Bu yöntem, hücrelerin toplu olarak nasıl organize olduğunu manipüle etmeyi ve ölçmeyi mümkün kılar. Bu önemlidir, çünkü in vitro ve disentangle ipuçlarını in vivo ile sıkıca birleştirilmiş olarak modelleyebiliriz. Bu teknik, standart bir biyoloji laboratuvarında kurulmasına olanak tanıyan en az uzman ekipman gerektirir ve kantitatiftir ve alt-görsel desenleme olaylarının keşfini mümkün kılar.
Bu yöntem, desenlemenin ortaya çıkabileceği herhangi bir hücre sistemine kolayca uygulanabilir ve rastgele olmayan farklılaşma, çoğalma ve hücreden hücreye rekabetinin modellerini keşfedebilir. Bu yöntemin ana yeni hücre tipleri için mikro desenleme parametrelerinin sistematik optimizasyonu dur. Örneğin, desen boyutu ve şekli, matris türü ve hücre yapışma süresi.
Eldiven giyerek, 10 santimetre karelik petri kabının dibine bir parça laboratuvar filmi yerleştirin. Hidrofobik plastik slaytları kesmek için 12 milimetrelik bir delik delme kullanın ve kapak fişleri yeni bir Petri kabına yerleştirin. Koruyucu filmi kapak fişlerinden dikkatlice çıkarmak için cımbız kullanın.
Fotoğraf maskesini temiz ve kararlı bir yüzeye yerleştirin, krom tarafını yukarı yada ve istenilen talaş tasarımına iki mikrolitrelik çift distile su ekleyin. Yavaşça damla üzerine bir kapak fişi basın ve plastik slaytlar üstüne tutucu yerleştirin. Fotoğraf maskesi ile temas halinde plastik parçaları korumak için kelepçeler ile dikkatle bu sandviç düzeltmek.
10 dakikalık bir aydınlatma için ışık kaynağından yaklaşık iki santimetre bir ultraviyole ozon lambası montaj yerleştirin. Aydınlatma süresinin sonunda, alttaki fotoğraf maskesi ile sandviçi tutun ve bir yandan sandviçi sökerken kaydırakların hareket etmesini önlemek için basıncı korurken kelepçeleri dikkatlice çıkarın. Tüm kelepçeler çıkarıldığında, tüm plastik parçaların maskeüzerinde hala durmasına ve tutucuya yapışmadığını göz önünde bulundurarak tutucuyu çıkarın ve cipslere çift distile su ekleyerek cipsleri fotoğraf maskesinden nazikçe ayırın.
Fotoğraf desenli talaşları matris biriktirme odasının içine yerleştirin, ışıklı tarafı yukarı yada ve her yonganın üzerine 200 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyin. Daha sonra, bir gecede dört santigrat derecede buharlaşmayı sınırlamak için odaya çift distile su ile dolu üç santimetrelik Petri kabı ekleyin. Embriyonik hücrelerin çiplerin üzerine tohumlanması için, her bir çipin üzerine uygun hücre kültürü ortamının 200 mikrolitresinde beşinci hücrelere bir kere on kere dağıtmadan önce, talaşları her bir çipte en az beş dakikalık yıkamalarda en az beş dakikalık yıkama ile yıkayın.
Sonra tohumlama odasını kapatın. Hücrelerin çiplere yapışmasını sağlamak için bir saat kuluçkaya yat. Hücreler bağlandığında, çok kuyulu bir plakanın kuyularını her kuyuda 500 mikrolitre sıcak ortamla doldurun ve talaşları tek tek plaka kuyularına aktarmak için steril cımbız kullanın.
Yapışmaz hücreleri ayırmak için tabağı şiddetle çalkalayın ve süpernatant'ı hemen taze, sıcak ortamla değiştirin. Daha sonra desenleme görünür olup olmadığını gözlemlemek için mikroskop altında kontrol edin. Kaplamalarından 48 saat sonra, hücreler desenlerin şeklini titizlikle takip eden yoğun koloniler oluşturmalıdır.
Plaka da yongaları bırakarak, tüm ama sadece yeterli orta kurumasını yongaları önlemek için kaldırmak ve iyi başına paraformaldehit veya PFA tabanlı fiksasyon çözeltisi en az 500 mikrolitre ekleyin. On dakika sonra, kısaca yıkama çözeltisi ile kuyuları üç kez yıkayın, ardından 50 milimolar amonyum klorür ile yıkama çözeltisi seyreltilmiş artık PFA crosslinking aktivitesini söndürmek için. Son yıkamadan sonra, numuneleri en az 30 dakika boyunca engelleme solüsyonu ile tedavi edin.
Çip kültürlerinin immünboyboyama için, bir boyama odası hücre tarafına yongaları aktarın ve hemen her çip ilgi birincil antikor çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında dönen bir platformda bir saat sonra, yongaları gösterildiği gibi yıkama çözeltisi ile üç kez yıkayın ve talaşları dönen platformda bir saat boyunca uygun ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. İkincil antikor kuluçkasının sonunda, talaşları yıkama çözeltisinde üç kez yıkayın ve çipi herhangi bir standart montaj ortamının 20 mikrolitresi ile mikroskopi slaytına monte edin.
Çipleri görüntülemek için, görüntü kalitesi ile görüntüleme süresi arasında optimum bir değer belirlemek için önce tarama hızını, görüntü çözünürlüğünü, kare ortalamasını ve dedektör kazançlarını ayarlayın. Sonra her çipgörüntüleri elde. Tüm görüntüler edinildiğinde, çevrimiçi olarak sunulan belgeleri takip eden PickCells'i yükleyin ve çalıştırın, yeni bir deneme oluşturun ve görüntüleri programa aktarın.
Nükleer zarf sinyaline göre çekirdekleri segmente etmek için Nessys modüllerini kullanın. Desenin otofloresan sinyalini tanımlamak için temel segmentasyon modüllerini kullanın. Ardından Bitir"e tıklayın ve tüm görüntülerin işlenmesini bekleyin.
Çekirdek nesneleri oluşturmak ve temel nesne özelliklerini hesaplamak için görev çubuğundan İçsel Özellikler modülünü başlatın ve yalnızca Temel Özellikler panelini açık tutmak için Elipsoid Aşındırıcı ve Yüzey Çıkarıcı panellerini kapatın. Nesne Türü olarak çekirdek"i seçin ve parçalı görüntüler için verilen önek'i seçin. Ardından İşlem"i tıklatın ve tüm görüntülerin işlenmesini bekleyin.
Bu aşamada, analizlerimiz için verileri ihraç etmeden önce çekirdeklere ek özellikler yazılması gerekmektedir. Örneğin, her çekirdeğin ait olduğu resmin adını Nucleus Özniteliği olarak depolamak için, Açılan Pencere'de Veri"yi ve Yeni Öznitelik'i tıklatın ve çekirdeği seçin. Tamam"ı seç düğümüne bağlı diğer nesnelerden veri topla'yı tıklatın ve Sonraki"Sol panelde Resim'i seçin" seçeneğini tıklatın ve yol hedefi olarak görüntü düğümünü ayarlamak için sorgu işaretine çift tıklayın.
Azaltma İşlemi bölmesini genişletin ve "Kullanılabilir Öznitelik bölmesini Genişlet ve Ad özniteliğini seçin. Ardından Değiştir"i ve Sonraki"Resim adını girin, Sekme tuşuna basın ve Bitiş"i tıklatın ve verileri sekmeyle ayrılmış bir değer dosyasına aktarın. Analizlerimiz için, dışa aktarılan verileri R-Script klasörünün veri klasörüne aktarın.
Studio'muzu açın" ve binned harita şablonu R-Script açın"Sonra kaynak dosya konumuna çalışma dizini ayarlayın ve yoğunluk haritaları oluşturmak için komut dosyası çalıştırın. Hücre tohumlamadan bir saat sonra, hücreler zamanla çoğaldığı için hücre kültürü pattens tam olarak konca olmayabilir. Ancak, desenler tamamen yapışkan yüzeyler dışında sadece çok az hücre ile kolonize olacak.
Tohumlamadan iki saat sonrasına kadar net olmayan desenleme, yordamın başarısız olduğunu gösterir. Fare embriyonik kök hücrelerinin büyük diskler veya halka mikro desenleri üzerindeki mekansal hapsi, mezodermal brakitür belirteçlerini ifade eden bir alt hücre popülasyonunun desenlenmesini yönlendirir. Örneğin, fare embriyonik kök hücreleri büyük disk mikro desenleri üzerinde büyüdüklerinde, brachyury-pozitif hücreler tercihen yerel hücre yoğunluğunun en düşük olduğu örüntünün çevresi ile sınırlıdır.
Bu desenleme beyin-brachyury yoğunluğu haritası ile doğrulanır. Bu veriler, bir koloninin denetimi ilgi ifade belirteci mekansal organizasyonun herhangi bir biçimbelirlemek için yeterli değildir gibi yöntem in alt-görsel bilgileri ortaya çıkarabilir göstermektedir. Bu özellikle önemli koloni-koloni değişkenliği ile açıklanabilir.
Bu teknik aynı zamanda DNA bağlayıcısı inhibitörü için saptanabilir bir desenolmadığını göstermektedir ve bu da T-desenlemenin bu bağlamda kemik morfogenetik protein sinyali ile yönlendirilemediğini gösterebilir. Kapak fişinin hangi tarafının ortadan kaldırıldığını ve kapladığını her zaman hatırlayın ve ayrıca hücrelerin fazla hücreleri yıkamadan önce düzgün bir şekilde yapışmış olduğundan emin olun. Bu yöntem, hücrelerin kendi kendini düzenlemesinde önemli olan çevresel ipuçlarının incelenmesine olanak sağlar ve aynı zamanda ilkel desenleme altında bize daha iyi yardımcı olan matematiksel modelleri de bilgilendirebilir.
