Bu araştırma Çek Bilimler Akademisi RVO 68378050, LM2018126 MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Çek Fenogenomik Merkezi'nin yükseltilmesi: MEYS ve ESIF tarafından çeviri araştırmalarına doğru geliştiriliyor), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (MEYS ve ESIF tarafından CCP Infrastructure Upgrade II) ve OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (MEYS ve ERDF tarafından transgenik modeller için daha yüksek kalite ve kapasite) tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, bu çalışma Çek Cumhuriyeti Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı tarafından sağlanan "Gen Terapisi Derneği (ASGENT)", Çekya (https://asgent.org/) ve Çek Fenogenomik Merkezi LM2023036 STK'sından fon almıştır.

Davranışsal Testler Kullanarak Angelman Sendromunun Murin Modelini Doğrulama

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Farklı fare suşlarında oluşturulan AS modelleri, insan semptomlarıyla karşılaştırmayı kolaylaştırmak için genellikle hayvanların duygusal durumu, motor işlevleri ve bilişsel yetenekleri testleriyle doğrulanır31,32. AS modellerinde motor eksikliği, laboratuvarlar arasında en tutarlı bulgudur, bunu mutantların değişmeyen duygusallık durumu ve yuva oluşturmada zorluklarizlemektedir 31,32,33<sup class="xref...

Angelman sendromu (AS) nadir görülen nörogelişimsel bir hastalıktır. AS'nin en yaygın genetik kökeni, hastaların yaklaşık% 74'ünde bulunan maternal kaynaklı kromozomun 15q11-q13 bölgesinin büyük bir silinmesidir1. Bu bölgenin silinmesi, bir E3 ubikitin ligazını kodlayan AS'nin ana etken geni olan UBE3A'nın kaybına neden olur. Nöronlardaki UBE3A geninin baba aleli, damgalama olarak bilinen bir süreçte susturulur. Sonuç olarak, genin baba tarafından damgalanması, merkezi sinir sisteminde (CNS) yalnızca maternal ekspresyona izin verir2. Bu nedenle, maternal kaynaklı kromozomdan UBE3A gen delesyonu AS semptomlarının gelişmesine yol açar. İnsanlarda AS, tüm gelişim aşamaları boyunca devam eden ve etkilenen bireylerde ciddi zayıflatıcı semptomlarla sonuçlanan gelişimsel gerilik ile yaklaşık 6 aylıkken ortaya çıkar 3,4. Bozukluğun temel semptomları, sarsıntılı ataksik yürüyüş, ciddi konuşma bozukluğu ve zihinsel engellilik dahil olmak üzere ince ve kaba motor becerilerin eksikliğini içerir. AS hastalarının yaklaşık% 80'i uyku bozuklukları ve epilepsiden de muzdariptir. Bugüne kadar mevcut olan tek tedavi, epileptik nöbetleri azaltan ve uyku kalitesini artıran semptomatik ilaçlardır1. Bu nedenle, rafine fenotipleme analizinin yanı sıra tekrarlanabilir davranışsal fenotiplere sahip sağlam hayvan modellerinin geliştirilmesi, bozukluğun patofizyolojik mekanizmalarını aydınlatmak ve etkili ilaçları ve tedavileri keşfetmek için gerekli olacaktır.
CNS'yi etkileyen insan bozukluğunun karmaşıklığı, model organizmaların karşılaştırılabilir bir genom, fizyoloji ve davranışa sahip olmasını gerektirir. Fareler, kısa üreme döngüleri, küçük boyutları ve göreceli DNA modifikasyonu kolaylığı nedeniyle model organizma olarak popülerdir. 1984'te Paul Willner, üç temel hastalık modeli doğrulama kriteri önerdi: modelin değerini belirlemek için kullanılan yapı, yüz ve öngörücü geçerlilik5. Basitçe, yapı geçerliliği, bozukluğun gelişiminden sorumlu biyolojik mekanizmaları yansıtır, yüz geçerliliği semptomlarını özetler ve öngörücü geçerlilik, terapötik ilaçlara model yanıtını tanımlar.
Yukarıdaki ilkelere bağlı kalmak için, AS model fareler oluşturmak için UBE3A geni de dahil olmak üzere maternal 15q11.2-13q lokusunun büyük bir delesyonunu seçtik. CRISPR / Cas9 tekniğini, tüm UBE3A genini kapsayan, genin hem kodlayan hem de kodlamayan unsurlarını kapsayan, C57BL / 6N arka planındanfarelerde 76.225 bp uzunluğunda bir bölgeyi silmek için kullandık 6. Daha sonra UBE3A+/− heterozigot fareler elde etmek için hayvanları yetiştirdik. Modelin yüz doğrulaması için, UBE3A+/- döllerini (C57BL/6NCrl-UBE3A<em1(IMPC)Ccpcz>/Ph olarak adlandırılan suş) elde etmek için UBE3A+/− dişilerden ve vahşi tip erkeklerden elde edilen hayvanları kullandık ve daha sonra UBE3A mGenedel/+ olarak atandık ve yavruları kontrol ettik. İnce ve kaba motor becerilerini, duygusallıklarını ve temel AS semptomlarını özetlemek için duygulanımlarını test ettik. Önceki bir makalede, AS hastaları da zihinsel engellilikten muzdarip olduğu için hayvanların bilişsel işlevlerini de değerlendirdik6. Bununla birlikte, UBE3AmGenedel / + farelerinde, belki de test7 sırasında hayvanların genç yaşı nedeniyle bilişsel bozukluk bulamadık. Daha sonra, yaklaşık 18 haftalık olan yaşlı hayvanların incelenmesi, yer tercihi paradigmasında tersine öğrenme sırasında davranışsal esneklikte bir eksiklik olduğunu ortaya çıkardı. Bununla birlikte, bu analiz için kullanılan ekipmanın karmaşıklığı ayrı bir metodolojik modül gerektirir ve burada yer almaz.
Burada sunulan davranış testleri, yüksek prediktif değerleri ve yeterli yapı geçerliliğisayesinde genetik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan fenotipleme araçlarına aittir 8,9,10. Bu testleri, insan hastalığının temel semptomlarını tekrarlanabilir, yaştan bağımsız bir şekilde özetleyerek bir fare AS modelini doğrulamak için kullandık. Hayvanın duygusallığı, yükseltilmiş artı labirent ve açık alan testlerinde değerlendirildi. Bu testlerin her ikisi de, hayvanların yiyecek, barınak veya çiftleşme fırsatları aramak için yeni bir ortam keşfederken aynı zamanda anksiyojenik bölmelerden kaçındığı yaklaşma-kaçınma çatışmasına dayanmaktadır11. Ek olarak, açık alan testi bir farenin lokomotor aktivitesini test etmek için kullanılır8. Kuyruk süspansiyon testi, fare nakavt modellerinde yeni antidepresan ilaçları veya depresif benzeri fenotipleri taramak için depresyon araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır12. Bu test, hayvanların kaçınılmaz bir durumda zaman içinde geliştirdikleri umutsuzluğu değerlendirir. Motor öğrenme ve ayrıntılı yürüme özellikleri sırasıyla rotarod ve DigiGait'te belirlendi. Hızlanan çubuk üzerindeki hayvan dayanıklılığı, denge ve hareket koordinasyon becerilerini karakterize ederken, bir farenin adım modellerinin ayrıntılı analizi, birçok nörojeneratif hareket bozukluğuna bağlı nöromüsküler bozuklukların hassas bir değerlendirmesidir13,14,15. Yuva parçalama testi, kemirgenlerde dürtüsel davranışı tespit etmek için standart metodolojinin bir parçasıdır ve doğal kemirgen oluşturma davranışını kullandığından, hayvanın refahınıgösterir 16,17.
Deney gruplarının büyüklüğü, 3R kuralı taleplerini karşılamak ve koloni ıslah performansının verimli kullanımı için bir uzlaşmanın sonucuydu. Bununla birlikte, istatistiksel güç elde etmek için, yeterli miktarda üreme çiftinin kurulması nedeniyle grupların en az 10 bireyi vardı. Ne yazık ki, üreme performansı her zaman yeterli sayıda hayvanla sonuçlanmadı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cages, individually ventilated</td>
			<td>Techniplast</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiGait</td>
			<td>Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level 
			Unit 110 
			Framingham, MA 01701, USA</td>
			<td>Equipment was tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA Nestlet squares</td>
			<td>Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK</td>
			<td>Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.</td>
			<td>Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse chow</td>
			<td>Altramion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotarod</td>
			<td>TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 
			12489 Berlin, Germany</td>
			<td>Equipment was tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail Suspension Test</td>
			<td>Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles 
			FRANCE</td>
			<td>Reference: BIO-TST5</td>
			<td>Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore medical tape</td>
			<td>Medical M, Ltd.</td>
			<td>P-AIRO1291</td>
			<td>The tape used to attach an animal to the hook by its tail.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewer - Video Tracking System</td>
			<td>Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 
			53111 Bonn, Germany</td>
			<td>Equipment with software were tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,&#160; 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral characterization of an angelman syndrome mouse model

Bu makale, yerleşik bir fare AS'de Angelman sendromu (AS) benzeri fenotipleri karakterize etmek için mevcut olan bir dizi davranışsal testi açıklamaktadır. Hayvan motor bozukluklarını tespit etmek ve karakterize etmek için rotarod öğrenme paradigmasını, ayrıntılı yürüyüş analizini ve yuva kurma testini kullanıyoruz. Açık alanda hayvan duygusallığını ve yükseltilmiş artı labirent testlerinde ve ayrıca kuyruk süspansiyon testinde etkiyi test ediyoruz. AS fareleri açık alan testinde test edildiğinde, motor işlev bozuklukları labirentteki fare davranışını etkilediğinden ve aktivite puanlarını değiştirdiğinden sonuçlar dikkatle yorumlanmalıdır.
Sunulan davranış testlerinin tekrarlanabilirliği ve etkinliği, farklı nakavt varyantlarına sahip birkaç bağımsız Uba3a fare hattında zaten doğrulanmıştır ve bu test setini AS araştırmasında mükemmel bir doğrulama aracı olarak oluşturmuştur. İlgili yapıya ve yüz geçerliliğine sahip modeller, hastalığın patofizyolojisini aydınlatmak ve nedensel tedavilerin geliştirilmesini sağlamak için daha fazla araştırmayı garanti edecektir.

Angelman syndrome (AS) is a rare neurodevelopmental disease. The most common genetic origin of AS is a large deletion of the 15q11-q13 region of the maternally-derived chromosome, which is found in nearly 74% of patients1. Deletion of this region causes the loss of UBE3A, the main causative gene of AS that encodes an E3 ubiquitin ligase. The paternal allele of the UBE3A gene in neurons is silenced in a process known as imprinting. As a consequence, paternal imprinting of the gene allows only maternal expression in the central nervous system (CNS)2. Therefore, UBE3A gene deletion from the maternally-derived chromosome leads to the development of AS symptoms. In humans, AS manifests at around 6 months of age, with developmental retardation that persists throughout all developmental stages and results in severe debilitating symptoms in affected individuals3,4. The core symptoms of the disorder include the deficit of fine and gross motor skills, including jerky ataxic gait, serious speech impairment, and intellectual disability. Approximately 80% of AS patients also suffer from sleep disturbances and epilepsy. To date, the only available treatment are symptomatic drugs, which reduce epileptic seizures and improve sleep quality1. Therefore, the development of robust animal models with reproducible behavioral phenotypes alongside refined phenotyping analysis will be essential to elucidate the pathophysiological mechanisms of the disorder and discover effective medications and treatments.
The complexity of the human disorder affecting the CNS demands model organisms to possess a comparable genome, physiology, and behavior. Mice are popular as a model organism due to their short reproductive cycle, small size, and relative ease of DNA modification. In 1984, Paul Willner proposed three basic disease model validation criteria: the construct, face, and predictive validity, which are used to determine the model&#39;s value5. Simply, construct validity reflects the biological mechanisms responsible for the disorder development, face validity recapitulates its symptoms, and predictive validity describes the model response to therapeutic drugs.
To adhere to the above principles, we have chosen the most common genetic etiology, a large deletion of the maternal 15q11.2-13q locus including the UBE3A gene, to create AS model mice. We used the CRISPR/Cas9 technique to delete a 76,225 bp long region spanning the entire UBE3A gene, encompassing both the coding and non-coding elements of the gene, in mice from a C57BL/6N background6. We then bred the animals to obtain UBE3A+/&#8722; heterozygous mice. For face validation of the model, we used animals from crosses of UBE3A+/&#8722; females and wild-type males to gain UBE3A+/- progeny (strain named C57BL/6NCrl-UBE3A&#60;em1(IMPC)Ccpcz&#62;/Ph and later assigned as UBE3AmGenedel/+) and control littermates. We tested their fine and gross motor skills, emotionality, and affect to recapitulate core AS symptoms. In a previous article, we also evaluated the animals&#39; cognitive functions, as AS patients also suffer from intellectual disability6. However, we found no cognitive impairments in UBE3AmGenedel/+ mice, perhaps due to the young age of the animals at the time of testing7. Later examination of the older animals, around 18 weeks old, revealed a deficit in behavioral flexibility during reversal learning in the place preference paradigm. However, the complexity of the employed equipment for this analysis requires a separate methodological module and it is not included here.
The behavioral tests presented here belong to the common phenotyping tools in genetic research, thanks to their high predictive value and sufficient construct validity8,9,10. We used these tests to validate a mouse model of AS by recapitulating core symptoms of the human disease in a reproducible, age-independent manner. The emotionality of the animal was evaluated in the elevated plus maze and open field tests. Both of these tests are based on the approach-avoidance conflict, where animals explore a new environment in search of food, shelter, or mating opportunities while simultaneously avoiding anxiogenic compartments11. Additionally, the open field test is used to test a mouse&#39;s locomotor activity8. The tail suspension test is widely used in depression research to screen for new antidepressant drugs or depressive-like phenotypes in mouse knockout models12. This test evaluates the despair that animals develop over time in an inescapable situation. Motor learning and detailed gait characteristics were determined on the rotarod and in DigiGait, respectively. Animal endurance on the accelerating rod characterizes its balance and movement coordination skills, while detailed analysis of a mouse&#39;s step patterns is a sensitive evaluation of neuromuscular impairments connected to many neurogenerative movement disorders13,14,15. The nestlet shredding test is part of the standard methodology for detecting impulsive behavior in rodents, and since it utilizes natural rodent building behavior, it indicates the animal&#39;s well-being16,17.
The size of the experimental groups was a result of a compromise to meet the 3R rule demands and efficient usage of colony breeding performance. However, to obtain statistical power, the groups had no fewer than 10 individuals, due to the establishment of a sufficient amount of breeding pairs. Unfortunately, breeding performance did not always result in a sufficient number of animals.

Yazar Spotlight: Bir Angelman Sendromu Murin Modelini Doğrulamak için Yüksek Derecede Tekrarlanabilir Davranış Testleri Dizisi 

Angelman Sendromlu Bir Fare Modelinin Davranışsal Karakterizasyonu

Our goal is to elucidate the physiological roles of genes using mice as an experimental model. We also focus on developing mouse models of specific diseases that scientists can use to investigate disease causation and develop effective treatments. An example of such activity is the mouse model of Angelman syndrome.Arguably, the most promising new technology with potential is integrating artificial intelligence based on deep learning techniques in animal research. This approach can be used to monitor animal behavior in the home cage directly without need for the experimenter to disturb the animals. The biggest challenge in behavioral studies currently is reproducibility.Therefore, we introduce a battery of tests that validate the Angelman syndrome of model in a way that does not depend on the model's age or species. We use established behavioral tests to validate our AS model. However, with the novel approach for the model development closely resembling the human condition with a large deletion.Using CRISPR technology, we deleted the entire UBE3A gene from the mouse genome. In contrast to other models where the deletion is limited to 3KB. We're working on developing a genetic therapy that could restore a symptoms in a mouse model.

Yükseltilmiş artı labirent ve açık alan testleri EPM ve OF testleri, kemirgenlerin yeni ortamları keşfetme konusundaki doğal eğilimini kullanır18,19. Keşif, kemirgenlerin yeni bir çevrenin keşfi ile olası tehlikelerden kaçınma arasında seçim yaptığı bir yaklaşma-kaçınma çatışması tarafından yönetilir. Hayvanlar barınak, sosyal temas veya yiyecek arama arayışı içinde bilinmeyen yerleri keşfederler. Bununla bi...

Watch this Scientific Journal Video about A Battery of Highly Reproducible Behavioral Tests to Validate an Angelman Syndrome Murine Model at JoVE.com

Bu el yazması, bir Angelman sendromlu fare modelini doğrulamak için bir dizi yüksek oranda tekrarlanabilir davranış testi sunmaktadır.

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...

Amacımız, fareleri deneysel bir model olarak kullanarak genlerin fizyolojik rollerini aydınlatmaktır. Ayrıca, bilim adamlarının hastalık nedenselliğini araştırmak ve etkili tedaviler geliştirmek için kullanabilecekleri belirli hastalıkların fare modellerini geliştirmeye odaklanıyoruz. Bu tür bir aktivitenin bir örneği, Angelman sendromunun fare modelidir.Muhtemelen, potansiyele sahip en umut verici yeni teknoloji, hayvan araştırmalarında derin öğrenme tekniklerine dayalı yapay zekayı entegre etmektir. Bu yaklaşım, deneycinin hayvanları rahatsız etmesine gerek kalmadan doğrudan ev kafesindeki hayvan davranışlarını izlemek için kullanılabilir. Şu anda davranışsal çalışmalardaki en büyük zorluk tekrarlanabilirliktir.Bu nedenle, modelin Angelman sendromunu, modelin yaşına veya türüne bağlı olmayacak şekilde doğrulayan bir dizi test sunuyoruz. AS modelimizi doğrulamak için yerleşik davranış testleri kullanıyoruz. Bununla birlikte, model geliştirme için yeni yaklaşımla, büyük bir silme ile insanlık durumuna çok benzemektedir.CRISPR teknolojisini kullanarak, tüm UBE3A genini fare genomundan sildik. Silme işleminin 3KB ile sınırlı olduğu diğer modellerin aksine. Bir fare modelinde semptomları geri getirebilecek bir genetik terapi geliştirmek için çalışıyoruz.

behavioral-characterization-of-an-angelman-syndrome-mouse-model

Research

JoVE Journal

Behavior

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

1.6K Görüntüleme.  Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences. Amacımız, fareleri deneysel bir model olarak kullanarak genlerin fizyolojik rollerini aydınlatmaktır. Ayrıca, bilim adamlarının hastalık nedenselliğini araştırmak ve etkili tedaviler geliştirmek için kullanabilecekleri belirli hastalıkların fare modellerini geliştirmeye odaklanıyoruz. Bu tür bir aktivitenin bir örneği, Angelman sendromunun fare modelidir.Muhtemelen, potansiyele sahip en umut verici yeni teknoloji, hayvan araştırmalarında derin öğrenme teknikler...