24 kuyucukta kontraktiliteyi ölçmek için 3D mühendislik kas dokuları ve manyetik algılama donanımı kullanır. Bu, insan kas dokularını kullanarak in vitro olarak yeni terapötikleri değerlendirmek için daha yüksek bir verim yöntemi sağlar. Döküm yöntemimiz, 3D mühendislik kas dokularının imalatında tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği artırır.
Platformumuzda kontraktilite ölçümleri ve analizleri için manyetik algılama donanımı ile donatılmış 24 delikli bir sarf malzemesi döküm plakası tasarladık. Bu yöntem, kontraktiliteyi etkileyen herhangi bir kas hastalığı için in vitro hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve gen terapisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Şu anda nöromüsküler bir bağlantı modeli oluşturmak için motor nöronları 3D yapılarımıza dahil ediyoruz.
Başlamak için, önceden soğutulmuş bir doku döküm kitini, hücre kültürü başlığının içindeki soğuk bir bloğa veya buza yerleştirin. Döküm plakasını buz üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Trombin çözeltisini yapmak için taban ortamına trombin ekleyin ve post kafesi döküm plakasından yeni bir steril 24 delikli plakaya taşıyın.
Pipet, döküm plakasının önceden soğutulmuş her bir kuyucuğuna 50 mikrolitre trombin çözeltisi yerleştirin ve kafesi tekrar kit üzerine yerleştirin. Döküm kitini buz üzerinde bir kenara koyun. Daha sonra, kardiyak EMT ortamını hazırlamak için 500 mililitre RPMI ortamı, 10 mililitre B27 ve 2.5 gram aminokaproik asit veya ACA ekleyin.
Dokuları dökmek için kullanılacak EMT ortamını çıkarın ve üzerine 10 mikromolar ROCK inhibitörü ekleyin. Primer miyoblastlar için 50 mililitre F10 ortamı ve 0.25 gram aminokaproik asit veya ACA ekleyerek iskelet EMT ortamını hazırlayın. IPSC kaynaklı miyoblastlar için 0.1 gram ACA kullanın.
Ardından, ACA içeren döküm ortamını steril olarak filtreleyin. Hücre kültürü sınıfı ayrışma reaktifini ve eşit hacimli EMT ortamını 37 santigrat dereceye ısıtın. Bu ısıtılmış EMT ortamı, ayrışma reaktifini seyreltmek için kullanılacaktır.
Hücreleri PBS ile yıkayın ve hücreleri kaldırmak için ısıtılmış ayrışma reaktifini ekleyin. Beş dakika boyunca veya hücreler kalkıncaya kadar 37 santigrat derecede inkübe edin ve plakanın yan tarafına dokunarak kültürleri her iki ila üç dakikada bir kontrol edin. Hücreler kalktıktan sonra, onları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için P-1000 pipetle tritüre edin. Kalan hücreleri toplamak ve konik tüpe eklemek için plakayı ve şişeyi ek bir EMT ortamı ile yıkayın. Yine, tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücreleri tritüre edin.
Ayrışma işlemini sonlandırmak için EMT ortamı ekleyin ve ardından hücre sayımları için hücre süspansiyonlarının örneklerini alın. Otomatik bir hücre sayacı veya tripan mavisi renkte bir hemositometre kullanarak hücre sayımları gerçekleştirin. Hücreleri dört dakika boyunca 200 G'de döndürün, süpernatanı aspire edin ve artık ayrışma reaktifini çıkarmak için hücreleri EMT baz ortamının beş mililitresinde yeniden askıya alın.
Dört dakika boyunca tekrar santrifüj yaptıktan sonra, süpernatantı aspire edin ve hücre süspansiyonlarını uygun yoğunluklarda hazırlayın. İstenilen doku sayısını oluşturmak için gereken her hücre çözeltisinin hacimlerini hesaplayın ve hesaplanan hücre hacimlerini 15 mililitrelik bir konik tüpe pipetleyin. EMT başına hücre süspansiyonuna 10 mikrolitre fibrinojen ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.
Her EMT'nin son doku yapısında 90 mikrolitre hücre süspansiyonu, 10 mikrolitre fibrinojen ve 50 mikrolitre trombin çözeltisi olduğundan emin olun. Bir hücre kültürü başlığında, doku döküm kitinin kapağını çıkarın ve döküm plakasını, buzun üzerinde düz duran post kafesi ile yerleştirin. Hücre fibrinojen karışımını karıştırın ve bir P-200 pipet ile 100 mikrolitre çekin.
50 mikrolitre trombin çözeltisi ile hazırlanan kuyucuklara 100 mikrolitre karışım ekleyin ve iyice karıştırmak için beş kez tritüre edin. Pipetin ilk durağın ötesine itilmemesi ve herhangi bir kabarcık oluşmasını önlemek için tritürasyondan sonra ucu çıkarmayın. Her dokuyu dökmeden önce hücre süspansiyonunu konik tüpte karıştırın.
Kafesin herhangi bir hareketini önlemek için hem kafesi hem de döküm kuyusu plakasını aynı anda bir elinizin işaretçi parmağını ve başparmağını kullanarak tutun veya plakayı buz üzerinde düz bırakın ve döküm plakasını görmek için buz kovasını sallayın. Tüm dokular dökülene kadar her doku için taze bir P-200 ucu ile tekrarlayın. Tohumlanmış kiti dikkatlice inkübatöre aktarın ve 80 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, kalp dokuları için EMT ortamının kuyucuğu başına iki mililitre içeren taze bir 24 delikli plaka hazırlayın ve ortamı ısıtmak için plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. 80 dakikalık inkübasyondan sonra, döküm kuyularının kenarına yavaşça bir mililitre EMT ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, post kafesi dikkatlice kaldırın ve dokuları döküm plakasından ısıtılmış ortamla hazırlanmış 24 delikli bir plakaya aktarın.
Son olarak, dokulu plakaları hücre kültürü inkübatörüne 37 santigrat derecede geri getirin. Başarısız EMT üretimi, direklerden doku ayrılması gibi yıkıcı başarısızlıklardan, hava kabarcıkları ve her iki direğin etrafında eşit olmayan doku birikimi gibi daha ince yapısal kusurlara kadar değişebilir. Dökümden bir gün sonra EMT yapısı burada gösterilmektedir.
İskelet kası dokuları, hücre füzyonu ve hidrojel sıkıştırmasının sıfır gününden itibaren bir farklılaşma ortamına transfer edildi. Yedinci günden 28. güne kadar, aynı EMT, iki direk arasında biraz daha kısa bir toplam uzunluk ve EMT'nin orta bölümünden ölçüldüğünde daha küçük bir genişlik gösterdi. Sıkıştırma boyunca EMT çapı karşılaştırılarak 21 gün boyunca dört doku plakası izlendi.
Zaman noktaları, plakalar arasında tutarlı EMT boyutu gösterir. Matris yeniden şekillenmesi stabilize edildiğinden maksimum sıkıştırmaya 21. günde ulaşılır. EMT'lerin immünohistokimyası burada tasvir edilmiştir.
EMT'ler kültürün 10. gününde sabitlendi ve parafine gömüldü. İnce kesitler görüntüleme öncesinde miyozin ağır zincir ve distrofine karşı antikorlarla boyandı. Bu grafik görüntüler, zaman içinde kardiyak EMT'lerden ve iskelet EMT'lerinden ölçülen ortalama mutlak seğirme kuvvetini temsil eder.
Mühendislik kalp dokularında akut ve kronik doksorubisin tedavisi burada gösterilmiştir. Dox'un üç farklı doz konsantrasyonu bolus içinde verildi veya 27 gün boyunca mühendislik kalp dokularına sürekli olarak uygulandı. Mühendislik iskelet kası dokularında BDM'ye doz yanıtı bu şekilde sunulmuştur.
Kardiyak atış hızı veya seğirme sıklığı, EMT'ler bu bileşiğe maruz kaldığında kardiyotoksisiteyi gösteren kontraktil kuvvetin kesilmesiyle birlikte doza bağımlı bir şekilde durur. Doku dökümü sırasında hatırlanması gereken en önemli şey, hücre süspansiyonunuz ve reaktifleriniz de dahil olmak üzere her zaman her şeyi soğuk tutmak ve döküm başladıktan sonra post kafesi tamamen sabit tutmaktır.
