This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

NOT: Yaklaşık iki adet 35 mm yemekleri ya da iki canlı görüntüleme yemekleri, yani planı Mattings, diseksiyon ve buna göre kaplama (adım 2.6) için bir fare verimleri yeterli miyoblastlar. 10 hayvandan - miyoblastlar sıralı santrifüj ve preplating yoluyla izole olduğundan, protokol 5 gruplar halinde yapılmalıdır. Hayvan denekleri Tüm işlemler Instituto de Medicina Moleküler ve Üniversite Pierre et Marie Curie de Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı Yenidoğan Fareler Hind-bacak kasları 1. Diseksiyon <ol><li> Peşin (Malzeme Tablosu) tüm çözümleri hazırlayın ve filtrasyon (0.22 mikron filtre) sterilize edilir. Tüm ortam bazal membran matrisi (ör Matrigel) ihtiva eden formülasyonlar hariç hücrelere ilave edilmeden önce 37 ° C &#39;de olduğundan emin olun. </li><li> , Kavisli makas, düz makas, düzenli forseps: diseksiyon malzemesi (biri her sterilizeve ince uçlu forseps) ve% 70 etanol ile silerek tezgah. </li><li> kas toplama Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu tuzlu (DPBS) 5 ml ile 100 mm Petri kabı hazırlayın ve kıyma aşamasına kadar buz üzerinde tutmak. </li><li> düz makas ile P8 fareler ve% 70 etanol ile cilt sterilize - P6 başını kesmek. </li><li> arka deride bir kesi yapmak ve tamamen arka ekstremite kas açığa çıkarılana kadar arka bacaklarda doğru yavaşça çekin. </li><li> kasları zarar vermeden yağ dokusu çıkarmak için forseps kullanın. </li><li> dorsal arka ekstremite kasları kaldırmak için, gergin ekstremite tutmak ve topuk tendon ortaya çıkarmak için pençe bükün. hafifçe kayar ve yukarı keserek, tendon başlayarak, kemik ayrı kas kavisli makas kullanın. kasları tüketim ve buzlu DPBS koyun. </li><li> ince uçlu forseps ile kas sıkışması ve femur veya diz eklemini zarar vermeden etrafında keserek kuadriseps izole edin.</li><li> tüm hayvanları diseksiyon sonra, tüm aşağıdaki adımlar yapılmalıdır steril bir laminer akış hücre kültürü kaputu, geçin. </li></ol> 2. Miyoblast İzolasyon <ol><li> DPBS fazlalığını çıkarın. homojen bir kitle elde etmek için steril kavisli makas ile doku kıyma. </li><li> Sindirim karışımı, 5 ml ile 50 ml konik santrifüj tüpü içinde kıyılmış doku toplamak ve 90 dakika süreyle 37 ° C&#39;de çalkalama ile inkübe edin. </li><li> kalan doku pelet 75 xg&#39;de diseksiyon orta ve santrifüj, 5 dakika boyunca bir süspansiyon, 6 ml ekleyerek sindirim durdurun. </li><li> Süpernatantı dikkatlice toplamak. Doku enkaz toplamak değil emin olun. 5 dakika boyunca 350 xg&#39;de bunu santrifüj; Diseksiyon ortamın 5 mL&#39;si içinde tekrar süspansiyon. </li><li> 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu Filtre. 25 ml diseksiyon ortamı ilave edin ve bir hücre kültürü inkübatöründe 4 saat boyunca (37 ° C ve% 5 CO2 &lt;için 150 mm&#39;lik çanak içinde preplate/ Sub&gt;) fibroblastlar uymak için izin vermek. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca soğuk IMDM 100: preplating birlikte, bazal membran matrisi 500 ul kat yemekler 1 seyreltilmiştir. DPBS ile bir kez yıkayın ve derhal hücreleri plaka (2.8 adım) ya da kaplama kadar büyüme ortamı ile bırakın. </li><li> preplating sonra supernatant toplamak ve 10 dakika boyunca 350 x g&#39;de santrifüj o. </li><li> büyüme ortamında bunu tekrar süspansiyon ve bir hemasitometre hücreleri saymak. 150.000 ila 250.000 hücreleri bazal membran matris kaplı çanak başına kaplanır ve böylece ses düzeyini ayarlayın. bir hücre kültür inkübatörü içinde hücreleri tutun. </li></ol> 3. Myofiber Farklılaşma NOT: 3 gün sonra hücreler,% 70 civarında confluency (Şekil 1B) de sigorta ve form miyotüplerinden başlamalıdır. <ol><li> arzu edildiği takdirde, bu noktada, siRNA veya ilgi DNA ile, hücreleri transfekte. Hücreler transfekte edilecek değilseniz, farklılaşma orta ve kayak doğrudan değiştirmekp 3.4 adıma. </li><li> Üreticinin talimatları izleyerek transfeksiyon reaktifleri ile transferinde. siRNA lipit kompleksleri ile 5 saat boyunca hücrelerin (ayıracın 20 nM + 1 uL) ya da DNA-lipid kompleksleri (1 ug reaktifi + 1 uL) inkübe edin. Gerekirse siRNA ve DNA konsantrasyonları optimize edin. </li><li> farklılaşma ortamı ile bir kez yıkayın ve sonra yeni farklılaşma ortamına geçiş. </li><li> Ertesi gün, bazal membran matrisi 1 seyreltin: 2 buz soğukluğunda farklılaşma ortamı içinde. Mevcut Ortamı çıkarın ve her bir çanak buz soğukluğunda matrisin 200 uL ekleyin. </li><li> hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Agrin olan farklılaşma ortamı (100 ng / ml) Supplement ve dikkatli bir şekilde hücrelere 2 ml. </li><li> Dikkatle her 100 ng / ml bir son konsantrasyona kadar Agrin ile ilave ortamın yarısı her 2 günde bir değiştirin. </li><li> hücre farklılaşması ve canlılığı izleyin. Bu FBS ve C gibi faktörler (çeşitli bağlı olarakTam olgunlaşmayı (Şekil 2) ulaşmak için 10 farklılaşma d - Hicken embriyo özü kökeni), hücreler 5 arasında sürebilir. </li></ol> Cam alt Yemekleri 4. immün <ol><li> immün için, ilgi konusu her bir zaman noktasında, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 PFA ile DPBS ile bir kez hücreler yıkama ve düzeltin. </li><li> DPBS ile iki kez yıkayın. Bu noktada, hücreler 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.5 Triton X-100 ile geçirgenliği. </li><li> PBS ile iki kez yıkanır ve oda sıcaklığında 30 dakika süre ile çözelti engelleme engeller. </li><li> Çözelti O / N 4 ° C&#39;de bloke seyreltilmiş primer antikor ile inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS ile yıkayın 3x. </li><li> İkincil antikor, oda sıcaklığında 1 saat boyunca DAPI 0.2 ug / mL ile inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS ile yıkayın 3x. </li><li> montaj orta 200 mcL ekleyin ve görüntüleme geçin. </li></ol>

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+excitation-contraction+coupling+related+genes+reveal+aspects+of+muscle+weakness+beyond+atrophy-new+hopes+for+treatment+of+musculoskeletal+diseases.">Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases.</a> Front Physiol. 5, 37 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease.">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Electroporation,+Isolation+and+Imaging+of+Myofibers.">DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers.</a> J Vis Exp. (106), (2015).</li><li>Falcone, S., Roman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dihydropyridine+receptor+alpha+subunits+in+normal+and+dysgenic+muscle+in+vitro:+expression+of+alpha+1+is+required+for+proper+targeting+and+distribution+of+alpha+2.">Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2.</a> J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).</li><li>Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2C12+co-culture+on+a+fibroblast+substratum+enables+sustained+survival+of+contractile,+highly+differentiated+myotubes+with+peripheral+nuclei+and+adult+fast+myosin+expression.">C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).</li><li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases.">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skelet Muscle. 1, 26 (2011).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+study+mechanisms+of+neuromuscular+junction+development+and+maintenance.">A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance.</a> Development. , (2016).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+disruption+perturbs+post-synaptic+components+and+contributes+to+impaired+MuSK+clustering+at+the+NMJ:+implication+in+ALS.">Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS.</a> Sci Rep. 6, 27804 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Birincil miyoblastların yetiştirilmesi için bu protokolün kullanımı büyük ölçüde myofibers gelişimini besleyen özel bir niş yol açmaktadır. Bu da çok az sayıda bulunan diğer hücre tiplerine, kısmen bağlıdır. myoblast konsantrasyonu ve kültür saflığı arasında bir denge sağlanmalıdır. İyi bir hücre kültürü de orta formülasyon için kullanılan ürünlerin kalitesine bağlıdır. hayvansal kaynaklardan elde edilen bütün ürünler iyice test edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, sindirim koşulları da takip edilmelidir. Birincil kültürler için her zaman olduğu gibi, deneysel değişkenliği izole elyaflar ya da ölümsüzleştirilmiş miyoblastların olan çalışmalara göre daha yüksek olabilir. Bu değişkenlik orta ve sindirim bileşenleri, fareler ve boyutu ve kültür manipülasyon ve sonuçları toplanması için zaman noktalarında standardizasyonun azaltılabilir. Bununla birlikte, karmaşık mekanizmalar gerçek zamanlı olarak tetkik avantajımyofiber gelişimi için gerekli ölçüde değişkenlik dezavantajı geçti. Bu protokol, hücre farklılaşmasını ödün vermeden, in vitro yaklaşımların avantajlar sağlar. triads oluşur ve kasılmalar kalsiyum kıvılcım birleştiğinde kadar Myofibers olgun. Bu fonksiyonel çıkışlar, farklı deneysel koşullarda ulaşılabilir. Ayrıca, protokole yapılan birçok teknik farklılıklar olabilir. Miyoblastlar kas gelişimi ile ilgili ilgi mutasyonlar ile neonatal fareden hasat edilebilir. Hücreler farklı farklılaşma zaman noktalarında biyokimyasal analiz için parçalanmış olabilir. Kalsiyum göstergeleri dinamiklerini takip etmek kültüre eklenebilir. Optogenetic yapılar bazı sinyal yolaklarını zorlamak için ya da belirli yerel tepkiler teşvik etmek için kullanılabilir. Son olarak, myofibers etkileşimlerini incelemek için, diğer hücre tipleri ile kültive edilebilir.

İskelet kası, insan vücut ağırlığının 1% 40&#39;a kadar oluşturur. Kas-ilişkili bozukluklar muazzam bir sağlık ve ekonomik yük 2 temsil etmektedir. Bu son derece karmaşık ve organize doku kurdu muhafaza ve yeniden nasıl bir kapsamlı ve köklü bir araştırma alanını oluşturur. 6 - Belirli bir bilimsel ilgi bağlı olarak, en uygun yaklaşım in vivo modellerde 3 basitten komplekse mihotüp kültürlerden uzanabilir. Bu protokolün amacı canlı görüntüleme ve immünofloresans vasıtasıyla Miyogenesis izlenmesi için izin veren, bir in vitro sistem sağlamaktır. Geleneksel yöntemlere göre, bu sistem fare myojenik sürecine bir çok tam ve dinamik bir bakış sunuyor. Hücreler enine gizli suç şebekesi ve periferik çekirdekleri 7 görüntüleme olgun, çok çekirdekli myofiber için myoblast aşamasından takip edilebilir. Bu olgunlaşma düzeyi canKarmaşık uyarıcı veya mekanik aparatlar için gerek kalmadan normal hücre kültürü ekipman kullanılarak elde edilebilir. In vitro sistemlerde bazı başarılı 8,9 bildirilmiş olmasına rağmen, bildiğimiz kadarıyla, bu çapraz sarkoplazmik retikulum (SR) ile eşleştirilmiş T-tübüller olgun fare myofibers üreten tek protokoldür. Böylece, bu in vitro sistem hala zayıf 10 anlaşılamamıştır üçlü oluşumu moleküler mekanizmaları, incelemek için kullanılabilir. Bu sistemi kullanarak bir başka avantajı, bu tür antikorlar, ilaçlar, ve RNAi araçları olarak doğrulanmış fare hedefli kaynaklar mevcudiyetidir. Nispeten basit bir protokoldür zahmetli adımlar, çok yetenekli manipülasyon, ya da pahalı ve özel ekipman gerektirmez. Olgun myofibers kalsiyum kıvılcım (yayınlanmamış veri) ile birleştiğinde kasılma göstererek, kültür farklılaşması 7 5 d sonra görünmeye başlayacak. Bir hafta içinde, farklı gelişimmemeli vücudundaki en karmaşık hücreler birinin ark aşamaları, in vitro bir dizi analiz ile kombinasyon halinde incelenebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase&#160;type V</td>
			<td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td>
			<td>C9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM, Glutamax supplemented</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31980022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth reduced factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be &#60;1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP biomedical</td>
			<td>2850145</td>
			<td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant rat agrin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>550-AG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>11581831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-150</td>
			<td>used to transfect siRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15338-100</td>
			<td>used to transfect DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668030</td>
			<td>used to transfect siRNA plus DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodishes</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>Science Services GmbH</td>
			<td>E15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use at 200ng/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			5 mg/ml collagenase 
			3.5 mg/ml dispase 
			sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			10% FBS 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			20% FBS 
			1% Chicken Embryo Extract 
			1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			2% Horse Serum 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			10% Goat Serum 
			5% BSA 
			add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

İskelet kas myofibers, büyük memeli vücudundaki hücrelerin ve çok az sinsitya birine oluşmaktadır. Nasıl oluşturan karmaşık ve evrimsel olarak korunmuş yapılar monte edilir soruşturma altında kalır. Onların büyüklüğü ve fizyolojik özellikleri genellikle manipülasyon ve görüntüleme uygulamaları kısıtlamaktadır. ölümsüzleştirilmiş hücre soylarının kültür yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak tek fark, erken aşamaları çoğaltabilir. Burada, birincil fare miyoblastların kaynaklanan myofibers kolay genetik manipülasyon sağlayan bir protokol açıklar. farklılaşma, bir hafta sonra, myofibers kontraktilite hizalanır sarkomer ve üçlüleri, hem de periferal çekirdek gösterir. Tüm farklılaşma süreci canlı görüntüleme veya immünofloresan ile takip edilebilir. Bu sistem, mevcut ex vivo ve in vitro protokollerinde avantajlarını birleştirir. kolay ve etkin bir transfeksiyon olasılığı olaraktüm farklılaşma aşamaları erişim kolaylığı potansiyel uygulamalarını genişletmektedir. Myofibers sonra, ilgili gelişimsel ve hücre biyolojisi soruları için değil, aynı zamanda klinik uygulamalar için kas hastalığı fenotipleri çoğaltmak değil sadece kullanılabilir.

myofiber gelişme derecesi, çoğunlukla izole miyoblastların saflık ve canlılığı ile belirlenir. Yapışma, proliferasyon ve füzyon kapasitesi ampirik bu parametreleri (Şekil 1 A, B) ulaşmak için kullanılabilir. çoğalması D2 anda, miyoblastlar yapışmış olması ve tipik fusiform şeklini göstermesi gerekir. Silahların Yayılmasını Önleme kendiliğinden mihotüp oluşumu ertesi gün (Şekil 1B) yol açan, bu aşamada yoğun gerçekleşmesi bekleniyor. Hücre confluency hafif ayarlamalar gerekebilir. miyoblastlar çoğalmak ve sigorta fazla 3 d almak eğer artırılmalıdır. myofibers nedeniyle yoğunluk büyümek ve nispeten düz uzamasına izin verilmez eğer azaltılmalıdır. En iyi myofibers dış bölgelere yönelik bulunan bu yüzden konfluansa Tipik olarak, çanağın merkezinden dış yüzey sınırına azalır. Myotubes hızla uzamasına ve ekran birden merkezi hizalanmış çekirdekler (Şekil 1C) olacaktır. D5 tarafından, bazı hücreler çizgilerin edinme ve çevre onların çekirdekleri hareket başlatmak. Olgun özelliklere sahip myofibers sayısı zamanla aynı zamanda hücre kalınlığı (Şekil 1D) ile birlikte artacaktır. farklılaşma derecesi daha da immünofloresan gözlenebilir. farklılaşma D8 mevcut enine üçlü sabit Myofibers. Bu üçlü (Şekil 2) colocalize beklenen T kamışı (DPHR) ve SR (triadin), görüntüleme bileşenleri tarafından teyit edilebilir. myofibers işlevselliği canlı görüntüleme ile ele alınabilir. itibaren farklılaşma D3, hücreler kendiliğinden seğirmesi görüntüler. Bir kalsiyum sensörü transfekte edilmesiyle (örneğin., GCaMP6f 11), kasılmaları kalsiyum zirveleri (Şekil 3) ile birleştiğinde olduğunu gözlemlemek mümkündür. Bu sistemi kullanarak, bu nedenle yenilikçi moleküler tedaviler 7 için yeni bir hedef olabilir Sentronükleer miyopatilerde ve miyotonik distrofilerinde bozulur yeni bir moleküler yol tanımlamak için başardık. Biz de nöromüsküler kavşakta (NMJ) 12 gelişimini incelemek için bu yöntemi adapte var. Sıçan omurilik eksplant ile kokültürü sayesinde, biz NMJ formasyonu 13 dinein bir rol tarif etmişlerdir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> Şekil 1: Miyoblast Kültür Gelişim Evreleri. A) çoğalması D2 anda, miyoblastlar yapıştırılır ve çoğalan başladı. Prolif At B)eration D3, 60 bir confluency -% 80 ulaşıldığında ve miyoblastlar kendiliğinden eritme başlar. Farklılaşma D3 anda C), merkezi bir konumda bulunan çekirdek içeren myotubes baskındır. Itibaren farklılaşma D5 itibaren D) (örneğin, gün 8), myofibers çizgilerin ve periferik çekirdekleri sergileyen başlar ve kalınlaştırmak için başlar. Ölçek çubuğu: 50 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> Şekil 2: D8 Myofiber immunostain Temsilcisi Konfokal görüntü. A) dihidropiridin reseptörü (DHPR, üst panel) için immün ve (TRDN, orta panel) triadin. DHPR, TRDN ve DAPI kanalı bir bindirme üçlü bileşenlerin ko gösterir. B)<html> A. C çizilen sarı hat) α-aktinin (yeşil) ve DAPI (mavi) için boyandı myofibers hacmi render 3D görüntünün bir yoğunluk profili. Ölçek çubuğu ve ızgara genişliği: 5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> Şekil 3: Spontan seğirmesi ile Myofibers Kalsiyum Düzeyleri Canlı Görüntüleme. Bir seğirmesi myofiber bir kalsiyum kıvılcım A) Yüksek hızlı time-lapse (20 ms kare) mikroskopi. Kalsiyum GCaMP6f sentezlenmesi (Addgene plazmid # 40755) ile tespit edilmiştir. Panel A&#39;da kalsiyum sensör için zamanla floresan yoğunluğu B) Niceleme&quot;_blank&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

in-vitro-differentiation-of-mature-myofibers-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

10.2K Görüntüleme.  Universidade de Lisboa. Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Video: In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...