Javierre laboratuvarından diğer üyelere makale hakkındaki geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Kurumsal destek için CERCA Programı'na, Generalitat de Catalunya'ya ve Josep Carreras Vakfı'na teşekkür ederiz. Bu çalışma FEDER/İspanya Bilim ve İnovasyon Bakanlığı (RTI2018-094788-A-I00), Avrupa Hematoloji Derneği (4823998) ve İspanyol Kansere Karşı Birliği (AECC) LABAE21981JAVI tarafından finanse edilmiştir. BMJ, La Caixa Bankacılık Vakfı Genç Lider projesi (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR bir AGAUR FI bursu (2019FI-B00017) ve LT-D bir FPI Bursu (PRE2019-088005) tarafından finanse edilmektedir. Universitat Autònoma de Barcelona biyokimya ve moleküler biyoloji doktora programına destekleri için teşekkür ederiz. Fon verenlerin hiçbiri deneysel tasarımın veya el yazması yazımının herhangi bir noktasında yer almadı.

Kıt Hücrelerde Promotör İnteraktomunu İncelemek İçin Kapsamlı Bir Yaklaşım

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

liCHi-C, PCHi-C'lerden benzer bir deneysel çerçeve kullanarak yüksek çözünürlüklü promotör interaktom kütüphaneleri oluşturma yeteneği sunar, ancak büyük ölçüde azaltılmış hücre sayısına sahiptir. Bu, fenol saflaştırma ve biyotin giderimi gibi gereksiz adımları ortadan kaldırarak büyük ölçüde elde edilir. Klasik çekirdek içi ligasyon Hi-C protokolü57 ve sonraki türev tekniği PCHi-C'de, biyotin, daha sonra bilgilendirici olmayan DNA parçalarının aşağı ?...

Zamansal gen ekspresyonu, hücre farklılaşmasını ve nihayetinde organizma gelişimini yönlendirir ve değişimi, çok sayıda hastalıkla yakından ilişkilidir 1,2,3,4,5. Gen transkripsiyonu, proksimal (yani gen promotörleri) ve distal (örneğin, arttırıcılar veya susturucular) olarak sınıflandırılabilen düzenleyici elementlerin etkisiyle ince bir şekilde düzenlenir, ikincisi sıklıkla hedef genlerinden uzakta bulunur ve gen ekspresyonunu modüle etmek için kromatin döngüsü yoluyla fiziksel olarak onlarla etkileşime girer 6,7,8.
Genomdaki distal düzenleyici bölgelerin tanımlanması üzerinde yaygın olarak anlaşmaya varılan bir konudur, çünkü bu bölgeler spesifik histon modifikasyonları 9,10,11 barındırır ve spesifik transkripsiyon faktörü tanıma motifleri içerir ve bunlar için işe alım platformları görevi görür12,13,14. Ayrıca, arttırıcılar ve süper arttırıcılar15,16 durumunda, aynı zamanda düşük nükleozom doluluk 17,18'e sahiptirler ve kodlamayan eRNA'lara 19,20'ye kopyalanırlar.
Bununla birlikte, her distal düzenleyici elementin hedef genlerini tahmin etmek daha zordur. Çoğu zaman, distal düzenleyici elementler ve hedefleri arasındaki etkileşimler hücre tipi ve uyarana özgü 21,22'dir, yüzlerce kilobaza yayılır, diğer genler üzerinde herhangi bir yönde köprü oluşturur 23,24,25 ve hatta hedef genlerinin veya diğer müdahale etmeyen genlerin intronik bölgelerinde bile bulunabilir26,27. Ayrıca, distal düzenleyici elementler aynı anda birden fazla geni kontrol edebilir ve bunun tersi de 28,29'dur. Bu konumsal karmaşıklık, aralarındaki düzenleyici ilişkileri belirlemeyi engeller ve bu nedenle, her düzenleyici elemanın her hücre tipindeki hedeflerinin çoğu bilinmemektedir.
Son yıllarda, kromatin etkileşimlerini incelemek için kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniklerinin geliştirilmesinde önemli bir patlama olmuştur. Bunlardan en yaygın kullanılanı olan Hi-C, bir hücrenin genomunun her bir parçası arasındaki tüm etkileşimlerin bir haritasını oluşturmaya izin verir30. Bununla birlikte, kısıtlama parçası düzeyinde önemli etkileşimleri tespit etmek için Hi-C, ultra derin dizilemeye dayanır ve bireysel genlerin düzenleyici manzarasını rutin olarak incelemek için kullanımını yasaklar. Bu ekonomik sınırlamanın üstesinden gelmek için, ChIA-PET 31, HiChIP32 ve düşük girdili muadili HiCuT33 gibi çeşitli zenginleştirme tabanlı3C teknikleri ortaya çıkmıştır. Bu teknikler, belirli bir proteinin aracılık ettiği genom çapında etkileşimleri zenginleştirmek için antikorların kullanılmasına bağlıdır. Bununla birlikte, bu 3C tekniklerinin benzersiz özelliği aynı zamanda uygulamalarının felaketidir; Kullanıcılar, ilgilendikleri protein için yüksek kaliteli antikorların mevcudiyetine güvenir ve proteinin bağlanmasının dinamik olduğu koşulları karşılaştıramazlar.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C), bu sınırlamaları aşan başka bir zenginleştirme tabanlı 3C tekniğidir34,35. PCHi-C, biyotinillenmiş bir RNA probu zenginleştirme sistemi kullanarak, promotör interaktom olarak da bilinen 28.650 insan veya 27.595 fare açıklamalı gen promotörü ile etkileşime giren genomik bölgelerin genom çapında yüksek çözünürlüklü kütüphanelerini üretebilir. Bu yaklaşım, hem aktif hem de inaktif promotörlerin kısıtlama fragmanı seviyesi çözünürlüğünde önemli uzun menzilli etkileşimleri tespit etmeyi ve histon modifikasyonlarının veya protein bağlanmasının dinamiklerinden bağımsız olarak herhangi bir durum arasındaki promotör etkileşimlerini sağlam bir şekilde karşılaştırmayı sağlar. PCHi-C, hücre farklılaşması sırasında promotör interaktom reorganizasyonlarını tanımlamak için son yıllarda yaygın olarak kullanılmaktadır 36,37, transkripsiyon faktörlerinin etki mekanizmasını tanımlamak38,39 ve kodlamayan varyantlar tarafından hastalıkta deregüle edilmiş yeni potansiyel genler ve yollar keşfetmek 40,41,42,43,44,45,46,47,48, yeni sürücü kodlamayan mutasyonlarla birlikte49,50. Ayrıca, sadece yakalama sistemini değiştirerek, bu teknik herhangi bir interaktomu sorgulamak için biyolojik soruya göre özelleştirilebilir (örneğin, arttırıcı interaktom 51 veya kodlamayan değişiklikler koleksiyonunun interaktomu41,52).
Bununla birlikte, PCHi-C, tekniği gerçekleştirmek için en az 20 milyon hücreye dayanır, bu da gelişimsel biyoloji ve klinik uygulamalarda sıklıkla kullanılanlar gibi kıt hücre popülasyonlarının incelenmesini önler. Bu nedenle, düşük hücre girdili yüksek çözünürlüklü promotör etkileşimleri oluşturmak için PCHi-C'nin deneysel çerçevesine dayanan yeni bir uygun maliyetli ve özelleştirilebilir yöntem olan düşük girdili Capture Hi-C'yi (liCHi-C) geliştirdik. Deneyi minimum tüp değişiklikleriyle gerçekleştirerek, orijinal PCHi-C protokolünden adımları değiştirerek veya ortadan kaldırarak, reaksiyon hacimlerini önemli ölçüde azaltarak ve reaktif konsantrasyonlarını değiştirerek, kütüphane karmaşıklığı en üst düzeye çıkarılır ve 50.000 hücreye kadar yüksek kaliteli kütüphaneler oluşturmak mümkündür53.
Düşük girdili Yakalama Hi-C (liCHi-C), PCHi-C ile karşılaştırılmıştır ve insan hematopoetik hücre farklılaşması sırasında promotör interaktom yeniden kablolamasını aydınlatmak, kodlamayan değişikliklerle deregüle edilen potansiyel yeni hastalıkla ilişkili genleri ve yolları keşfetmek ve kromozomal anormallikleri tespit etmek için kullanılmıştır53. Adım adım protokol ve teknik aracılığıyla farklı kalite kontrolleri, kütüphanelerin son nesline ve hesaplamalı analizlerine kadar burada detaylandırılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mM Biotin-14-dATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x T4 DNA ligase reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/mL Bovine Serum Albumin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock Gel Light tubes</td>
			<td>Qiuantabio</td>
			<td>2302820</td>
			<td>For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters and PCR primers for library amplification</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Bought as individual primers with PAGE purification for NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHiCAGO R package</td>
			<td>1.14.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanNGS beads</td>
			<td>CleanNA</td>
			<td>CNGS-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U120A, U121A, U122A, U123A</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65602</td>
			<td>For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiCUP</td>
			<td>0.8.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII, 100 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow EXO- 5000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-retention filter tips&#160;(10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L and 1000 &#181;L)</td>
			<td>ZeroTip</td>
			<td>PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>For sonication in section 6 (sonication)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF, 100 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3131M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers for quality controls</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips&#160;and caps</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>410022, 401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531L</td>
			<td>For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) 
			and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td>For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutsmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS - Solution 10% for molecular biology</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect custom 3-5.9 Mb library</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-4831</td>
			<td>Custom designed mouse or human capture system, used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Target Enrichment Box 1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-8645</td>
			<td>Used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>931107</td>
			<td>Used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224025</td>
			<td>For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 2000000/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td>For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK 10000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 4200 instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and 
			section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,</td>
			<td>For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and 
			section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 for molecular biology</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated workflow to study the promoter-centric spatio-temporal genome architecture in scarce cell populations

Spatiotemporal gen transkripsiyonu, transkripsiyonu kontrol etmek için hedef gen promotörleriyle fiziksel yakınlığa dayanan arttırıcılar ve susturucular gibi distal düzenleyici unsurlar tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bu düzenleyici elementlerin tanımlanması kolay olsa da, hedef genlerinin tahmin edilmesi zordur, çünkü çoğu hücre tipine özgüdür ve doğrusal genom dizisinde yüzlerce kilobaz ile ayrılabilir, diğer hedef olmayan genleri atlayabilir. Birkaç yıldır, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C), distal düzenleyici elementlerin hedef genleriyle ilişkilendirilmesinde altın standart olmuştur. Bununla birlikte, PCHi-C, milyonlarca hücrenin mevcudiyetine dayanır ve birincil dokulardan yaygın olarak elde edilenler gibi nadir hücre popülasyonlarının incelenmesini yasaklar. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, genomun her genini kontrol eden distal düzenleyici elemanların repertuarını tanımlamak için uygun maliyetli ve özelleştirilebilir bir yöntem olan düşük girdili Capture Hi-C (liCHi-C) geliştirilmiştir. liCHi-C, PCHi-C ile benzer bir deneysel ve hesaplamalı çerçeveye dayanır, ancak minimum tüp değişiklikleri kullanarak, reaktif konsantrasyonunu ve hacimlerini değiştirerek ve adımları değiştirerek veya ortadan kaldırarak, kütüphane inşaatı sırasında minimum malzeme kaybını hesaba katar. Toplu olarak, liCHi-C, gelişimsel biyoloji ve hücresel fonksiyon bağlamında gen regülasyonu ve mekansal temporal genom organizasyonunun incelenmesini sağlar.

Temporal gene expression drives cell differentiation and, ultimately, organism development, and its alteration is closely related to a wide plethora of diseases1,2,3,4,5. Gene transcription is finely regulated by the action of regulatory elements, which can be classified as proximal (i.e., gene promoters) and distal (e.g., enhancers or silencers), the latter of which are frequently located afar from their target genes and physically interact with them through chromatin looping to modulate gene expression6,7,8.
The identification of distal regulatory regions in the genome is a matter which is widely agreed upon, since these regions harbor specific histone modifications9,10,11 and contain specific transcription factor recognition motifs, acting as recruiting platforms for them12,13,14. Besides, in the case of enhancers and super-enhancers15,16, they also have low-nucleosome occupancy17,18 and are transcribed into non-coding eRNAs19,20.
Nonetheless, each distal regulatory element&#39;s target genes are more difficult to predict. More often than not, interactions between distal regulatory elements and their targets are cell-type and stimulus specific21,22, span hundreds of kilobases, bridging over other genes in any direction23,24,25, and can even be located inside intronic regions of their target gene or other non-intervening genes26,27. Furthermore, distal regulatory elements can also control more than one gene at the same time, and vice versa28,29. This positional complexity hinders pinpointing regulatory associations between them, and therefore, most of each regulatory element&#39;s targets in every cell type remain unknown.
During recent years, there has been a significant boom in the development of chromosome conformation capture (3C) techniques for studying chromatin interactions. The most widely used of them, Hi-C, allows to generate a map of all the interactions between every fragment of a cell&#39;s genome30. However, to detect significant interactions at the restriction fragment level, Hi-C relies on ultra-deep sequencing, prohibiting its use to routinely study the regulatory landscape of individual genes. To overcome this economic limitation, several enrichment-based 3C techniques have emerged, such as ChIA-PET31, HiChIP32, and its low-input counterpart HiCuT33. These techniques depend on the use of antibodies to enrich for genome-wide interactions mediated by a specific protein. Nonetheless, the unique feature of these 3C techniques is also the bane of their application; users count on the availability of high-quality antibodies for the protein of interest and cannot compare conditions in which the binding of the protein is dynamic.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) is another enrichment-based 3C technique that circumvents these limitations34,35. By employing a biotinylated RNA probe enrichment system, PCHi-C is able to generate genome-wide high-resolution libraries of genomic regions interacting with 28,650 human- or 27,595 mouse-annotated gene promoters, also known as the promoter interactome. This approach allows one to detect significant long-range interactions at the restriction fragment level resolution of both active and inactive promoters, and robustly compare promoter interactomes between any condition independently of the dynamics of histone modifications or protein binding. PCHi-C has been widely used over recent years to identify promoter interactome reorganizations during cell differentiation36,37, identify the mechanism of action of transcription factors38,39, and discover new potential genes and pathways deregulated in disease by non-coding variants40,41,42,43,44,45,46,47,48, alongside new driver non-coding mutations49,50. Besides, by just modifying the capture system, this technique can be customized according to the biological question to interrogate any interactome (e.g., the enhancer interactome51 or the interactome of a collection of non-coding alterations41,52).
However, PCHi-C relies on a minimum of 20 million cells to perform the technique, which prevents the study of scarce cell populations such as the ones often used in developmental biology and clinical applications. For this reason, we have developed low input Capture Hi-C (liCHi-C), a new cost-effective and customizable method based on the experimental framework of PCHi-C to generate high-resolution promoter interactomes with low-cell input. By performing the experiment with minimal tube changes, swapping or eliminating steps from the original PCHi-C protocol, drastically reducing reaction volumes, and modifying reagent concentrations, library complexity is maximized and it is possible to generate high-quality libraries with as little as 50,000 cells53.
Low input Capture Hi-C (liCHi-C) has been benchmarked against PCHi-C and used to elucidate promoter interactome rewiring during human hematopoietic cell differentiation, discover potential new disease-associated genes and pathways deregulated by non-coding alterations, and detect chromosomal abnormalities53. The step-by-step protocol and the different quality controls through the technique are detailed here until the final generation of the libraries and their computational analysis.

Yazar Spotlight: Kıt Hücre Popülasyonlarında Promoter Merkezli Uzay-Zamansal Genom Mimarisini İncelemek İçin Entegre Bir İş Akışı  

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

With liCHi-C, the main question that we are trying to answer is how the chromatin interacts in the nucleus, and therefore, to understand a new layer of gene regulation. We have proven with liCHi-C that we can explore the genome organization of a given sample, link the non-coding mutation associated with disease with potential genes affected, and detect chromosomal rearrangements, such as translocation, for example, in tumor samples. Now we can explore the 3D chromatin organization of scar cell types, such as primary stem cells or relevant clinical samples.Our protocol reduces the input materials and the time and cost needed to obtain quality data to explore the genome organization at the restriction fragment resolution. liCHi-C is expanding the reach of the 3D chromatin organization field, allowing us to explore new cell types previously impossible to analyze. Thanks to liCHi-C, the scientific community can explore the special regulation of gene expression.For example, in malignant transformation only in a specific clonal sub-population inside a tumor.

liCHi-C, 50.000 hücreye kadar yüksek kaliteli ve çözünürlüklü genom çapında promotör interaktom kütüphaneleri üretme imkanı sunar53. Bu, reaksiyon hacimlerinin ciddi şekilde azaltılması ve protokol boyunca DNA düşük bağlayıcı plastik eşyaların kullanılmasının yanı sıra, önemli malzeme kayıplarının meydana geldiği orijinal protokolden gereksiz adımların kaldırılmasıyla gerçekleştirilir. Bunlar, çapraz bağlamadan sonra fenol saflaştırma, biyotin giderim...

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations at JoVE.com

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity ...

LiCHi-C ile cevaplamaya çalıştığımız ana soru, kromatinin çekirdekte nasıl etkileşime girdiği ve dolayısıyla yeni bir gen düzenleme katmanını anlamaktır. liCHi-C ile belirli bir numunenin genom organizasyonunu keşfedebileceğimizi, hastalıkla ilişkili kodlamayan mutasyonu etkilenen potansiyel genlerle ilişkilendirebileceğimizi ve örneğin tümör örneklerinde translokasyon gibi kromozomal yeniden düzenlemeleri tespit edebileceğimizi kanıtladık. Artık birincil kök hücreler veya ilgili klinik örnekler gibi skar hücresi tiplerinin 3D kromatin organizasyonunu keşfedebiliriz.Protokolümüz, kısıtlama parçası çözünürlüğünde genom organizasyonunu keşfetmek için girdi materyallerini ve kaliteli veri elde etmek için gereken zamanı ve maliyeti azaltır. liCHi-C, 3D kromatin organizasyon alanının erişimini genişletiyor ve daha önce analiz edilmesi imkansız olan yeni hücre tiplerini keşfetmemize izin veriyor. liCHi-C sayesinde, bilimsel topluluk gen ekspresyonunun özel düzenlemesini keşfedebilir.Örneğin, malign dönüşümde sadece bir tümör içindeki belirli bir klonal alt popülasyonda.

an-integrated-workflow-to-study-promoter-centric-spatio-temporal

Research

JoVE Journal

Genetics

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

968 Görüntüleme.  Josep Carreras Leukaemia Research Institute. LiCHi-C ile cevaplamaya çalıştığımız ana soru, kromatinin çekirdekte nasıl etkileşime girdiği ve dolayısıyla yeni bir gen düzenleme katmanını anlamaktır. liCHi-C ile belirli bir numunenin genom organizasyonunu keşfedebileceğimizi, hastalıkla ilişkili kodlamayan mutasyonu etkilenen potansiyel genlerle ilişkilendirebileceğimizi ve örneğin tümör örneklerinde translokasyon gibi kromozomal yeniden düzenlemeleri tespit edebileceğimizi kanıtladık. Artık birincil kök...

Video: Yazar Spotlight: Kıt Hücre Popülasyonlarında Promoter Merkezli Uzay-Zamansal Genom Mimarisini İncelemek İçin Entegre Bir İş Akışı  

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity with their target gene promoters to control transcription. Although these regulatory elements are easy to identify, their target genes are difficult to predict, since most of them are cell-type specific and may be separated by hundreds of kilobases in the linear genome sequence, skipping over other non-target genes. For several years, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) has been the gold standard for the association of distal regulatory elements to their target genes. However, PCHi-C relies on the availability of millions of cells, prohibiting the study of rare cell populations such as those commonly obtained from primary tissues. To overcome this limitation, low input Capture Hi-C (liCHi-C), a cost-effective and customizable method to identify the repertoire of distal regulatory elements controlling each gene of the genome, has been developed. liCHi-C relies on a similar experimental and computational framework as PCHi-C, but by employing minimal tube changes, modifying&#160;the reagent concentration and volumes, and swapping or eliminating steps, it accounts&#160;for minimal material loss during library construction. Collectively, liCHi-C enables the study of gene regulation and spatiotemporal genome organization in the context of developmental biology and cellular function.

Gene expression is regulated by interactions of gene promoters with distal regulatory elements. Here, we descirbe how low input Capture Hi-C (liCHi-C) allows the identification of these interactions in rare cell types, which were previously unmeasurable.

Genetik

Lysis and Digestion of Scarce Cells

To begin, take an aliquot of frozen scarce cells and add 1 milliliter of cold lysis buffer to disrupt the cell membrane. Incubate the cells on ice for 30 minutes, mixing by inversion every five minutes. Centrifuge the nuclei for 10 minutes at 1, 000 G.Remove the supernatant and re-suspend the nuclei in 500 microliters of cold 1.25X restriction buffer 2.Then add 5.5 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate, mix by vortexing and incubate in a thermo block. Then quench the SDS by adding 37.5 microliters of 10%Triton X-100. Mix and incubate the sample as demonstrated earlier.Add 7.5 microliters of Hind III to digest the chromatin mix the solution and incubate overnight at 37 degrees Celsius.

Kıt Hücrelerin Parçalanması ve Sindirimi

Ligation and Decrosslinking of Scarce Cell DNA

To begin, take the digested scarce cell's DNA and place it on ice. Prepare a master mix by using the reagents required to fill in and biotinylate the restriction fragment overhangs. Incubate the sample at 37 degrees Celsius for 75 minutes, mixing by inversion every 15 minutes.Chill the sample on ice, and ligate the filled-in DNA ends by preparing a master mix using the reagents required for ligation. Finally, incubate the sample for four to six hours at 16 degrees Celsius, and then for 30 minutes at room temperature. Add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter of Proteinase K to decrosslink the chromatin.Mix the solution, and incubate overnight at 65 degrees Celsius.

Kıt Hücre DNA'sının Bağlanması ve Çapraz Bağlanması

Sonication and Biotin Pull-Down of Scarce Cells DNA

After purifying the DNA, begin by taking ligated and decross-linked digested chromatin of the scarce cells. Set the water bath sonicator at a duty factor of 20%peak incidence power of 50 to 200 cycles per burst for 65 seconds, and a temperature range of 6 to 10 degrees Celsius, and sonicate the ligated and decross-linked digested chromatin. After end repairing the sample, transfer 150 microliters of C1 streptavidin beads per sample to a 1.5 milliliter tube.Place them on a 1.5 milliliter tube magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Then remove the supernatant, leaving the beads behind. Next, wash the beads by adding 400 microliters of Tween buffer and resuspending them with soft vortexing.Place the tube back in the magnet until all the beads are stuck to the wall. Then remove the supernatant, leaving the beads behind. After resuspending the beads, in 300 microliters of 2X No-Tween buffer or NTB, combine them with the 300 microliters of the sample.Finally, incubate for 15 minutes rotating at room temperature to pull down the informative DNA fragments with biotin.

Sonication ve Biotin kıt hücrelerin DNA'sının aşağı çekilmesi

dATP-Tailing, Adapter Ligation, and PCR Amplification of Scarce Cell DNA

DATP-Tailing, Adapter Ligation, and PCR Amplification of Scarce Cell DNA  

To begin, take the scarce cell's DNA fragments pulled with biotin. Prepare a master mix by adding the reagents for dATP tailing and incubate the sample for 30 minutes at 37 degrees Celsius. Then, inactivate Klenow exo-minus by incubating the sample for 10 minutes at 65 degrees Celsius and cooling it on ice.After washing the beads with 300 microliters each of TB, NTB, and 100 microliters of ligation buffer, resuspend them in 50 microliters of ligation buffer. Add four microliters of 15 micromolar pre-annealed adapter mix and one microliter of 2000 units per microliter T4 DNA ligase to the sample. Wash the beads with 400 microliters of TB, 200 microliters of NTB, and 100 microliters of restriction buffer two.After amplifying the library by PCR, pool all the 50 microliter reactions from the same sample into a 1.5 milliliter DNA low binding tube. Place it on a tube magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube and top up with TLE buffer to 500 microliters.To perform a double-sided selection using paramagnetic bead purification, add 200 microliters of stock beads to the library, mix by vortexing, and incubate for 10 minutes, rotating at room temperature. Then, place the library on a magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube.Concentrate the beads by taking 750 microliters of stock beads and placing them in a 1.5 milliliter tube on a magnet. Once all the beads are stuck to the wall, remove the supernatant and resuspend the beads by vortexing in 300 microliters of new stock beads. Add 300 microliters of concentrated beads to the sample.Mix by vortexing and incubate for 10 minutes, rotating at room temperature. Place on a magnet. Wait until all the beads are stuck to the wall and remove the supernatant.Wash the beads by adding one milliliter of 70%ethanol to the tube with the beads still on the magnet. Allow the beads to air dry and resuspend them in 21 microliters of TLE buffer by vortexing. To elute the library from the beads, incubate the sample for 10 minutes at 37 degrees Celsius in a thermoblock.Place the tube in a magnet and transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube.

dATP-Tailing, Adaptör Ligasyonu ve Kıt Hücre DNA'sının PCR Amplifikasyonu

Library Capture, Biotin Pull-Down, and PCR Amplification Using Scarce Cell DNA Library

Begin by taking 500 to 1000 nanograms of the scarce cell DNA library. Dry the DNA with a vacuum concentrator and resuspended it in 3.4 microliters of nuclease-free water. After adding the blockers, and while on the thermocycler, at 65 degrees Celsius, transfer the hybridization solution with the biotinylated RNA to the blocked library.After closing the tube lid firmly, incubate in the thermocycler overnight at 65 degrees Celsius. Then transfer 50 microliters of T1 Streptavidin beads per sample to a 1.5 milliliter DNA low binding tube and place them on a 1.5 milliliter tube magnet. Once all the beads are stuck to the wall, remove the supernatant leaving the beads behind.Now wash the beads thrice with 200 microliters of the binding buffer from the target enrichment kit and resuspend the beads in 200 microliters of binding buffer. Transfer the sample to the resuspended beads while on the thermocycler and incubate for 30 minutes. After washing the beads with 200 microliters of wash buffer 1, incubate them for 15 minutes, rotating at room temperature.Then wash the beads thrice with 200 microliters of wash buffer 2 heated to 65 degrees Celsius and incubate in a thermo block. Finally, after amplifying the library by PCR, perform a DNA purification using paramagnetic beads by adding 270 microliters of stock beads to the sample and mixing by vortexing. An automated electrophoresis profile from a library, just before capture, provided 49.7 nanograms per microliter of DNA in 20 microliters reaction volume.However, 3.06 nanograms per microliter of DNA is obtained from a high sensitivity automated electrophoresis profile from a finished leachic library.