Bu protokol, birden fazla dokuda mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri görüntülemek ve ölçmek için standartlaştırılmış bir yaklaşım sağlar. C zarafetinde, mitokondriyal morfoloji genellikle işlevselliği ile ilişkilidir. Mitokondriyal morfolojideki değişiklikler, çeşitli hastalık koşulları altında ve yaşlanmanın ilerlemesi ile gözlenebilir, bu da genellikle mitokondriyal fonksiyondaki düzensizlik, Farklı dokular ve zarafet görür.
Farklı görüntüleme stratejileri gerektiren benzersiz mitokondriyal yapılar sergileyin. Bu nedenle, mitokondri ve C Elegance'ın dokuya özgü başarılı görüntülenmesi için uygun bir mikroskop seçmek ve numune hazırlamayı optimize etmek çok önemlidir. Burada konvansiyonel mitokondriyal boyalar yerine mitokondri lokalize GFP'yi eksprese eden transgenik cele suşlarını kullanmayı seçtik.
Bu, hedef dışı etkilerden, onal bi penetranstan ve bir boya kullanarak farklı dokulardaki mitokondriyi görselleştirmek için gerekli karmaşık numune hazırlama adımlarından kaçınmamızı sağlar. Laboratuvarımızın birincil odak noktası, stres ve yaşlanma sırasında mitokondriyal homeostazı incelemektir. Bir mitokondriyal görüntüleme protokolünün standardize edilmesi, ekstramental hataları en aza indirmek ve çeşitli biyolojik koşullar altında mitokondriyal morfolojideki değişikliklerle ilgili tekrarlanabilir sonuçlar üretmek için gereklidir.
Başlamak için temiz cam slaytlar edinin. Numune hazırlama için, cam lam üzerine 10 ila 20 mikrolitre M nine solüsyonu ekleyin ve solüsyona belirli yaşlarda istenen sayıda yetişkin solucan yerleştirin. Slaytta, M nine solüsyonundaki solucanları kası görüntülemek için bir kapak camı ile örtün.
Mitokondri, solucanları yuvarlamak için kapak fişini dürtün. Ardından, M nine solüsyonunun buharlaşmasını önlemek için kapak camının kenarlarını bir oje ile kapatın. Floresan etiketleri ifade eden kas ve epidermal mitokondriyi görüntülemek için standart bir geniş alan mikroskobu kullanın.
Bağırsak mitokondrisini görüntülemek için konfokal bir mikroskop kullanın ve görüntüleme ayarlarını belirli deney kurulumuna uyacak şekilde optimize edin. Analize başlamak için, mito eşleyici makrosunu indirmek ve yüklemek için kurulumdan sonra Fiji uygulamasını açın. İlk olarak, kaynak kodunu indirin.
MIT eşleyici 1.0 için bir IJM kodu altında listelenen kodu kopyalayın. Fiji'yi açın ve eklentilere gidin, ardından yeni ve kopyalanan kodu makro penceresine makro yapıştırın. Ardından makroyu dosya aracılığıyla ileride kullanmak üzere kaydedin ve farklı kaydedin.
Dosyaya gidin ve ardından Zs.In Fiji ile 3B mikroskobik bir görüntü açmak için açın, görüntünün altında bir maksimum projeksiyon oluşturun, ardından yığınlar ve Z projesi izleyin. Maksimum projeksiyon için odaktaki görüntülerdeki dilim aralığını seçin ve maksimum yansıtılan görüntüyü kaydetmek için projeksiyon türü olarak maksimum yoğunluğu seçin. Bir tiff olarak, dosyaya gidin ve farklı kaydet'i ve ardından tiff'i tıklayın.
Dikdörtgen aracıyla tam görüntüden ilgilenilen bölgeleri kırpın ve görüntüye gidin ve kırpın. Dosyaya gidin ve ardından farklı kaydet ve tiff kırpma görüntüsünü Tiff formatında kaydetmek için. Önceden kaydedilmiş mito haritasını veya makro dosyasını Fiji araç çubuğuna sürükleyip bırakın.
Çalıştır'a tıklayın. İstendiğinde, önceki adımda kaydedilen TIFF dosyasını içeren klasörü seçin. Bir alan seçmeniz istendiğinde, dikdörtgen aracını kullanarak görüntüde bir dikdörtgen oluşturun ve onaylamak için tamam'a basın.
Son olarak, dosyaya gidin ve verileri mitokondriyal morfoloji ile ilgili tüm değerlerle birlikte bir nokta CSV dosyası olarak kaydedin. Mitokondriyal morfoloji, bağırsakta birbirine bağlı ağ benzeri yapılar olan kaslardaki kas lifleri ile hizalanan tübüler mitokondri ile spesifik ve daha yuvarlak veya oval dokuydu. Konfokal mikroskop ile hipodermiste mitokondri görüntüleme, bileşik mikroskopiye kıyasla odak dışı ışığı azaltarak bağırsak mitokondrisinin görselleştirilmesini iyileştirdi.
Slaytlarda, mitokondri, M dokuz tamponunda 30 dakika sonra parçalanma gösterdi ve epidermal mitokondri en belirgin parçalanmayı gösterdi. Yaşlanma, kesik ve küresel yapılar olarak görünen tüm dokularda mitokondriyal parçalanmaya neden oldu. MIT haritalayıcı ölçümü, nesne uzunluğunun kaslarda değiştiğini ve hipodermiste birleşme noktasının değiştiğini gösterdi.
