Name: in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging
Uploaded: 2017-01-07T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging at JoVE.com

This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

NOT: Yaklaşık iki adet 35 mm yemekleri ya da iki canlı görüntüleme yemekleri, yani planı Mattings, diseksiyon ve buna göre kaplama (adım 2.6) için bir fare verimleri yeterli miyoblastlar. 10 hayvandan - miyoblastlar sıralı santrifüj ve preplating yoluyla izole olduğundan, protokol 5 gruplar halinde yapılmalıdır. Hayvan denekleri Tüm işlemler Instituto de Medicina Moleküler ve Üniversite Pierre et Marie Curie de Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı Yenidoğan Fareler Hind-bacak kasları 1. Diseksiyon <ol><li> Peşin (Malzeme Tablosu) tüm çözümleri hazırlayın ve filtrasyon (0.22 mikron filtre) sterilize edilir. Tüm ortam bazal membran matrisi (ör Matrigel) ihtiva eden formülasyonlar hariç hücrelere ilave edilmeden önce 37 ° C &#39;de olduğundan emin olun. </li><li> , Kavisli makas, düz makas, düzenli forseps: diseksiyon malzemesi (biri her sterilizeve ince uçlu forseps) ve% 70 etanol ile silerek tezgah. </li><li> kas toplama Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu tuzlu (DPBS) 5 ml ile 100 mm Petri kabı hazırlayın ve kıyma aşamasına kadar buz üzerinde tutmak. </li><li> düz makas ile P8 fareler ve% 70 etanol ile cilt sterilize - P6 başını kesmek. </li><li> arka deride bir kesi yapmak ve tamamen arka ekstremite kas açığa çıkarılana kadar arka bacaklarda doğru yavaşça çekin. </li><li> kasları zarar vermeden yağ dokusu çıkarmak için forseps kullanın. </li><li> dorsal arka ekstremite kasları kaldırmak için, gergin ekstremite tutmak ve topuk tendon ortaya çıkarmak için pençe bükün. hafifçe kayar ve yukarı keserek, tendon başlayarak, kemik ayrı kas kavisli makas kullanın. kasları tüketim ve buzlu DPBS koyun. </li><li> ince uçlu forseps ile kas sıkışması ve femur veya diz eklemini zarar vermeden etrafında keserek kuadriseps izole edin.</li><li> tüm hayvanları diseksiyon sonra, tüm aşağıdaki adımlar yapılmalıdır steril bir laminer akış hücre kültürü kaputu, geçin. </li></ol> 2. Miyoblast İzolasyon <ol><li> DPBS fazlalığını çıkarın. homojen bir kitle elde etmek için steril kavisli makas ile doku kıyma. </li><li> Sindirim karışımı, 5 ml ile 50 ml konik santrifüj tüpü içinde kıyılmış doku toplamak ve 90 dakika süreyle 37 ° C&#39;de çalkalama ile inkübe edin. </li><li> kalan doku pelet 75 xg&#39;de diseksiyon orta ve santrifüj, 5 dakika boyunca bir süspansiyon, 6 ml ekleyerek sindirim durdurun. </li><li> Süpernatantı dikkatlice toplamak. Doku enkaz toplamak değil emin olun. 5 dakika boyunca 350 xg&#39;de bunu santrifüj; Diseksiyon ortamın 5 mL&#39;si içinde tekrar süspansiyon. </li><li> 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu Filtre. 25 ml diseksiyon ortamı ilave edin ve bir hücre kültürü inkübatöründe 4 saat boyunca (37 ° C ve% 5 CO2 &lt;için 150 mm&#39;lik çanak içinde preplate/ Sub&gt;) fibroblastlar uymak için izin vermek. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca soğuk IMDM 100: preplating birlikte, bazal membran matrisi 500 ul kat yemekler 1 seyreltilmiştir. DPBS ile bir kez yıkayın ve derhal hücreleri plaka (2.8 adım) ya da kaplama kadar büyüme ortamı ile bırakın. </li><li> preplating sonra supernatant toplamak ve 10 dakika boyunca 350 x g&#39;de santrifüj o. </li><li> büyüme ortamında bunu tekrar süspansiyon ve bir hemasitometre hücreleri saymak. 150.000 ila 250.000 hücreleri bazal membran matris kaplı çanak başına kaplanır ve böylece ses düzeyini ayarlayın. bir hücre kültür inkübatörü içinde hücreleri tutun. </li></ol> 3. Myofiber Farklılaşma NOT: 3 gün sonra hücreler,% 70 civarında confluency (Şekil 1B) de sigorta ve form miyotüplerinden başlamalıdır. <ol><li> arzu edildiği takdirde, bu noktada, siRNA veya ilgi DNA ile, hücreleri transfekte. Hücreler transfekte edilecek değilseniz, farklılaşma orta ve kayak doğrudan değiştirmekp 3.4 adıma. </li><li> Üreticinin talimatları izleyerek transfeksiyon reaktifleri ile transferinde. siRNA lipit kompleksleri ile 5 saat boyunca hücrelerin (ayıracın 20 nM + 1 uL) ya da DNA-lipid kompleksleri (1 ug reaktifi + 1 uL) inkübe edin. Gerekirse siRNA ve DNA konsantrasyonları optimize edin. </li><li> farklılaşma ortamı ile bir kez yıkayın ve sonra yeni farklılaşma ortamına geçiş. </li><li> Ertesi gün, bazal membran matrisi 1 seyreltin: 2 buz soğukluğunda farklılaşma ortamı içinde. Mevcut Ortamı çıkarın ve her bir çanak buz soğukluğunda matrisin 200 uL ekleyin. </li><li> hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Agrin olan farklılaşma ortamı (100 ng / ml) Supplement ve dikkatli bir şekilde hücrelere 2 ml. </li><li> Dikkatle her 100 ng / ml bir son konsantrasyona kadar Agrin ile ilave ortamın yarısı her 2 günde bir değiştirin. </li><li> hücre farklılaşması ve canlılığı izleyin. Bu FBS ve C gibi faktörler (çeşitli bağlı olarakTam olgunlaşmayı (Şekil 2) ulaşmak için 10 farklılaşma d - Hicken embriyo özü kökeni), hücreler 5 arasında sürebilir. </li></ol> Cam alt Yemekleri 4. immün <ol><li> immün için, ilgi konusu her bir zaman noktasında, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 PFA ile DPBS ile bir kez hücreler yıkama ve düzeltin. </li><li> DPBS ile iki kez yıkayın. Bu noktada, hücreler 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.5 Triton X-100 ile geçirgenliği. </li><li> PBS ile iki kez yıkanır ve oda sıcaklığında 30 dakika süre ile çözelti engelleme engeller. </li><li> Çözelti O / N 4 ° C&#39;de bloke seyreltilmiş primer antikor ile inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS ile yıkayın 3x. </li><li> İkincil antikor, oda sıcaklığında 1 saat boyunca DAPI 0.2 ug / mL ile inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS ile yıkayın 3x. </li><li> montaj orta 200 mcL ekleyin ve görüntüleme geçin. </li></ol>

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+excitation-contraction+coupling+related+genes+reveal+aspects+of+muscle+weakness+beyond+atrophy-new+hopes+for+treatment+of+musculoskeletal+diseases.">Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases.</a> Front Physiol. 5, 37 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease.">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Electroporation,+Isolation+and+Imaging+of+Myofibers.">DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers.</a> J Vis Exp. (106), (2015).</li><li>Falcone, S., Roman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dihydropyridine+receptor+alpha+subunits+in+normal+and+dysgenic+muscle+in+vitro:+expression+of+alpha+1+is+required+for+proper+targeting+and+distribution+of+alpha+2.">Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2.</a> J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).</li><li>Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2C12+co-culture+on+a+fibroblast+substratum+enables+sustained+survival+of+contractile,+highly+differentiated+myotubes+with+peripheral+nuclei+and+adult+fast+myosin+expression.">C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).</li><li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases.">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skelet Muscle. 1, 26 (2011).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+study+mechanisms+of+neuromuscular+junction+development+and+maintenance.">A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance.</a> Development. , (2016).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+disruption+perturbs+post-synaptic+components+and+contributes+to+impaired+MuSK+clustering+at+the+NMJ:+implication+in+ALS.">Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS.</a> Sci Rep. 6, 27804 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Birincil miyoblastların yetiştirilmesi için bu protokolün kullanımı büyük ölçüde myofibers gelişimini besleyen özel bir niş yol açmaktadır. Bu da çok az sayıda bulunan diğer hücre tiplerine, kısmen bağlıdır. myoblast konsantrasyonu ve kültür saflığı arasında bir denge sağlanmalıdır. İyi bir hücre kültürü de orta formülasyon için kullanılan ürünlerin kalitesine bağlıdır. hayvansal kaynaklardan elde edilen bütün ürünler iyice test edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, sindirim koşulları da takip edilmelidir. Birincil kültürler için her zaman olduğu gibi, deneysel değişkenliği izole elyaflar ya da ölümsüzleştirilmiş miyoblastların olan çalışmalara göre daha yüksek olabilir. Bu değişkenlik orta ve sindirim bileşenleri, fareler ve boyutu ve kültür manipülasyon ve sonuçları toplanması için zaman noktalarında standardizasyonun azaltılabilir. Bununla birlikte, karmaşık mekanizmalar gerçek zamanlı olarak tetkik avantajımyofiber gelişimi için gerekli ölçüde değişkenlik dezavantajı geçti. Bu protokol, hücre farklılaşmasını ödün vermeden, in vitro yaklaşımların avantajlar sağlar. triads oluşur ve kasılmalar kalsiyum kıvılcım birleştiğinde kadar Myofibers olgun. Bu fonksiyonel çıkışlar, farklı deneysel koşullarda ulaşılabilir. Ayrıca, protokole yapılan birçok teknik farklılıklar olabilir. Miyoblastlar kas gelişimi ile ilgili ilgi mutasyonlar ile neonatal fareden hasat edilebilir. Hücreler farklı farklılaşma zaman noktalarında biyokimyasal analiz için parçalanmış olabilir. Kalsiyum göstergeleri dinamiklerini takip etmek kültüre eklenebilir. Optogenetic yapılar bazı sinyal yolaklarını zorlamak için ya da belirli yerel tepkiler teşvik etmek için kullanılabilir. Son olarak, myofibers etkileşimlerini incelemek için, diğer hücre tipleri ile kültive edilebilir.

İskelet kası, insan vücut ağırlığının 1% 40&#39;a kadar oluşturur. Kas-ilişkili bozukluklar muazzam bir sağlık ve ekonomik yük 2 temsil etmektedir. Bu son derece karmaşık ve organize doku kurdu muhafaza ve yeniden nasıl bir kapsamlı ve köklü bir araştırma alanını oluşturur. 6 - Belirli bir bilimsel ilgi bağlı olarak, en uygun yaklaşım in vivo modellerde 3 basitten komplekse mihotüp kültürlerden uzanabilir. Bu protokolün amacı canlı görüntüleme ve immünofloresans vasıtasıyla Miyogenesis izlenmesi için izin veren, bir in vitro sistem sağlamaktır. Geleneksel yöntemlere göre, bu sistem fare myojenik sürecine bir çok tam ve dinamik bir bakış sunuyor. Hücreler enine gizli suç şebekesi ve periferik çekirdekleri 7 görüntüleme olgun, çok çekirdekli myofiber için myoblast aşamasından takip edilebilir. Bu olgunlaşma düzeyi canKarmaşık uyarıcı veya mekanik aparatlar için gerek kalmadan normal hücre kültürü ekipman kullanılarak elde edilebilir. In vitro sistemlerde bazı başarılı 8,9 bildirilmiş olmasına rağmen, bildiğimiz kadarıyla, bu çapraz sarkoplazmik retikulum (SR) ile eşleştirilmiş T-tübüller olgun fare myofibers üreten tek protokoldür. Böylece, bu in vitro sistem hala zayıf 10 anlaşılamamıştır üçlü oluşumu moleküler mekanizmaları, incelemek için kullanılabilir. Bu sistemi kullanarak bir başka avantajı, bu tür antikorlar, ilaçlar, ve RNAi araçları olarak doğrulanmış fare hedefli kaynaklar mevcudiyetidir. Nispeten basit bir protokoldür zahmetli adımlar, çok yetenekli manipülasyon, ya da pahalı ve özel ekipman gerektirmez. Olgun myofibers kalsiyum kıvılcım (yayınlanmamış veri) ile birleştiğinde kasılma göstererek, kültür farklılaşması 7 5 d sonra görünmeye başlayacak. Bir hafta içinde, farklı gelişimmemeli vücudundaki en karmaşık hücreler birinin ark aşamaları, in vitro bir dizi analiz ile kombinasyon halinde incelenebilir.

<table><tbody><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase&amp;nbsp;type V</td><td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td><td>C9263</td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Glutamax supplemented</td><td>Gibco</td><td>31980022</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth reduced factor</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be &amp;lt;1.5</td></tr><tr><td>Chicken Embryo Extract</td><td>MP biomedical</td><td>2850145</td><td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td></tr><tr><td>Recombinant rat agrin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>550-AG-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>11581831</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>used to transfect siRNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX</td><td>Invitrogen</td><td>15338-100</td><td>used to transfect DNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668030</td><td>used to transfect siRNA plus DNA</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Corning</td><td>21008-949</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodishes</td><td>World precision instruments</td><td>FD35-100</td><td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td><td>Science Services GmbH</td><td>E15710</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>use at 200 ng/&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions and Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestion Mix</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 5 mg/mL collagenase&lt;br/&gt; 3.5 mg/mL dispase&lt;br/&gt; sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Dissection Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 10% FBS&lt;br/&gt; 1% Penicillin/Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Growth Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 20% FBS&lt;br/&gt; 1% Chicken Embryo Extract&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Differentiation Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 2% Horse Serum&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Blocking Solution</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 10% Goat Serum&lt;br/&gt; 5% BSA&lt;br/&gt; add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

İskelet kas myofibers, büyük memeli vücudundaki hücrelerin ve çok az sinsitya birine oluşmaktadır. Nasıl oluşturan karmaşık ve evrimsel olarak korunmuş yapılar monte edilir soruşturma altında kalır. Onların büyüklüğü ve fizyolojik özellikleri genellikle manipülasyon ve görüntüleme uygulamaları kısıtlamaktadır. ölümsüzleştirilmiş hücre soylarının kültür yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak tek fark, erken aşamaları çoğaltabilir. Burada, birincil fare miyoblastların kaynaklanan myofibers kolay genetik manipülasyon sağlayan bir protokol açıklar. farklılaşma, bir hafta sonra, myofibers kontraktilite hizalanır sarkomer ve üçlüleri, hem de periferal çekirdek gösterir. Tüm farklılaşma süreci canlı görüntüleme veya immünofloresan ile takip edilebilir. Bu sistem, mevcut ex vivo ve in vitro protokollerinde avantajlarını birleştirir. kolay ve etkin bir transfeksiyon olasılığı olaraktüm farklılaşma aşamaları erişim kolaylığı potansiyel uygulamalarını genişletmektedir. Myofibers sonra, ilgili gelişimsel ve hücre biyolojisi soruları için değil, aynı zamanda klinik uygulamalar için kas hastalığı fenotipleri çoğaltmak değil sadece kullanılabilir.

myofiber gelişme derecesi, çoğunlukla izole miyoblastların saflık ve canlılığı ile belirlenir. Yapışma, proliferasyon ve füzyon kapasitesi ampirik bu parametreleri (Şekil 1 A, B) ulaşmak için kullanılabilir. çoğalması D2 anda, miyoblastlar yapışmış olması ve tipik fusiform şeklini göstermesi gerekir. Silahların Yayılmasını Önleme kendiliğinden mihotüp oluşumu ertesi gün (Şekil 1B) yol açan, bu aşamada yoğun gerçekleşmesi bekleniyor. Hücre confluency hafif ayarlamalar gerekebilir. miyoblastlar çoğalmak ve sigorta fazla 3 d almak eğer artırılmalıdır. myofibers nedeniyle yoğunluk büyümek ve nispeten düz uzamasına izin verilmez eğer azaltılmalıdır. En iyi myofibers dış bölgelere yönelik bulunan bu yüzden konfluansa Tipik olarak, çanağın merkezinden dış yüzey sınırına azalır. Myotubes hızla uzamasına ve ekran birden merkezi hizalanmış çekirdekler (Şekil 1C) olacaktır. D5 tarafından, bazı hücreler çizgilerin edinme ve çevre onların çekirdekleri hareket başlatmak. Olgun özelliklere sahip myofibers sayısı zamanla aynı zamanda hücre kalınlığı (Şekil 1D) ile birlikte artacaktır. farklılaşma derecesi daha da immünofloresan gözlenebilir. farklılaşma D8 mevcut enine üçlü sabit Myofibers. Bu üçlü (Şekil 2) colocalize beklenen T kamışı (DPHR) ve SR (triadin), görüntüleme bileşenleri tarafından teyit edilebilir. myofibers işlevselliği canlı görüntüleme ile ele alınabilir. itibaren farklılaşma D3, hücreler kendiliğinden seğirmesi görüntüler. Bir kalsiyum sensörü transfekte edilmesiyle (örneğin., GCaMP6f 11), kasılmaları kalsiyum zirveleri (Şekil 3) ile birleştiğinde olduğunu gözlemlemek mümkündür. Bu sistemi kullanarak, bu nedenle yenilikçi moleküler tedaviler 7 için yeni bir hedef olabilir Sentronükleer miyopatilerde ve miyotonik distrofilerinde bozulur yeni bir moleküler yol tanımlamak için başardık. Biz de nöromüsküler kavşakta (NMJ) 12 gelişimini incelemek için bu yöntemi adapte var. Sıçan omurilik eksplant ile kokültürü sayesinde, biz NMJ formasyonu 13 dinein bir rol tarif etmişlerdir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> Şekil 1: Miyoblast Kültür Gelişim Evreleri. A) çoğalması D2 anda, miyoblastlar yapıştırılır ve çoğalan başladı. Prolif At B)eration D3, 60 bir confluency -% 80 ulaşıldığında ve miyoblastlar kendiliğinden eritme başlar. Farklılaşma D3 anda C), merkezi bir konumda bulunan çekirdek içeren myotubes baskındır. Itibaren farklılaşma D5 itibaren D) (örneğin, gün 8), myofibers çizgilerin ve periferik çekirdekleri sergileyen başlar ve kalınlaştırmak için başlar. Ölçek çubuğu: 50 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> Şekil 2: D8 Myofiber immunostain Temsilcisi Konfokal görüntü. A) dihidropiridin reseptörü (DHPR, üst panel) için immün ve (TRDN, orta panel) triadin. DHPR, TRDN ve DAPI kanalı bir bindirme üçlü bileşenlerin ko gösterir. B)<html> A. C çizilen sarı hat) α-aktinin (yeşil) ve DAPI (mavi) için boyandı myofibers hacmi render 3D görüntünün bir yoğunluk profili. Ölçek çubuğu ve ızgara genişliği: 5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> Şekil 3: Spontan seğirmesi ile Myofibers Kalsiyum Düzeyleri Canlı Görüntüleme. Bir seğirmesi myofiber bir kalsiyum kıvılcım A) Yüksek hızlı time-lapse (20 ms kare) mikroskopi. Kalsiyum GCaMP6f sentezlenmesi (Addgene plazmid # 40755) ile tespit edilmiştir. Panel A&#39;da kalsiyum sensör için zamanla floresan yoğunluğu B) Niceleme&quot;_blank&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

in-vitro-differentiation-of-mature-myofibers-for-live-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

10.2K Görüntüleme.  Universidade de Lisboa. Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Video: In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Genetik

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Küçük Hayvan Kas Aşı dinamiği ile Takip In Vivo Floresan Görüntüleme

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Biyoloji

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Tıp

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

Parça çekirdeği canlı görüntüleme sırasında Myoblast farklılaşma ve füzyon istismar

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

Optik tabanlı bir sistem kullanarak hidrojel gömülü bozulmamış fare kas liflerinin yüksek verimli kasılma ölçümleri

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...