Bu rapor Luminex (Austin, TX) tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, analitik ve bilimsel düzenleme yardımı için Matthew Silverman PhD'ye (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) teşekkür eder. Yazarlar ayrıca çalışmada kullanılan Borrelia antijenlerini sağladıkları için tgcBIOMICS GmbH'den (Bingen, Almanya) Harald Klein ve Christoph von Eichel-Streiber'e teşekkür eder. Teknik tahlil validasyonu ve kalite kontrolü için insan serum örnekleri şuradan elde edildi: 1) Helmholtz Enfeksiyon Araştırmaları Merkezi, Epidemiyoloji Bölümü aracılığıyla Almanya'da SARS-CoV-2'ye Karşı Antikorlar Üzerine Çok Bölgeli ve Seri Prevalans Çalışması, Braunschweig, Almanya; ve 2) Nöroloji Anabilim Dalı, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Almanya). İnsan örneklerinin kullanımı için onay, Almanya'daki Hannover Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından verilmiştir (9086_BO_S_2020).

Bu deney serisinde insan serum örneklerinin kullanımı için uygun Kurumsal İnceleme Kurulu/Etik Kurul onayı alınmıştır. Örnekler, SARS-CoV-2 seroprevalansı14 ile ilgili bir Alman ulusal çalışmasından elde edilen anonimleştirilmiş artık materyallerdi. İnsan örneklerinin kullanımı için onay, Almanya'daki Hannover Tıp Fakültesi Etik Kurulu tarafından verilmiştir (9086_BO_S_2020). Bu çalışmada toplam 21 insan serumu örneği kullanılmıştır.
1. İnsan örneklerinin kullanımı için etik onay
<ol><li>İnsan örneklerinin kullanımı için uygun etik onayları alın.</li>
</ol>2. Reaktifler ve ekipman
<ol><li>İnsan serum örnekleri: Daha önce Lyme borreliosis teşhisi konan kişilerden veya kanıtlanmış Borrelia-negatif bağışıklık durumundan serum örneklerini kullanarak teknik tahlil doğrulaması ve kalite kontrolü gerçekleştirin12,14.</li>
	<li>Tek Raporlu Enstrümantasyon. İlk tahlil geliştirme ve teknik doğrulama için iki kanallı tek raporlayıcı bir cihaz (Malzeme Tablosu) kullanın. NOT: Tek raporlayıcı sistemin iki lazeri vardır: 1) kullanılıyorsa farklı boncuk setlerini ayırt etmek için boncuk setine özgü floresansı tanımlar ve ölçer (Sınıflandırma Kanalı) ve 2) boncuk bağlı hedefe özgü fikoeritrin (PE) floresansını tespit eder ve ölçer (Reporter Kanalı; 532 nm uyarma, "turuncu" 565-585 nm emisyon). Bu nedenle, tek bir Raportör Kanalı kullanılarak bir seferde yalnızca tek bir antikor izotip sınıfı (örneğin, IgG veya IgM) analiz edilebilir.<ol><li>Anti-Borrelia IgG ve IgM'yi ayrı ayrı değerlendirmek için, her iki antikor sınıfı için PE etiketli tespit reaktiflerini kullanan tek raporlu 96 oyuklu bir formatta ilk doğrulama çalışmaları gerçekleştirin. NOT: Mevcut test, Borrelia antijeni VlsE ve DbpA'nın iki varyantı için dolaşımdaki IgG'leri ve antijen OspC'ye özgü dolaşımdaki IgM'yi temsili örnekler olarak değerlendirir. Test, istenildiği gibi diğer anti-Borrelia antijenlerine karşı serum immünoreaktivitesini değerlendirmek için genişletilebilir12.</li>
	</ol></li>
	<li>Çift Raportörlü Enstrümantasyon. İkili IgM/IgG testinin geliştirilmesi ve teknik doğrulaması için aynı reaksiyonda eşzamanlı IgG/IgM analizine izin veren üç kanallı bir çift raportör cihaz (Malzeme Tablosu) kullanın (aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Bu cihaz, hedeflenen Ig ile ilişkili sinyalleri değerlendiren 2'si Raportör Kanalı olmak üzere toplam 3 floresan algılama kanalına sahiptir. NOT: Çift raportör sistemin üç lazeri vardır: 1) boncuk setine özgü floresansı tanımlar ve ölçer (Sınıflandırma Kanalı); 2) hedefe özgü fikoeritrin (PE) floresansını tespit eder ve ölçer (Reporter Channel 1; 532 nm uyarma, "turuncu" 565-585 nm emisyon) ve 3) ikinci bir hedef analitin hedefe özgü Brilliant Violet 421 (BV421) floresansını değerlendirir (Reporter Channel 2; 405 nm uyarma, "mavi" 421-441 nm emisyon). Çift raporlayıcı sistem, hem 96 oyuklu hem de 384 oyuklu mikrotitre plakası (yarı otomatik işleme) tahlil formatlarıyla uyumludur. Genel tahlil şeması Şekil 1'de gösterilmektedir. Protokol adımları aşağıda detaylandırılmıştır.</li>
</ol>3. Antijen bağlanması
<ol><li>Borrelia antijenlerini manyetik, karboksilatlı ve floresan renk kodlu 6.5μm mikroküreciklere (boncuklar; Malzeme Tablosu) 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) / sülfo-N-hidroksisüksinimid (sNHS) kimyası kullanılarak. NOT: Ayrıntılı bir açıklama referans11ve referans12'de bulunabilir. Tablo 1'deki her bir antijenin bağlanma konsantrasyonunu bulun. Birleştirilmiş boncuklar kullanılana kadar karanlıkta 4 °C'de saklanmalıdır. Birleştirme ve algılama reaksiyonlarında kullanılan tüm tamponlar Ek Malzemelerde detaylandırılmıştır.</li>
</ol>4. Test prosedürü: Tek raportörlü IgG veya IgM serolojik tahlil: 96 oyuklu format
<ol><li>Numuneyi 2 adımda seyreltin (her ikisi de 96 oyuklu plakalarda 2 adım; tahlil tamponunda 200 kat serum numunesi seyreltmesi). NOT: Test tamponu bileşimi, %1 (a/h) sığır serum albümini içeren 1: 4 Düşük Çapraz Tampon: PBS karışımıdır. Tween-20, karışıma %0.05'lik (h/h) bir nihai konsantrasyona kadar eklenir.<ol><li>Numune seyreltme adımı 1: 5 μL serum örneğini 120 μL test tamponu (25 kat seyreltme) ile karıştırın.</li>
		<li>Numune seyreltme adımı 2: Son numune seyreltmesini 200 kat yapmak için 10 μL seyreltmeyi 70 μL tahlil tamponu ile karıştırarak 25 kat numune seyreltmesini ek olarak 8 kat seyreltin.</li>
	</ol></li>
	<li>Manyetik boncuk karışımı seyreltme<ol><li>Boncuk popülasyonu başına 1.0 × 106 boncuk / mL içeren bir boncuk karışımı hazırlayın (yani, benzersiz hedef antijen başına).</li>
		<li>Bu seyreltilmiş süspansiyondaki nihai boncuk konsantrasyonunun şimdi boncuk popülasyonu başına 4 × 104 boncuk / mL olmasını sağlamak için hazırlanan boncuk karışımını tahlil tamponunda 25 kat seyreltin (yani, benzersiz hedef antijen başına).</li>
	</ol></li>
	<li>Boncuklarla serum örneği inkübasyonu<ol><li>25 μL seyreltilmiş birleştirilmiş multipleks boncuk süspansiyonunu (4.0 × 104 boncuk/set/mL içeren) 96 oyuklu yarım alanlı bir mikrotitre plakasının (Malzeme Tablosu) atanmış kuyucuklarına pipetleyin.</li>
		<li>25 μL 200 kat seyreltilmiş serum numunesi (yukarıdaki Adım 4.1'den) 25 μL birleştirilmiş boncuk süspansiyonu içeren uygun kuyucuklara ekleyin. NOT: Bu, ek bir 2 kat seyreltme üretir, bu nedenle kuyucuktaki son serum numunesi seyreltmesi 400 kattır ve son boncuk sayısı 1000 boncuk/boncuk seti/50-μL reaksiyondur.</li>
		<li>96 oyuklu reaksiyon plakasını bir mikroplaka contası (yapışkan folyo veya plastik plaka kapakları) ile kapatın.</li>
		<li>Plakayı 20 °C'de, 750 rpm'de 2 saat bir plaka çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Boncuk yıkama<ol><li>96 oyuklu reaksiyon plakasını plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve yapışkan plaka contasını dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>96 oyuklu reaksiyon plakasını bir plaka yıkayıcıya koyun.</li>
		<li>Otomatik manyetik plaka yıkayıcıyı kullanarak boncukları 100 μL yıkama tamponu (1× PBS + %0,05 v/v Tween 20) ile üç kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yıkanmış boncukları 100 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin, plakayı yapışkan folyo veya plastik plaka kapağı ile örtün ve plakayı 1000 rpm'de 20 °C'de 1 dakika boyunca bir plaka çalkalayıcı üzerinde sallayın.</li>
	<li>Yıkanmış boncukları ayırın<ol><li>96 oyuklu reaksiyon plakasını plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve yapışkan plaka contasını dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>Reaksiyonları beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve her 100 μL'lik reaksiyon hacminin 50 μL'sini, biri IgG tespiti ve diğeri IgM tespiti için olmak üzere iki yeni 96 oyuklu reaksiyon plakasının her birine aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Tespit antikoru/reaktif inkübasyonu NOT: Bu noktada, antijen(ler) ile reaksiyona giren serumda (varsa) dolaşımdaki antikorları çıkarmak için hedef antijene bağlı boncuklar serum örnekleri ile inkübe edilmiştir. Bağlı immünoglobulin ile reaksiyona giren boncuklar iki plakaya bölünmüştür ve IgG ve IgM şimdi PE etiketli izotipe özgü ikincil antikorlar kullanılarak ayrı plakalarında tespit edilmekte ve ölçülmektedir. 20 dakika kademeli plaka kullanımı.<ol><li>Manyetik plaka yıkayıcıyı kullanarak süpernatanı manyetik boncuklar içeren kuyulardan aspire edin.</li>
		<li>Her plaka için, PE konjuge keçi anti-insan IgG (3 μg / mL) veya PE konjuge eşek anti-insan IgM (5 μg / mL) içeren uygun Ig Saptama Reaktifi karışımını (anti-IgG veya anti-IgM) yapın tahlil tamponunda. Boncuk içeren her kuyucuk için 30 μL Tespit Reaktifi kullanılır. Pipetleme kayıplarını karşılamak için yeterli ekstra hacimle reaksiyon kuyuları için yeterli IgG ve IgM Algılama Reaktifi hacimleri hazırlayın.</li>
		<li>IgG plakası üzerinde reaksiyona giren boncuklar içeren her bir oyuğa 30 μL IgG Algılama Reaktifi pipetleyin ve 96 oyuklu reaksiyon plakasını bir mikroplaka contası ile kapatın.</li>
		<li>IgM plakası üzerinde reaksiyona giren boncuklar içeren her bir oyuğa 30 μL IgM Algılama Reaktifi pipetleyin ve 96 oyuklu reaksiyon plakasını bir mikroplaka contası ile kapatın.</li>
		<li>Bir plaka çalkalayıcıda 750 rpm'de çalkalarken 20 °C'de 45 dakika inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Boncuk yıkama<ol><li>96 oyuklu reaksiyon plakasını plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve yapışkan plaka contasını dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>96 oyuklu reaksiyon plakasını manyetik bir plaka yıkayıcıya yerleştirin.</li>
		<li>Manyetik plaka yıkayıcıyı kullanarak boncukları 100 μL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Boncukları 100 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Sonuçları tek raporlayıcı aracında analiz edin.<ol><li>96 oyuklu reaksiyon plakasını bir mikroplaka contası ile kapatın.</li>
		<li>96 oyuklu reaksiyon plakasını bir plaka çalkalayıcı üzerinde 20 °C'de, 1000 rpm'de 3 dakika çalkalayın.</li>
		<li>96 oyuklu reaksiyon plakasını plaka çalkalayıcıdan aktarın ve tek raporlu bir akış analizörü cihazına (Malzeme Tablosu) koyun.</li>
		<li>Her numune için, aşağıdaki cihaz ayarlarını kullanarak medyan floresan yoğunluğunu (MFI) analiz edin: Alım hacmi = 80 μL, Sayım = 50/boncuk popülasyonu, Zaman Aşımı = 60s, Geçit = 7.500-15.000)12,13.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Tahlil prosedürü: Çift raportörlü IgG ve IgM serolojik tahlil: 96 oyuklu format
<ol><li>Numune seyreltme (her ikisi de 96 oyuklu plakalarda 2 adım; test tamponunda 200 kat serum örneği seyreltmesi)<ol><li>Numune seyreltme adımı 1: 5 μL serum örneğini 120 μL test tamponu (25 kat seyreltme) ile karıştırın.</li>
		<li>Numune seyreltme adımı 2: Nihai numune seyreltmesini 200 kata kadar elde etmek için 10 μL ilk seyreltmeyi (Bölüm 5.1.1'den 25 kat seyreltilmiş numune) 70 μL tahlil tamponu (8 kat seyreltme) ile karıştırarak 25 kat numune seyreltmelerini 8 kat daha seyreltin.</li>
	</ol></li>
	<li>Manyetik boncuk karışımı seyreltme<ol><li>Boncuk popülasyonu başına 1.0 × 106 hedef antijene bağlı boncuk / mL içeren bir boncuk karışımı hazırlayın (ör., benzersiz hedef antijen başına). NOT: Bu deney serisinde, her reaksiyonda dört benzersiz Borrelia antijenine karşı hem IgG hem de IgM immünoreaktivitesini değerlendirdik.</li>
		<li>Hazırlanan boncuk karışımını tahlil tamponunda 50 kat seyreltin. Bu seyreltilmiş süspansiyondaki boncuk konsantrasyonu şimdi boncuk popülasyonu başına 2.0 × 104 boncuk/mL'dir. NOT: Dubleks tahlil reaksiyonundaki boncuk sayısı, iki tahlil arasında doğrudan karşılaştırılabilirliğe izin vermek ve kaynakları korumak için tek raporlu reaksiyonda kullanılandan yarıya indirilir, ön çalışmalar floresan sinyalinin doğrusal kantifikasyon aralığında tutulduğunu doğruladıktan sonra, boncuk sayısının yarısı kullanılır.</li>
	</ol></li>
	<li>Boncuklarla serum örneği inkübasyonu<ol><li>25 μL seyreltilmiş hedef antijene bağlı boncuk süspansiyonunu (2.0 × 104 boncuk/set/mL içeren) 96 oyuklu yarım alanlı bir mikrotitre plakasının önceden atanmış kuyucuklarına pipetleyin. Reaksiyon kuyucuklarının tam sayısı ve plaka üzerindeki yerleşimi, operatör tarafından belirlenen test edilen toplam numune sayısına ve numune başına tek veya çift kuyucukların çalıştırılıp çalıştırılmayacağına bağlıdır. NOT: Hedef antijene bağlı manyetik boncuklar, insan serum örnekleri ile reaksiyona girecektir. Hem anti-Borrelia antijeni immünoreaktif IgG hem de IgM, numunelerde mevcutsa, aynı antijene bağlı boncuklara bağlanacak ve immobilize edilecektir. Bağlı IgG ve IgM'nin ikincil antikor miktar tayini, daha sonra, farklılaşmalarına izin veren IgG ve IgM tanımlaması için farklı floroforlar kullanılarak, aynı reaksiyonlarda aynı boncuklar üzerinde gerçekleştirilecektir.</li>
		<li>25 μL karışık hedef antijene bağlı boncuk süspansiyonu içeren her bir oyuğa 25 μL 200 kat seyreltilmiş serum (yukarıdaki Adım 5.1'den) ekleyin (Adım 5.2). NOT: Bu, ek bir 2 kat seyreltme üretir, bu nedenle kuyucuktaki son serum numunesi seyreltmesi 400 kattır ve son boncuk sayısı 500 boncuk/boncuk seti/50-μL reaksiyondur.</li>
		<li>96 oyuklu reaksiyon plakasını bir mikroplaka conta (yapışkan folyo veya plastik plaka kapağı) ile kapatın.</li>
		<li>Plakayı boncuklarla 20 °C'de, 750 rpm'de bir plaka çalkalayıcıda 2 saat inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Boncuk yıkama (fazla serum örneğini çıkarmak için)<ol><li>96 oyuklu reaksiyon plakasını plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve yapışkan plaka contasını çıkarın.</li>
		<li>96 oyuklu reaksiyon plakasını manyetik bir plaka yıkayıcıya yerleştirin.</li>
		<li>Manyetik plaka yıkayıcıyı kullanarak boncukları 100 μL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Son yıkama adımından sonra boncuklardan son yıkama hacmini aspire edin.</li>
	<li>Tespit antikoru (İnkübasyon - Bölüm I)<ol><li>Test tamponunda PE konjuge eşek anti-insan IgM (5 μg / mL) ile birlikte biyotinile keçi anti-insan IgG (1 μg / mL) içeren taze IgG ve IgM Çift Tespit Reaktifi yapın. Boncuk içeren her kuyucuk için 30 μL Çift Algılama Reaktifi kullanılır. Reaksiyon kuyucukları için yeterli miktarda IgG ve IgM Çift Algılamalı Reaktif hacimleri hazırlayın ve pipetleme kayıplarını karşılamak için yeterli ekstra hacim hazırlayın.</li>
		<li>Atanan her bir kuyucuğa 30 μL IgG ve IgM İkili Algılama Reaktifi pipetleyin ve 96 oyuklu reaksiyon plakasını bir mikroplaka contası ile kapatın.</li>
		<li>Plakayı bir plaka çalkalayıcıda 750 rpm'de çalkalarken 20 °C'de 45 dakika inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Boncuk yıkama (aşırı tespit antikorlarını uzaklaştırmak için)<ol><li>96 oyuklu reaksiyon plakasını plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve yapışkan plaka contasını dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>96 oyuklu reaksiyon plakasını otomatik bir manyetik plaka yıkayıcıya yerleştirin.</li>
		<li>Otomatik manyetik plaka yıkayıcıyı kullanarak boncukları 100 μL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Son yıkama adımından sonra boncuklardan son yıkama hacmini aspire edin.</li>
	<li>Streptavidin konjuge raportör (Kuluçka - Bölüm II)<ol><li>Taze BV421 etiketli Streptavidin tahlil tamponunda 0.2 μg/mL konsantrasyona seyreltin. Boncuk içeren her kuyu için 30 μL BV421 etiketli Streptavidin kullanılır. Pipetleme kayıplarını karşılamak için yeterli miktarda BV421 etiketli Streptavidin hacmi hazırlayın.</li>
		<li>Her reaksiyon kuyucuğuna 30 μL seyreltilmiş BV421-Streptavidin pipetleyin ve 96 kuyulu reaksiyon plakasını mikroplaka contası ile kapatın.</li>
		<li>Bir plaka çalkalayıcı üzerinde 750 rpm'de çalkalarken plakayı 20 °C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Boncukları yıkayın (fazla BV421-Streptavidin'i çıkarmak için)<ol><li>96 oyuklu reaksiyon plakasını plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve yapışkan plaka contasını dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>96 oyuklu reaksiyon plakasını manyetik plaka yıkayıcıya yerleştirin.</li>
		<li>Otomatik manyetik plaka yıkayıcıyı kullanarak boncukları 100 μL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kuyucuklardaki boncukları, yıkama tamponunda 100 μL'lik bir nihai hacme kadar yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Çift raporlayıcılı araçta sonuçları analiz edin<ol><li>96 oyuklu reaksiyon plakasını bir mikroplaka contası ile kapatın.</li>
		<li>96 oyuklu reaksiyon plakasını bir plaka çalkalayıcı üzerinde 20 °C'de, 1000 rpm'de 3 dakika inkübe edin.</li>
		<li>96 oyuklu reaksiyon plakasını plaka çalkalayıcıdan çift raportörlü akış analizörü cihazına aktarın (Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Numune medyan floresan yoğunluğunu (MFI) üretici talimatlarına göre değerlendirin (Cihaz Ayarları: Çift Raportör Modu, Alım hacmi = 80 μL, Sayım = 50/boncuk popülasyonu, Zaman Aşımı = 60s, Geçit = 7.500-15.000).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Çift raportör IgG ve IgM serolojik tahlil: 384 kuyulu yarı otomatik format
<ol><li>Bölüm 5'te ayrıntıları verilen tahlil adımlarını kullanarak çift raporlu tahlili 384 oyuklu plaka formatında gerçekleştirin, ancak numuneleri bir pipetleme robotu ve otomatik manyetik plaka yıkayıcı (Malzeme Tablosu) kullanarak işleyin. 384 oyuklu formatta, inkübasyonlar ve yıkamalar sırasında plakaları 1450 rpm'de sallayın ve floresan ölçmeden önce plakayı 21 °C ve 1800 rpm'de 5 dakika sallayın.</li>
</ol>

Serumda Borrelia-Spesifik IgG ve IgM için Multipleks İmmünoassay

<ol>
	<li>Stanek, G., Strle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyme+borreliosis-from+tick+bite+to+diagnosis+and+treatment.">Lyme borreliosis-from tick bite to diagnosis and treatment.</a> FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 233-258 (2018).</li><li>Stanek, G., Wormser, G. P., Gray, J., Strle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyme+borreliosis.">Lyme borreliosis.</a> The Lancet. 379 (9814), 461-473 (2012).</li><li>Rizzoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyme+borreliosis+in+Europe.">Lyme borreliosis in Europe.</a> Eurosurveillance. 16 (27), 19906 (2011).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyme+borreliosis:+a+review+of+data+on+transmission+time+after+tick+attachment.">Lyme borreliosis: a review of data on transmission time after tick attachment.</a> International Journal of General Medicine. 8, 1-8 (2015).</li><li>Strle, F., Stanek, G., Lipsker, D., Jaulhac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Manifestations+and+Diagnosis+of+Lyme+Borreliosis.">Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme Borreliosis.</a> Lyme Borreliosis: Biological and Clinical Aspects. , 51-110 (2009).</li><li>Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+and+serological+diagnosis+of+Lyme+borreliosis.">Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 49 (1), 13-21 (2007).</li><li>Dessau, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+test+or+not+to+test?+Laboratory+support+for+the+diagnosis+of+Lyme+borreliosis:+a+position+paper+of+ESGBOR,+the+ESCMID+study+group+for+Lyme+borreliosis.">To test or not to test? Laboratory support for the diagnosis of Lyme borreliosis: a position paper of ESGBOR, the ESCMID study group for Lyme borreliosis.</a> Clinical Microbiology and Infection. 24 (2), 118-124 (2018).</li><li>Eldin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+European+and+American+guidelines+for+the+diagnosis+of+Lyme+borreliosis.">Review of European and American guidelines for the diagnosis of Lyme borreliosis.</a> M&#233;decine et Maladies Infectieuses. 49 (2), 121-132 (2019).</li><li>Lantos, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Practice+Guidelines+by+the+Infectious+Diseases+Society+of+America+(IDSA),+American+Academy+of+Neurology+(AAN),+and+American+College+of+Rheumatology+(ACR):+2020+Guidelines+for+the+Prevention,+Diagnosis+and+Treatment+of+Lyme+Disease.">Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America (IDSA), American Academy of Neurology (AAN), and American College of Rheumatology (ACR): 2020 Guidelines for the Prevention, Diagnosis and Treatment of Lyme Disease.</a> Clinical Infectious Diseases. 72 (1), e1-e48 (2021).</li><li>Gerritzen, A., Brandt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serodiagnosis+of+Lyme+borreliosis+with+bead+based+immunoassays+using+multiplex+technology.">Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology.</a> Methods. 56 (4), 477-483 (2012).</li><li>Embers, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-antigen+fluorescent+bead-based+assay+for+diagnosis+of+Lyme+disease.">Five-antigen fluorescent bead-based assay for diagnosis of Lyme disease.</a> Clinical Vaccine Immunology. 23 (4), 294-303 (2016).</li><li>H&#228;ring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+multiplex:+a+bead-based+multiplex+assay+for+the+simultaneous+detection+of+Borrelia+specific+IgG/IgM+class+antibodies.">Borrelia multiplex: a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of Borrelia specific IgG/IgM class antibodies.</a> BMC Infectious Diseases. 22 (1), 859 (2022).</li><li>Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+multiplex+dual+reporter+IgG+and+IgM+SARS-CoV-2+neutralization+assay+for+a+multiplexed+bead-based+flow+analysis+system.">A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system.</a> Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).</li><li>Gornyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+Seroprevalence+in+Germany.">SARS-CoV-2 Seroprevalence in Germany.</a> Deutsches &#196;rzteblatt International. 118 (48), 824-831 (2021).</li><li>Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> xMAP Cookbook. , (2022).</li><li>Racine, R., Winslow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgM+in+microbial+infections:+Taken+for+granted.">IgM in microbial infections: Taken for granted.</a> Immunology Letters. 125 (2), 79-85 (2009).</li><li>Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+natural+IgM:+scavenger,+protector+and+regulator.">The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).</li><li>Kovaleski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+purification+of+phycobiliproteins+from+algae+and+their+applications.">Extraction and purification of phycobiliproteins from algae and their applications.</a> Frontiers in Chemistry. 10, 1065355 (2022).</li><li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brilliant+violet+fluorophores:+A+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments.">Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).</li><li>Coors, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+seropositivity+for+Borrelia+burgdorferi+and+associated+risk+factors:+findings+from+the+Rhineland+Study,+Germany.">Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany.</a> Parasites &amp; Vectors. 15 (1), 241 (2022).</li><li>G&#252;rsoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+IgA+and+IgG+antibody+responses+against+periodontitis-associated+bacteria+in+Crohn's+Disease.">Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn's Disease.</a> International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385 (2023).</li><li>Argani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-HLA+Antibody:+The+role+of+epitopes+in+organ+transplantation.">Anti-HLA Antibody: The role of epitopes in organ transplantation.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 17 (Suppl 1), 38-42 (2019).</li><li>Laman, J. D., Huizinga, R., Boons, G. J., Jacobs, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guillain-Barr&#233;+syndrome:+expanding+the+concept+of+molecular+mimicry.">Guillain-Barr&#233; syndrome: expanding the concept of molecular mimicry.</a> Trends in Immunology. 43 (4), 296-308 (2022).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu rapor, serum örneklerinde anti-Borrelia immünoreaktivitesini tekrarlanabilir ve hassas bir şekilde belirleyen iki raporlu boncuk bazlı bir Borrelia immünolojik testinin geliştirilmesini vurgulamaktadır12. Lyme borreliosis'e neden olan çeşitli patojenik Borrelia türleri, varyanta özgü antijen heterojenliği 6,7,8,9 ile ayırt edilebilir. Çoğullanmış tahlil, aynı reaksiyon kuyusu içinde IgG ve IgM aracılı anti-Borrelia immünoreaktivitesini eşzamanlı olarak değerlendirir, böylece iki singleplex tahlili ayrı ayrı gerçekleştirmek için gerekli olan reaktifleri, emeği ve numune materyalini korur. IgM ve IgG yanıtlarının zaman içinde karşılaştırılması, enfeksiyondan sonra IgM'den IgG'ye serokonversiyon meydana geldiğinden hastalık ilerlemesinin daha iyi izlenmesine izin verebilir6.
Çift raportör sistemi iki farklı tespit antikor sistemikullanır 13,15. İlgili deneyler, her iki antikor sınıfı aynı reaksiyon kuyusunda birlikte analiz edildiğinde, Borrelia anti-IgM ve anti-IgG tespit sistemleri arasında önemli bir saptanabilir çapraz reaktivite göstermedi12. IgM'nin IgG antikorlarına karşı daha düşük bağlanma afinitesi göz önüne alındığında16,17, IgM tespiti için PE konjuge bir tespit antikoru seçtik (çift raportör enstrümanın ilk raportör kanalı) çünkü PE, immünolojik testlerde rutin olarak kullanılan en güçlü yayan floroforlardan biridir18. IgG değerlendirmesi için, daha sonra BV421-konjuge streptavidin (cihazın ikinci raportör kanalı) ile aydınlatılan biyotinile bir tespit antikoru kullandık19. Tek raporlu sisteme kıyasla 30 dakikalık ek inkübasyon adımına rağmen, çift raportörlü sistem reaksiyon başına iki kat daha fazla bilgi verir. Genel olarak, çift raporlu çoğullanmış tahlil, iki tek raporlu tahlil çalıştırmaktan daha az kümülatif zaman ve malzeme girdisi gerektirir.
Çoğullanmış Borrelia testinin güçlü performansı ve stabilitesi, tahlil içi ve tahliller arası hassasiyet çalışmalarında yüksek tekrarlanabilirlik ve hem IgG hem de IgM değerlendirmesi için çok çeşitli numune konsantrasyonlarında seyreltme doğrusallığı ve seyreltme paralelliğinin gösterilmesi ile örneklenmiştir. İki cihaz arasındaki optik ve kalibrasyon ayarlarındaki farklılıklara atfedilebilen, çift kanallı sisteme (PE ile ≈1.7 daha yüksek) kıyasla tek kanallı cihazı kullanan aynı floroforlar için daha yüksek mutlak floresan emisyon seviyeleri gözlemledik (PE ile × 4 daha yüksek). Bununla birlikte, her iki florofor ile floresan emisyon eğrileri, yüksek ve düşük numune seyreltme uç noktalarında her iki cihazın doğrusal aralığında kaldı ve ölçülen mutlak floresandaki herhangi bir tutarsızlık, Borrelia maruziyet durumunun sınıflandırmasını etkilemedi. 12
Bu boncuk bazlı Borrelia multipleks testinin önemli bir avantajı, örneğin diğer Borrelia türlerinin antijenlerine karşı antikorları tespit etmek için farklı veya ek analitleri değerlendirmek için testin değiştirilebilmesi veya genişletilebilmesi kolaylığıdır. xMAP manyetik boncuk setleri, cihazın Sınıflandırma Kanalında ayırt edilebilen farklı boya kombinasyonları içerir ve teorik olarak aynı numune içinde 500'e kadar benzersiz analiti aynı anda değerlendirebilen multipleks tahlillere uygulanabilir. Mevcut çalışma, test işlevselliğini ve stabilitesini göstermek ve tek ve çift raportör sistemini karşılaştırmak için dört temsili Borrelia antijenini vurgularken, son test, Avrupa ve Kuzey Amerika'da dolaşan klinik olarak ilgili beş Borrelia patojeninin tümünü birlikte tanımlayabilen sekiz antijeni sorgulamaktadır12.
Yarı otomatik tahlil formatında standart 384 oyuklu mikrotitre plakaları kullanılarak yüksek verimli performans mümkündür. Hem 96 hem de 384 oyuklu plakalarla tahlil ve cihaz uyumluluğu, Borrelia multipleks tahlilinin, ulusal çalışmalar gibi büyük numune setlerini hızlı bir şekilde analiz etmek için etkili bir tarama aracı olarak kullanılmasına olanak tanır20. Testin manuel performansı, daha küçük 96 oyuklu plakalar kullanan daha küçük numune setleri için mümkün olmaya devam eder.
Çalışma sınırlamaları, az sayıda insan serum örneğinde sadece birkaç Borrelia immünoreaktivite hedefinin karşılaştırmalı değerlendirmesini içerir. Bununla birlikte, orijinal çalışma, daha büyük bir örnek seti12 içinde bilinen beş Borrelia türünün hepsinden sekiz antijeni analiz ederken hem IgG hem de IgM için test performansının korunduğunu doğruladı. Ayrıca, çift raportör cihaz, her reaksiyonda aynı anda yalnızca iki antikor izotipini değerlendirebilir, bu nedenle tam izotip profili, ek tahlil reaksiyonlarının gerçekleştirilmesini gerektirecektir13.
Sonuç olarak, bu rapor, boncuk bazlı tek raporlu immünolojik testlerin, insan serum örneklerinde patojenik Borrelia'ya özgü IgG ve IgM antikorlarını aynı anda değerlendirebilen çift raportör testlere başarılı bir şekilde birleştirilmesini ve dönüştürülmesini detaylandırmaktadır. Bu birleşik yaklaşım, iki bağımsız tek raporlu tahlil ile aynı veri hacmini oluşturmak için toplam zaman, malzeme ve işçilik girdilerinden tasarruf sağlar. Multipleks tahlil, 96 kuyulu mikrotitreli plaka formatından 384 kuyulu mikrotitre plaka formatına ölçeklendirilebilir ve robotik plaka ve sıvı işleme enstrümantasyonu kullanılarak yarı otomatik hale getirilebilir, bu da onu büyük nüfus araştırmaları gibi yüksek verimli uygulamalar için uygun hale getirir. Boncuk tabanlı çift raportör tahlil sistemleri daha önce, örneğin diğer viral ve bakteriyel patojenlere karşı bağışıklık tepkilerinideğerlendirmede 13,21, organ naklinde HLA epitoplarına karşı allojenik antikor yanıtlarını değerlendirmede22 ve otoimmün hastalıkmekanizmalarını araştırmada 23 fayda göstermiştir. Mevcut rapor, laboratuvarların çeşitli patolojilerde karmaşık bağışıklık mekanizmalarını keşfetmek için bu yaklaşımı nasıl uyarlayabileceğinin bir örneği olarak, Lyme hastalığına neden olan Borrelia patojenlerine maruz kalmayı belirlemek için multipleks teknolojisinin kullanımını detaylandırdı.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65323">Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test</a>. The Authors section was updated to correct an Affiliation. It was updated from:
Julia H&#228;ring1 
Tanja Michel1 
Matthias Becker1 
Daniel Junker1 
Tatia Tchitchagua2 
Olaf Leschnik2 
Berit Lange3,4 
Stefanie Castell3,4 
G&#233;rard Krause3,4 
Monika Strengert3 
Alex Dulovic1 
Nicole Schneiderhan-Marra1 
1NMI Natural and Medical Sciences Institute, University of T&#252;bingen 
2Department of Neurology, S&#228;chsisches Krankenhaus Rodewisch 
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research 
4German Centre for Infection Research (DZIF)
to:
Julia H&#228;ring1 
Tanja Michel1 
Matthias Becker1 
Daniel Junker1 
Tatia Tchitchagua2 
Olaf Leschnik2 
Berit Lange3,4 
Stefanie Castell3,4 
G&#233;rard Krause3,4 
Monika Strengert3 
Alex Dulovic1 
Nicole Schneiderhan-Marra1 
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the&#160;University of T&#252;bingen 
2Department of Neurology, S&#228;chsisches Krankenhaus Rodewisch 
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research 
4German Centre for Infection Research (DZIF)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65323">Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test</a>. The Authors section was updated to correct an Affiliation.

Erratum: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

Lyme borreliosis, kuzey yarımkürenin ılıman iklimlerinde en sık görülen kene kaynaklı bulaşıcı hastalıktır1. Coğrafi dağılımda farklılık gösteren bilinen beş insan patojeni olan Borrelia cinsinin spiroket bakterilerinden kaynaklanır2. Avrupa'daki başlıca patojenik Borrelia türleri B. afzelii ve B. garinii'dir, B. burgdorferi s.s., B. spielmanii ve B. bavariensis daha az sıklıkla görülür. Kuzey Amerika'da, B. burgdorferi s.s. Lyme borreliosis 2,3'ün tek etken maddesidir. Borrelia patojenleri, kene cinsi Ixodes'in üyeleri tarafından bulaşır ve kene ısırığından sonraki 24 saat içinde bulaşma meydana gelebilir4.
Lyme borreliosis tanısı tipik olarak klinik semptomlarla konur ve daha sonra seroloji ile doğrulanır. Hem Avrupa'da hem de Kuzey Amerika'da, tanı kılavuzları, Borrelia'ya özgü antijenlere karşı antikor yanıtını değerlendirmek için bir refleks immünoblot ile enzime bağlı bir immünosorbent testinden (ELISA) oluşan iki aşamalı bir test serisi önermektedir 1,5,6,7,8,9 . Bununla birlikte, bu yaklaşım duyarlılıktan yoksundur ve özellikle serokonversiyonun eksik olabileceği ve anti-Borrelia IgG ve IgM titrelerinin çok düşük olduğu enfeksiyonun erken evresinde yetersizdir6.
Multipleks immünolojik testler, bir seferde yalnızca bir hedefi ölçen ve aynı anda bir veya daha fazla antijene karşı çoklu antikor izotip yanıtlarını değerlendirebilen geleneksel immünolojik testleri geliştirir 10,11,12. ELISA'lar gibi tahliller, mevcut durumda, Borrelia ile enfeksiyondan sonra tek bir bakteriyel antijene karşı indüklenen dolaşımdaki IgG veya IgM'de, reaksiyon başına tek bir analitin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi ile sınırlıdır. Bu rapor, insan serum örneklerinde burada seçilen Borrelia antijenlerinden herhangi birine karşı hem IgG hem de IgM antikorlarını aynı anda tespit eden bir multipleks immünolojik testin geliştirilmesi için boncuk tabanlı analit profilleme teknolojisinin kullanımını göstermektedir. Avrupa'da yerli olan en yaygın patojenik Borrelia türlerini kapsayan dört antijen seçtik (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) ve Kuzey Amerika (B. burgdorferi s.s.) (Tablo 1) 2,3. Bu, belirleyici patojen tanımlamasına ve hasta örneklerinde erken IgM ve daha sonra, daha dayanıklı, IgG immünoreaktivitesini ayırt etme yeteneğine izin verir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Hedef İzotipi</td>
			<td>Muhabir Kanalı</td>
			<td>Antijen</td>
			<td>Borrelia Türleri</td>
			<td>Soy</td>
			<td>Antijen Birleştirme Konsantrasyonu</td>
		</tr><tr><td>Igm</td>
			<td>PE</td>
			<td>OspC</td>
			<td>B. garinii</td>
			<td>20047</td>
			<td>5.0 μg/106 boncuk</td>
		</tr><tr><td>IgG (IgG)</td>
			<td>BV421 Serisi</td>
			<td>VlsE</td>
			<td>B. burgdorferi s.s</td>
			<td>B31 Serisi</td>
			<td>1,25 μg/106 boncuk</td>
		</tr><tr><td>IgG (IgG)</td>
			<td>BV421 Serisi</td>
			<td>DbpA</td>
			<td>B. burgdorferi s.s.</td>
			<td>ZS7 Serisi</td>
			<td>10,0 μg/106 boncuk</td>
		</tr><tr><td>IgG (IgG)</td>
			<td>BV421 Serisi</td>
			<td>DbpA</td>
			<td>B. afzelii</td>
			<td>PKo (PKo)</td>
			<td>5.0 μg/106 boncuk</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Multipleks test geliştirme için kullanılan temsili Borrelia antijenleri.
Başlangıçta, iki ayrı reaksiyonda anti-Borrelia antijeni IgG veya IgM antikorlarını tespit eden tek raporlu bir immünolojik test geliştirdik ve daha sonra bu testleri, aynı reaksiyon karışımında her iki antikor izotipini ölçen çift raporlu bir multipleks testte birleştirdik. Manyetik boncuklar, ilgilenilen bir patojen hedef antijene bağlanır ve daha sonra hasta serum örnekleri ile inkübe edilir. Boncuk bağlı antijen, bu patojen antijene karşı bir bağışıklık tepkisinde üretilen serumda hem dolaşımdaki IgG hem de IgM tarafından tanınır ve yakalar. IgG'ye karşı IgM özgüllüğü, her biri iki ikincil antikorla ilişkili farklı bir florofor sinyaline sahip olan IgG veya IgM'ye bağlanan ikincil bir antikorun seçilmesiyle belirlenir. Her floresan sinyali, IgG veya IgM'yi (burada sırasıyla Brilliant Violet 421 veya fikoeritrin) tespit etmek için kullanılan tek florofora özgü farklı bir uyarma lazerine ve emisyon yakalamaya sahip olan cihazın iki Raportör Kanalından birinde (yani çift raportör) algılanır. Cihaz Sınıflandırma Kanalı, farklı boncuk setlerine özgü renk kodlu boyayı tanımlar. Böylece, çoklu hedef antijenler, farklı boyanmış boncuklara bağlanabilir ve boncuk setleri birlikte karıştırılabilir ve serum örneklerinde çeşitli anti-patojen immünoreaktivitesini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için kullanılabilir. Sınıflandırma Kanalı, her bir boncuk setini (yani spesifik antijeni) tanımlar ve bu antijene karşı IgG veya IgM ile ilişkili floresansı ölçer. Ortaya çıkan multipleks test, daha az kapsamlı klasik testlere kıyasla zamandan ve kaynaklardan tasarruf sağlar ve sınırlı numune hacimlerinde Lyme immünoreaktivitesini doğru bir şekilde kataloglar. SARS-CoV-2 enfeksiyonu13 gibi diğer patolojilerdeki immün yanıtları kategorize etmek için daha önce benzer bir çift raporlayıcı yaklaşım kullanılmış olsa da, bu rapor Lyme borreliosis'te immünoreaktiviteyi karakterize etmek için multipleks floresan test teknolojisinin uygulanmasını detaylandırmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies and Detection Reagents</td>
			<td>Source</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Goat Anti-Human IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch (Dianova)</td>
			<td>109-066-098&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-Streptavidin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Human IgM&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch (Dianova)</td>
			<td>709-116-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borrelia Antigens</td>
			<td>tgcBIOMICS (Bingen, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce</td>
			<td>77149 ProteoChem (100 mg)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T844.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4256.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4984.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProClin300</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>48914-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce</td>
			<td>24510 (500 mg)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation and Ancillary Lab Supplies</td>
			<td>Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Corning, Cat# 3570</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well half-area plates&#160;</td>
			<td>Corning, Cat# 3690</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek 405 TS Plate Washer</td>
			<td>BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek MultiFlo FX Plate Washer</td>
			<td>BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes)</td>
			<td>ThermoFisher, Cat# 12320D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument)</td>
			<td>Luminex Corp., Austin, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher, Cat# A31508</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-&#181;m-diameter beads)</td>
			<td>Luminex Corp., Austin, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartBlock Plates</td>
			<td>Eppendorf, Cat# 5363000039</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf, Cat# 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoTop</td>
			<td>Eppendorf, Cat# 5308000003</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument)</td>
			<td>Luminex Corp., Austin, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous detection of different antibody classes in a multiplexed serological test

Enfeksiyöz hastalıkların ilerlemesini izlemek için, çeşitli antijenik belirleyicilere karşı immünoreaktiviteyi değerlendirmek ve konakçı immün yanıtının farklı aşamalarında ortaya çıktıkları için farklı antikor izotiplerini ölçmek yararlıdır. Lyme borreliosis ile patojenik ajan, Borrelia türlerinin birden fazla üyesinden biri olabilir. Bu nedenle, doğru numune sınıflandırması, farklı Borrelia türlerinin farklı antijenlerine karşı immünoreaktivitenin değerlendirilmesini gerektirir. Ek olarak, anti-patojen IgG ve IgM yanıtları, hastalığın ilerlemesi sırasında farklı ortaya çıkma süresi kurslarına sahip olabilir. Burada, aynı reaksiyonda farklı bakteriyel antijenlere karşı hem IgG hem de IgM immünoreaktivitesini aynı anda değerlendirerek insan serum örneklerinde Borrelia'ya özgü immün yanıtı tanımlamada faydası olan iki raporlu bir multipleks immünolojik testin gelişimini gösteriyoruz. Bu çift raporlayıcı yaklaşımı, tek raporlayıcılı yöntemlerin analitik performansını korurken, zaman ve kaynak tasarrufu sağlar ve örneklem boyutu gereksinimlerini azaltır. Bu tahlil, bir kan örneğinden yarı sürede üretilecek serolojik bilginin esasen iki katına çıkmasına izin verir.

Lyme borreliosis is the most common tick-borne infectious disease in moderate climates of the northern hemisphere1. It is caused by spirochete bacteria of the genus Borrelia, with five known human pathogens that vary in geographical distribution2. The main pathogenic Borrelia species in Europe are B. afzelii and B. garinii, with B. burgdorferi s.s., B. spielmanii and B. bavariensis implicated less frequently. In North America, B. burgdorferi s.s. is the sole causative agent of Lyme borreliosis2,3. Borrelia pathogens are transmitted by members of the tick genus Ixodes, with transmission able to occur within 24 hours of tick bite4.
Lyme borreliosis diagnosis is typically made by clinical symptoms and subsequently confirmed by serology. In both Europe and North America, diagnostic guidelines recommend a two-step testing series consisting of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with a reflex immunoblot to evaluate antibody response against Borrelia specific antigens1,5,6,7,8,9. However, this approach lacks sensitivity and is suboptimal, particularly in the early phase of infection when seroconversion may be incomplete and anti-Borrelia IgG and IgM titers are too low6.
Multiplex immunoassays improve upon traditional immunoassays that measure only one target at a time, and can simultaneously evaluate multiple antibody isotype responses against one or more antigens10,11,12. Assays such as ELISAs are limited to identifying and quantifying a single analyte per reaction, in the current case&#160;either circulating IgG or IgM induced against a single bacterial antigen after infection with Borrelia. This report illustrates using bead-based analyte profiling technology for the development of a multiplex immunoassay that simultaneously detects both IgG and IgM antibodies against any of the herein chosen Borrelia antigens in human serum samples. We selected four antigens that together cover the most common pathogenic Borrelia species native in Europe (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) and North America (B. burgdorferi s.s.) (Table 1)2,3. This allows decisive pathogen identification and the ability to discern early IgM and later, more durable, IgG immunoreactivity in patient samples.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Target Isotype</td>
			<td>Reporter Channel</td>
			<td>Antigen</td>
			<td>Borrelia Species</td>
			<td>Strain</td>
			<td>Antigen Coupling Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>PE</td>
			<td>OspC</td>
			<td>B. garinii</td>
			<td>20047</td>
			<td>5.0 &#181;g/106 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>BV421</td>
			<td>VlsE</td>
			<td>B. burgdorferi s.s</td>
			<td>B31</td>
			<td>1.25 &#181;g/106 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>BV421</td>
			<td>DbpA</td>
			<td>B. burgdorferi s.s.</td>
			<td>ZS7</td>
			<td>10.0 &#181;g/106 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>BV421</td>
			<td>DbpA</td>
			<td>B. afzelii</td>
			<td>PKo</td>
			<td>5.0 &#181;g/106 beads</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Representative Borrelia antigens used for multiplex assay development.
We initially developed a single-reporter immunoassay that detected either anti-Borrelia antigen IgG or IgM antibodies in two separate reactions and then merged these assays into a dual-reporter multiplex assay that measures both antibody isotypes in the same reaction mixture. Magnetic beads are coupled to a pathogen target antigen of interest, and then incubated with patient serum samples. The bead-coupled antigen gets recognized by, and captures, both circulating IgG and IgM in serum that is generated in an immune response against that pathogen antigen. Assay IgG versus IgM specificity is determined by the selection of a secondary antibody that binds to either IgG or IgM, each with a distinct fluorophore signal associated with the two secondary antibodies. Each fluorescent signal is detected in one of the instrument&#39;s two Reporter Channels (i.e., dual-reporter) that has a different excitation laser and emission capture specific for the single fluorophore used to detect either IgG or IgM (here Brilliant Violet 421 or phycoerythrin, respectively). The instrument Classification Channel identifies the color-coded dye that is inherent to different bead sets. Thus, multiple target antigens can be coupled to differently dyed beads, and the bead sets mixed together and used to comprehensively assess diverse anti-pathogen immunoreactivity in serum samples. The Classification Channel identifies each individual bead set (i.e., specific antigen) and measures the fluorescence associated with IgG or IgM against that antigen. The resulting multiplex assay saves time and resources versus less comprehensive classical testing and accurately catalogs Lyme immunoreactivity in limited sample volumes.&#160;Whereas a similar dual-reporter approach has been previously used to categorize immune responses in other pathologies such as SARS-CoV-2 infection13, this report details the application of multiplex fluorescent assay technology for characterizing immunoreactivity in Lyme borreliosis.

Yazar Spotlight: Lyme Borreliosis Teşhisi ve Patojen Araştırmaları için Multipleks İmmünoanalizlerin Kapsamının Genişletilmesi 

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti

Lyme borreliosis diagnostics is still suboptimal despite several years of research investigation and lacks sensitivity. With our dual-reporter multiplex Borrelia assay, we can identify immunoreactivity against different Borrelia species to discern early IgM and later, more durable, IgG immunoreactivity in patient samples. The Intelliflex instrument from Luminex with its multiplexing capability combined with its dual-reporter system is one of the state-of-the-art technologies to maximize information output using small volumes of donor material.The dual-reporter immunoassay approach improves upon traditional immunoassays by simultaneously detecting both IgG and IgM antibodies against any of the implemented Borrelia antigens in human serum samples. In this way, we double the information we can extract from valuable sample material in one assay run. Our approach provides decisive Borrelia pathogen identification and sensitive detection of the early infection stage and the later, more durable, immunoreactivity at the same time.Thus enabling cost, material, and time efficiency, as well as a more precise detection of Lyme borreliosis infection. Our assays support global serosurveillance and pathogen elimination strategies in identifying regional species distribution and infection sources. Our lab is involved in prophylactic and therapeutic vaccine development against several viral pathogens with a special focus on serological differentiation of vaccine versus infection immune response and deep immune response characterization.

Deneysel genel bakış Tek raportörlü ve çift raportörlü boncuk bazlı Borrelia tahlilleri için genel şemalar Şekil 1'de gösterilmektedir. Belirli bir Borrelia antijenine karşı üretilen tek antikor hedefleri (yani, IgG veya IgM) için, her iki antikor sınıfı, raporlama için PE konjuge anti-izotip antikoru kullanılarak insan serum örneklerinde bağımsız olarak değerlendirildi. Hem IgG hem de IgM immünoreaktivitesinin eşzamanlı analizi ile çift raportör testi için, Borrelia antijenine özgü IgG tespiti, IgM tespiti için PE konjuge raportörü (turuncu floresan) korurken, biyotinile edilmiş bir anti-insan IgG + BV421 etiketli Streptavidin (mavi floresan) raportör sistemi kullandı. Çift raportör testinin iş akışı, ikinci kanallı floresan algılama reaktifi BV421-Streptavidin ile ek 30 dakikalık bir algılama sistemi inkübasyonu dışında, tek raporlu teste benzer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig01.jpg"> Şekil 1: Tek raportörlü ve çift raportörlü boncuk tabanlı Borrelia tahlillerinin şeması. (A) Tek raportör alet, her ikisi de "turuncu" spektrumlarda sinyal yayan bir fikoeritritin (PE) floresan raportör etiketi kullanarak, anti-Borrelia IgG veya IgM'yi ayrı ayrı karakterize eden boncuk bazlı testi geliştirmek ve başlangıçta doğrulamak için kullanıldı. İstenen herhangi bir Borrelia antijeni boncuklara bağlanabilir ve serum örneklerinde bulunan IgG veya IgM'yi yakalamak ve ölçmek için kullanılabilir. Belirli bir antijene karşı hem IgG hem de IgM reaktivitesini değerlendirmek için iki ayrı immünolojik teste ihtiyaç vardır. (B) Çift raportör sistemi, aynı kuyucukta herhangi bir Borrelia antijenine karşı hem IgG hem de IgM antikorları için serum örneklerinin eşzamanlı analizine izin verdi. Bu yaklaşım, anti-Borrelia IgM'yi hedeflemek için aynı PE konjuge tespit antikorunu kullanır, ancak PE bazlı bir sistemden IgG tespitini, biyotinillenmiş bir primer tespit antikoru ve BV421 etiketli Streptavidin (bir "mavi" yayıcı) kullanarak değiştirir ve 30 dakikalık ek bir tespit sistemi inkübasyon adımına ihtiyaç duyar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Test içi hassasiyet Üç temsili Borrelia antijeni için Spearman korelasyon analizi (Şekil 2), insan serumlarında bulunan anti-Borrelia antikorlarını tespit ederken MFI değerlerinin tek tip tekrarlanabilirliğini göstermiştir. 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig02.jpg"> Şekil 2: Çift raportörlü boncuk bazlı Borrelia testinin tahlil içi hassasiyeti. Spearman'ın korelasyon analizi, Borrelia'ya özgü IgM antikorlarını (A) saptamak için bir PE saptama sistemi ve Borrelia'ya özgü IgG antikorlarını (B, C) saptamak için bir BV421 saptama sistemi kullanıldığında, çift raportör testin yüksek bir test içi hassasiyetini gösterdi. Toplam 21 serum örneği, yarı otomatik bir prosedür kullanılarak kopyalar halinde analiz edildi. Her grafikte, MFI sinyalleri birbirine karşı çizildi ve doğrusal regresyon ile analiz edildi. Kırmızı kesikli çizgi olarak gösterilen doğrusal bir eğri (x=y), algılama sistemleri için aynı MFI sinyallerini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tahliller arası hassasiyet Çift raportör tahlil ile iyi tahlilden tahlile tekrarlanabilirlik gözlendi. Yedi bağımsız çalışma boyunca ölçülen bir kalite kontrol örneğinin MFI değerlerine sahip Levey-Jennings çizelgeleri (Şekil 3), tüm temsili antijenler için yüksek testler arası kesinliği göstermiştir. Dört temsili Borrelia antijeninin ortalama yüzde Varyasyon Katsayısı (% CV = standart sapma / ortalama × 100) %5.3 idi.
Seyreltme doğrusallığı Orijinal tek raporlu test ve yeni çift raportörlü test farklı akış sitometrik platformları kullandığından, iki akış sitometri cihazı arasında aynı antijen immünolojik immünolojik testin medyan floresan çıktılarını karşılaştırdık (Şekil 4). Numune seyreltme serisi, değerlendirilen tüm seyreltme aralığı boyunca (1:100-1:12.800) aletler arasında iyi bir doz-yanıt paralelliği ile hem IgM hem de IgG değerlendirmesi için doğrusal seyreltme eğrileri sağlamıştır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig03.jpg"> Şekil 3: Çift raportörlü boncuk bazlı Borrelia testinin tahliller arası hassasiyeti. Tahliller arası kesinliğin değerlendirilmesi için, bir kalite kontrol numunesinin Borrelia'ya özgü IgM (A) ve IgG (BD) antikor tepkisi, her seferinde çift kuyucuklarda yedi bağımsız çalışma boyunca analiz edildi. Tahliller manuel olarak yapıldı. MFI değerleri bir Levey-Jennings grafiğinde çizildi. Yeşil bir çizgi tüm değerlerin ortalamasını verir. İki kırmızı kesikli çizgi, tahliller arası hassasiyetin tolerans aralığını gösterir. Bu, standart sapmanın (2,5 S.D.) 2,5 katı ± ortalama değerden hesaplandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig04.jpg"> Şekil 4: Çift raportörlü boncuk bazlı Borrelia testinin seyreltme doğrusallığı. 100 kat ila 12.800 kat arasındaki numune dilüsyonlarında, hem IgM tespiti (A) hem de IgG tespiti (B) için seyreltme eğrileri, tek raporlu cihaz ve çift raportör cihaz ile manuel olarak gerçekleştirildiğinde benzerdi. Test edilen tüm dilüsyonlarda, MFI değerleri, tek raportörlü enstrüman (kırmızı semboller) kullanılarak çift raportörlü enstrümandan (mavi semboller) biraz daha yüksekti. Gösterilen, 2 temsili antijen için seyreltme eğrileridir ve her bir seyreltme noktası, hata çubukları ile gösterilen standart sapma (SD *) ile üçlü kuyucukların ortalama ölçümünü temsil eder. Not: Küçük SD'ler bu ölçekte görünmez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tamamlayıcı Materyaller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/Supplementary_FIle_Buffer_Compositions.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Expanding the Scope of Multiplex Immunoassays for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research at JoVE.com

Avrupa ve Kuzey Amerika'da Lyme borreliosis'e neden olan farklı Borrelia türlerinin çoklu antijenlerine karşı ortaya çıkan IgG ve IgM için serum örneklerini aynı anda değerlendiren boncuk bazlı bir multipleks immünolojik test geliştirmek için üç kanallı bir çift raportör floresan akış analiz sistemi kullanıldı.

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Lyme borreliosis teşhisi, birkaç yıllık araştırma araştırmasına rağmen hala yetersizdir ve duyarlılıktan yoksundur. Çift raportörlü multipleks Borrelia testimizle, hasta örneklerinde erken IgM ve daha sonra, daha dayanıklı IgG immünoreaktivitesini ayırt etmek için farklı Borrelia türlerine karşı immünoreaktiviteyi tanımlayabiliriz. Luminex'in Intelliflex cihazı, çift raporlayıcı sistemi ile birlikte çoğullama özelliği ile birlikte, küçük hacimli donör materyali kullanarak bilgi çıktısını en üst düzeye çıkarmak için en son teknolojilerden biridir.Çift raporlu immünoassay yaklaşımı, insan serum örneklerinde uygulanan Borrelia antijenlerinden herhangi birine karşı hem IgG hem de IgM antikorlarını aynı anda tespit ederek geleneksel immünolojik testleri geliştirir. Bu şekilde, değerli numune materyalinden elde edebileceğimiz bilgileri tek bir tahlil çalışmasında ikiye katlıyoruz. Yaklaşımımız, Borrelia patojeninin kesin olarak tanımlanmasını ve erken enfeksiyon aşamasının ve daha sonra, daha dayanıklı, aynı zamanda immünoreaktivitenin hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar.Böylece maliyet, malzeme ve zaman verimliliğinin yanı sıra Lyme borreliosis enfeksiyonunun daha hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Tahlillerimiz, bölgesel tür dağılımı ve enfeksiyon kaynaklarının belirlenmesinde küresel serosürveyans ve patojen eliminasyon stratejilerini desteklemektedir. Laboratuvarımız, aşının serolojik olarak farklılaşması, enfeksiyon immün yanıtı ve derin immün yanıt karakterizasyonuna özel olarak odaklanarak çeşitli viral patojenlere karşı profilaktik ve terapötik aşı geliştirmede yer almaktadır.

simultaneous-detection-different-antibody-classes-multiplexed

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

1.0K Görüntüleme.  NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen. Lyme borreliosis teşhisi, birkaç yıllık araştırma araştırmasına rağmen hala yetersizdir ve duyarlılıktan yoksundur. Çift raportörlü multipleks Borrelia testimizle, hasta örneklerinde erken IgM ve daha sonra, daha dayanıklı IgG immünoreaktivitesini ayırt etmek için farklı Borrelia türlerine karşı immünoreaktiviteyi tanımlayabiliriz. Luminex'in Intelliflex cihazı, çift raporlayıcı sistemi ile birlikte çoğullama özelliği ile birlikte, küçük hacimli donör ma...