Yazarlar, çeşitli kişi ve kuruluşların bu çalışmaya katkılarını kabul eder. Hücre ve Gen Terapisi Laboratuvarı ve Penn Translasyonel ve İlişkili Çalışmalar Laboratuvarı, süreç geliştirme ve IND sunumlarına hazırlık konusunda değerli yardımlar sağladı. Melissa Varghese ve Amanda DiNofia, bu makalenin temelini oluşturan IND sunumları için süreç geliştirme ve hazırlığa katkıda bulundular. Bu çalışma, Philadelphia Çocuk Hastanesi Hücre ve Gen Terapisi İşbirliği'nin Hızlandırma Hibesi ile desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca teknik ve araştırma destekleri için Miltenyi Biotec'e teşekkür eder. Şekil 1 , telif hakkı © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG kapsamındadır; Tüm hakları saklıdır.

Klinik Ölçekli CAR-T Hücre Üretimi için Otomatik İşlemci

<ol>
	<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia.">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Shah, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+anti-CD20,+anti-CD19+CAR+T+cells+for+relapsed+B+cell+malignancies:+A+phase+1+dose+escalation+and+expansion+trial.">Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial.</a> Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+humanized+CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+(CAR)-modified+T+cells+in+children+and+young+adults+with+relapsed/refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 128 (22), 217 (2016).</li><li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+manufacturing+of+CAR-T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy.">Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li><li>Fern&#225;ndez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMP-compliant+manufacturing+of+NKG2D+CAR+memory+T+cells+using+CliniMACS+Prodigy.">GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy.</a> Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361 (2019).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20/19+chimeric+antigen+receptor+T+Cells+using+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center.">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li><li>Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+clinical+grade+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+produced+using+automated+CliniMACS+prodigy+system.">Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system.</a> Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).</li><li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li><li>Miltenyi Biotec. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CliniMACS Prodigy User Manual. , (2021).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells.">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li><li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry. , (2020).</li><li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry. , (2022).</li></ol>

S.K., S.G. ve Y.W., Miltenyi Biotec'ten araştırma desteği aldı.

CAR-T hücre tedavisi, B hücresi ve diğer maligniteler için umut verici bir tedavi yaklaşımı olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, geleneksel CAR-T hücre üretim yöntemlerinin, yüksek maliyet, emek yoğun üretim ve kontaminasyon riskini artıran açık adımlar gibi çeşitli sınırlamaları vardır. Son zamanlarda, bu sınırlamaları ele almak için Miltenyi CliniMACS Prodigy ("işlemci") dahil olmak üzere birkaç yarı otomatik platform ortaya çıktı. Bu yazıda açıklanan işlemciye entegre e...

Bir kimerik antijen reseptörünü (CAR) eksprese etmek üzere tasarlanmış T hücrelerinin evlat edinme transferi, refrakter B hücreli maligniteleriolan hastaların tedavisinde dikkate değer bir etkinlik göstermiştir 1,2,3,4,5. Bununla birlikte, CAR-T hücreleri için geleneksel üretim yöntemleri emek yoğundur, zaman alıcıdır ve son derece uzmanlaşmış adımları gerçekleştirmek için yüksek eğitimli teknisyenler gerektirir. Örneğin, otolog bir CAR-T hücre ürününün geleneksel üretim süreci, T hücrelerini zenginleştirmek için yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, elütriasyon veya manyetik ayırma, steril bir şişede viral bir vektör ile aktivasyon ve transdüksiyon ve hasat ve formülasyondan önce bir biyoreaktörde genişlemeyi içerir. Son zamanlarda bu süreci kısmen otomatikleştirmeyi amaçlayan çeşitli sistemler ortaya çıkmıştır. Örneğin, Miltenyi CliniMACS Prodigy (bundan böyle "işlemci" olarak anılacaktır), bu adımların çoğunu otomatik bir şekildegerçekleştirebilen otomatik bir hücre işleme cihazıdır 6,7,8,9. Geleneksel ve otomatik CAR-T üretim yöntemlerinin derinlemesine bir tartışması, yakın tarihli bir inceleme makalesindesunulmuştur 10.
İşlemci, hematopoietik progenitör hücrelerin işlenmesi için ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı bir tıbbi cihaz olan CliniMACS Plus'ın işlevselliği üzerine kuruludur. İşlemci, hücrelerin otomatik olarak yıkanmasına, fraksiyonlanmasına ve yetiştirilmesine izin veren bir hücre yetiştirme ünitesi içerir (Şekil 1). T hücresi transdüksiyonu (TCT) işlemi, manuel CAR-T hücresi üretimini büyük ölçüde kopyalayan işlemci cihazı içinde önceden ayarlanmış bir programdır. TCT, grafiksel bir kullanıcı arayüzü ("Etkinlik Matrisi", Şekil 2) kullanarak özelleştirilebilir hücre işlemeye izin verir. İşlemci birçok adımı otomatikleştirdiğinden ve birden fazla cihazın işlevselliğini tek bir makinede birleştirdiğinden, teknoloji uzmanlarından daha az eğitim ve özel sorun giderme becerileri gerektirir. Tüm adımlar kapalı, tek kullanımlık bir boru seti içinde gerçekleştirildiğinden, işlemci, açık bir üretim süreci için kabul edilebilir olarak kabul edilenden daha az sıkı hava işleme altyapısına sahip tesislerde çalıştırılabilir. Örneğin, işlemciyi ISO sınıf 8 (AB sınıfı C ile karşılaştırılabilir) sertifikalı bir tesiste çalıştırıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg"> Şekil 1: T hücresi transdüksiyon sistemini kullanarak CAR-T hücresi üretimi. Gösterilen, boru setinin takılı olduğu işlemcidir. Boru seti, işleme tamponu, kültür ortamı ve lentiviral vektör içeren torbalar gibi diğer bileşenlerin steril kaynak yoluyla bağlanmasına izin verir. Lökoferez ürünü Uygulama torbasına eklendikten sonra, T Hücre Seçim Boncukları ile etiketlenebilir, Ayırma sütunundan geçirilebilir ve daha sonra Yeniden Uygulama torbasına aktarılabilir. Seçilen hücreler daha sonra kültür için aletin Yetiştirme ünitesine yönlendirilir ve Aktivasyon reaktifi ile aktive edilir (bkz. Nihai ürün, Hedef hücre torbasında toplanır. Proses boyunca, kalite kontrol için numuneleri aseptik olarak çıkarmak mümkündür. Dairelerin içindeki gri sayılar, sıvı yolunu boru setinden geçiren işlemci üzerindeki numaralı valfleri temsil eder. 11'in izniyle çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg"> Şekil 2: Etkinlik Matrisi. T hücresi seçimi ve aktivasyonundan sonra, CAR-T hücresi üretim sürecinin geri kalanı tamamen özelleştirilebilir. Aktiviteler eklenebilir veya silinebilir ve uygun gün ve saat için planlanabilir ve aktivite sonrası kültür hacmi belirtilebilir (Hacim). Örneğin, Transdüksiyon aktivitesi 1. Gün saat 10:00'da başlayacak şekilde yapılandırıldı ve aktivitenin sonundaki kültür hacmi 100 mL olarak ayarlandı. Aktivite Matrisi, yetiştirme dönemi boyunca düzenlenebilir. İşlemin durumu, işleme cihazının entegre ekranından izlenebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu makalenin amacı, işlemciyi kullanarak CAR-T hücrelerinin üretiminin ayrıntılı bir incelemesini sağlamak ve ayrıca düzenleyiciler tarafından bir araştırma amaçlı yeni ilaç (IND) başvurusunu onaylamak için muhtemelen gerekli olacak süreç içi ve ürün salım testleri hakkında rehberlik sağlamaktır. Sunulan protokol, satıcının önerdiği yaklaşıma yakın kalır ve şu anda tek merkezli bir araştırmacı tarafından başlatılan faz I/II klinik araştırmasında değerlendirilmekte olan IND 28617'nin altında yatan protokoldür. Bu çalışma, B hücreli akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) veya B-soy lenfoblastik lenfoma (B-Lly) hastaları için insanlaştırılmış CD19'a yönelik otolog CAR-T hücreleri üretmek için bu işlemciyi kullanmanın güvenliğini ve etkinliğini belirlemeyi amaçlamaktadır [NCT05480449]. Deneme Eylül 2022'de başladı ve B-ALL veya B-Lly ile 0-29 yaş arası 89 hastaya kadar kaydedilmesi planlanıyor. Denemeden elde edilen bazı üretim sonuçlarını makalede bildiriyoruz.
Makale, izlenecek adımları içeren bir protokol olarak sunulsa da, başkalarının kendi CAR-T hücre üretim süreçlerini optimize etmeye başlaması için bir başlangıç noktası olarak düşünülmesi gerektiğini belirtmek isteriz. Sunulan protokoldeki olası varyasyonların kapsamlı olmayan bir listesi şunları içerir: başlangıç materyali olarak dondurularak saklanmış T hücreleri yerine taze kullanılması; farklı bir T hücresi zenginleştirme yöntemi kullanmak veya tamamen atlamak; IL2 yerine IL7/IL15 gibi farklı besiyerleri ve sitokin kokteylleri kullanarak; insan AB serumunun konsantrasyonunu değiştirmek veya tamamen atlamak; transdüksiyon zamanlaması; "çok isabetli" transdüksiyonların kullanılması; değişen ajitasyon, kültür hacimleri ve beslenme programı; nükleik asitlerin veya lentiviral olmayan vektörlerin elektroporasyonu dahil olmak üzere farklı genetik transfer yöntemlerinin kullanılması; farklı bir nihai formülasyon tamponu ve/veya kriyoprotektan kullanarak; ve daha sonra infüzyon için kriyoprezervasyon yerine CAR-T hücrelerini taze olarak infüze etmek. Bu varyasyonlar, terapötik ürünün hücresel bileşimi ve gücü üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Genel Süreç Adımı</td>
			<td>İşlem Günü</td>
			<td colspan="4">Teknik Detaylar</td>
		</tr><tr><td>Hücre Zenginleştirme</td>
			<td rowspan="2">Gün 0</td>
			<td colspan="4">CD4+/CD8+ T hücrelerinin seçimi</td>
		</tr><tr><td>Hücre Aktivasyonu</td>
			<td colspan="4">T hücre kültürü tohumlama ve aktivasyonu</td>
		</tr><tr><td>Hücre İletimi</td>
			<td>1. Gün</td>
			<td colspan="4">Lentiviral transdüksiyon (100 mL kültür hacmi)</td>
		</tr><tr><td rowspan="12">Hücre Genişlemesi (ardından hücre formülasyonu)</td>
			<td>2. Gün</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>3. Gün</td>
			<td colspan="4">Kültür Yıkama (1 döngü); Çalkalayıcı etkinleştirildi; Kültür hacmi 200 mL'ye yükselir</td>
		</tr><tr><td>4. Gün</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>5. Gün</td>
			<td colspan="4">Besleme (50 mL); Kültür hacmi 250 mL'lik son hacme ulaşır</td>
		</tr><tr><td>6. Gün</td>
			<td colspan="4">Proses içi numune; Medya değişimi (-125 mL / +125 mL)</td>
		</tr><tr><td>7. Gün</td>
			<td colspan="4">Medya değişimi (-150 mL / +150 mL) veya Hasat</td>
		</tr><tr><td>8. Gün</td>
			<td colspan="4">Proses içi numune; Medya değişimi (-150 mL / +150 mL) veya Hasat</td>
		</tr><tr><td>9. Gün</td>
			<td colspan="4">Medya değişimi (-180 mL / +180 mL) veya Hasat</td>
		</tr><tr><td>10. Gün</td>
			<td colspan="4">Proses içi numune; Medya değişimi (-180 mL / +180 mL) veya Hasat</td>
		</tr><tr><td>11. Gün</td>
			<td colspan="4">Medya değişimi (-180 mL / +180 mL) veya Hasat</td>
		</tr><tr><td>12. Gün</td>
			<td colspan="4">Medya değişimi (-180 mL / +180 mL) veya Hasat</td>
		</tr><tr><td>13. Gün</td>
			<td colspan="4">Hasat</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: İşlem zaman çizelgesi ve genel bakış. Bu tablo, mevcut bir klinik araştırmada kullanılan TCT süreç adımlarını özetlemektedir [NCT05480449]. İşlem, 0. günde CD4+/CD8+ seçimi, kültür tohumlaması ve aktivasyonu ile T hücresi zenginleştirmesi ile başlar, ardından 1. günde transdüksiyon ile devam eder. Hücreler 48 saat dinlenir, ardından bir kültür yıkaması, kültür hacminin 200 mL'ye çıkarılması ve bir çalkalama mekanizması kullanılarak çalkalanması gelir. 6. Günde, ilk proses içi numune alınır. Hücreler, en az üç tam doz CAR-T hücresi (hasta <50 ×kg, aksi takdirde 2,5 × 10 8 CAR-T hücresi) ve kalite kontrol testi (~2 × 106 CAR-T hücresi) için yeterli hücre mevcut olduğunda toplanır; veya kültür toplam 4-5 x 109 hücreye ulaştığında. Kısaltmalar: TCT = T hücre transdüksiyonu; CAR-T = kimerik antijen reseptörü T hücreleri; MACS = manyetik olarak etkinleştirilen hücre sıralaması.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 x 75 borosilicate tubes</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>TL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Reagent Bag</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL Transfer Set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>4R2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,000 mL Transfer Set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>4R2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep</td>
			<td>Tyco/Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bag Access</td>
			<td>Medline</td>
			<td>2300E-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 APC-Vio770 REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 CAR Detection Reagent Biotin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-129-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>555413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>340440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 VioBright FITC REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 VioBlue REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 APC-Vio770 REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Reference Beads 10um</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>B10-02-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Reference Beads 15um</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>B15-02-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Reference Beads 5um</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>B05-02-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Slides</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-SD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS CD4 GMP MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>276-01</td>
			<td>The CD4 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS CD8 GMP MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>275-01</td>
			<td>The CD8 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-021-201</td>
			<td>The buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Origen</td>
			<td>CP-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Bag 50 mL</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>200-074-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Vial, 1.8 mL</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12565171N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Vial, 4.5 mL</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12565161N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td></td>
			<td>Sterile filtered, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin 25%</td>
			<td>Grifols</td>
			<td>68516-5216-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin 5%</td>
			<td>Grifols</td>
			<td>68516-5214-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS GMP Recombinant Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-148</td>
			<td>The cytokines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS GMP T Cell TransAct</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>200-076-202</td>
			<td>The activation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoSeq Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4460623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, Hypodermic 14G</td>
			<td>Medline</td>
			<td>SWD200573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, SlideSafe 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>B-D305918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 2-200 &#956;L, individually wrapped</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022492209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 50-1000 &#956;L, individually wrapped</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022492225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets 10 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-27F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets 25 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-675-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets 5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-27E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte-A</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B2544X</td>
			<td>The electrolyte solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prodigy TS520 Tubing Set</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076- 600</td>
			<td>The tubing set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Field</td>
			<td>Medline</td>
			<td>NON21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin PE-Vio770</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 30 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TexMACS GMP Medium</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-306</td>
			<td>The medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Sampling Adapter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral Vector</td>
			<td>CHOP Clinical Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>huCART19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>The Baker Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS Prodigy</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>200-075-301</td>
			<td>The processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled Rate Freezer</td>
			<td>Planer/Kryosave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe nexgen-PTS150K</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mettler Balance</td>
			<td>Mettler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCD Sterile Tubing Welder</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sebra Tube Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varitherm</td>
			<td>Barkey</td>
			<td></td>
			<td>The dry thaw device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XN-330 Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chimeric antigen receptor t cell manufacturing on an automated cell processor

Kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücreleri, çeşitli malign ve malign olmayan hastalıkların tedavisi için umut verici bir immünoterapötik yaklaşımı temsil eder. CAR-T hücreleri, bir hücre yüzeyi hedefini tanıyan ve ona bağlanan ve hedef hücrenin öldürülmesiyle sonuçlanan kimerik bir proteini eksprese eden genetiği değiştirilmiş T hücreleridir. Geleneksel CAR-T hücre üretim yöntemleri emek yoğundur, pahalıdır ve kontaminasyon riski taşıyabilir. Otomatik bir hücre işlemcisi olan CliniMACS Prodigy, hücre tedavisi ürünlerinin kapalı bir sistemde klinik ölçekte üretilmesine olanak tanıyarak kontaminasyon riskini en aza indirir. İşleme, bir bilgisayarın kontrolü altında yarı otomatik olarak gerçekleşir ve böylece sürece insan katılımını en aza indirir, bu da zamandan tasarruf sağlar ve değişkenliği ve hataları azaltır.
Bu el yazması ve video, bu işlemciyi kullanarak CAR-T hücreleri üretmek için T hücresi transdüksiyon (TCT) sürecini açıklamaktadır. TCT işlemi, CD4 + / CD8 + T hücresi zenginleşmesini, aktivasyonunu, viral bir vektör ile transdüksiyonunu, genişlemesini ve hasadı içerir. Bu adımların sıralanmasına ve zamanlamasına izin veren bir işlevsellik olan Etkinlik Matrisi kullanılarak, TCT süreci kapsamlı bir şekilde özelleştirilebilir. Mevcut İyi Üretim Uygulamalarına (cGMP) uygun olarak CAR-T hücre üretiminin bir incelemesini sağlıyoruz ve bir Araştırma Amaçlı Yeni İlaç (IND) uygulamasını destekleyecek gerekli salım testlerini ve klinik öncesi deneyleri tartışıyoruz. Klinik CAR-T hücre üretimi için yarı otomatik bir süreç kullanmanın fizibilitesini gösteriyor ve avantaj ve dezavantajlarını tartışıyoruz. Son olarak, bu üretim sürecinin klinik bir ortamda nasıl uygulanabileceğinin bir örneği olarak pediatrik B hücreli maligniteleri [NCT05480449] hedefleyen, araştırmacı tarafından başlatılan devam eden bir klinik çalışmayı açıklıyoruz.

Adoptive transfer of T cells engineered to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown remarkable efficacy in treating patients with refractory B-cell malignancies1,2,3,4,5. However, the traditional manufacturing methods for CAR-T cells are labor-intensive, time-consuming, and require highly trained technicians to carry out highly specialized steps. For example, the traditional manufacturing process of an autologous CAR-T cell product involves density gradient centrifugation, elutriation&#160;or magnetic separation to enrich T cells, activation, and transduction with a viral vector in a sterile flask, and expansion in a bioreactor prior to harvest and formulation. Various systems have emerged recently that aim to partially automate this process. For example, the Miltenyi CliniMACS Prodigy (hereafter referred to as the &#34;processor&#34;) is an automated cell processing device that can perform many of these steps in an automated fashion6,7,8,9. An in-depth discussion of traditional and automated CAR-T manufacturing methods is presented in a recent review article10.
The processor builds upon the functionality of the CliniMACS Plus, a U.S. Food and Drug Administration (FDA)-approved medical device for the processing of hematopoietic progenitor cells. The processor includes a cell cultivation unit that allows for&#160;automated washing, fractionation, and cultivation of cells (Figure 1). The T cell transduction (TCT) process is a preset program within the processor device that largely replicates manual CAR-T cell manufacture. TCT allows for customizable cell processing using a graphical user interface (the &#34;Activity Matrix,&#34; Figure 2). Because the processor automates many steps and consolidates the functionality of multiple devices into one machine, it requires less training and specialized troubleshooting skills from technologists. Because all steps are performed within a closed, single-use tubing set, the processor may be operated in facilities with less stringent air-handling infrastructure than would be considered acceptable for an open manufacturing process. For example, we are operating the processor in a facility certified as ISO class 8 (comparable to EU grade C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg" /> 
Figure 1: CAR-T cell manufacturing using the T cell transduction system. Shown is the processor&#160;with the tubing set installed. The tubing set allows for connecting other components such as bags containing processing buffer, culture medium, and lentiviral vector via sterile welding. Once the leukapheresis product is added to the Application bag, it can be labeled with T Cell Selection Beads, passed through the Separation column, and then transferred into the Reapplication bag. Selected cells are then directed to the Cultivation unit of the instrument for culture and activated with the Activation reagent (see Table of Materials). The final product is collected in the Target cell bag. Throughout the process, it is possible to remove samples for quality control aseptically. Grey numbers inside of circles represent the numbered valves on the processor that direct the liquid path through the tubing set. Reproduced with permission from 11.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg" /> 
Figure 2: Activity Matrix. After T cell selection and activation, the remainder of the CAR-T cell manufacturing process is fully customizable. Activities&#160;can be added or deleted and scheduled for the appropriate day and time, and the culture volume after the activity can be specified (Volume). For example, the Transduction activity was configured to begin at 10:00 AM on Day 1, and the culture volume at the end of the activity was set as 100 mL. The Activity Matrix can be edited throughout the cultivation period. The status of the process can be monitored on the integrated screen of the processing device. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The aim of this manuscript is to provide a detailed walk-through of manufacturing CAR-T cells using the processor and additionally provide guidance on the in-process and product release testing that will likely be required by regulators to approve an investigational new drug (IND) application. The presented protocol stays close to the vendor&#39;s recommended approach and is the underlying protocol for IND 28617, which is currently being evaluated in a single-center investigator-initiated phase I/II clinical trial. This trial aims to determine the safety and efficacy of using this processor to manufacture humanized CD19-directed autologous CAR-T cells for patients with B cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) or B-lineage lymphoblastic lymphoma (B-Lly) [NCT05480449]. The trial started in September 2022 and is planned to enroll up to 89 patients ages 0-29 years with B-ALL or B-Lly. We report some manufacturing results from the trial in the manuscript.
We would like to point out that although the manuscript is presented as a protocol with steps to follow, it should be considered a starting point for others to begin optimizing their own CAR-T cell manufacturing process. A non-comprehensive list of possible variations to the presented protocol includes: using fresh instead of cryopreserved T cells as starting material; using a different method of T cell enrichment or omitting it altogether; using different media and cytokine cocktails such as IL7/IL15 instead of IL2; varying the concentration of human AB serum or omitting it altogether; timing of transduction; using &#34;multi-hit&#34; transductions; varying agitation, culture volumes, and feeding schedule; using different methods of genetic transfer including electroporation of nucleic acids or non-lentiviral vectors; using a different final formulation buffer and/or cryoprotectant; and infusing CAR-T cells fresh instead of cryopreserving for infusion at a later time. These variations may have a significant impact on the cellular composition and potency of the therapeutic product.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Overall Process Step</td>
			<td>Process Day</td>
			<td colspan="4">Technical Details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Enrichment</td>
			<td rowspan="2">Day 0</td>
			<td colspan="4">Selection of CD4+/CD8+ T cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Activation</td>
			<td colspan="4">T cell culture seeding and activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Transduction</td>
			<td>Day 1</td>
			<td colspan="4">Lentiviral transduction (100 mL culture volume)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="12">Cell Expansion (followed by cell formulation)</td>
			<td>Day 2</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 3</td>
			<td colspan="4">Culture Wash (1 cycle); Shaker activated; Culture volume increases to 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 4</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 5</td>
			<td colspan="4">Feed (50 mL); Culture volume reaches final volume of 250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 6</td>
			<td colspan="4">In-process sample; Media exchange (-125 mL / +125 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 7</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-150 mL / +150 mL) or Harvest&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 8</td>
			<td colspan="4">In-process sample; Media exchange (-150 mL / +150 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 9</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 10</td>
			<td colspan="4">In-process sample; Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 11</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 12</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 13</td>
			<td colspan="4">Harvest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Process timeline and overview. This table summarizes the TCT process steps employed in a current clinical trial [NCT05480449]. The process starts with T cell enrichment by&#160;CD4+/CD8+ selection,&#160;culture seeding,&#160;and activation on Day 0, followed by transduction on Day 1. Cells rest for 48 h, followed by a culture wash, an increase of the culture volume to 200 mL, and agitation using a shaking mechanism. On Day 6, the first in-process sample is taken. Cells are harvested once sufficient cells are available for at least three full doses of CAR-T cells (5 &#215; 106 CAR-T cells/kg if the patient is &#60;50 kg, otherwise 2.5 &#215; 108 CAR-T cells) and quality control testing (~2 &#215; 106 CAR-T cells); or once the culture reaches a total of 4-5 x 109 cells. Abbreviations: TCT = T cell transduction; CAR-T = chimeric antigen receptor T cells; MACS = magnetic-activated cell sorting.

Yazar Spotlight: CAR-T Hücre Üretimi ve Gen Tedavisi Üretimindeki Gelişmeler 

Otomatik Hücre İşlemcisinde Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi Üretimi

The advantage of our protocol is that it is a semi-automated, closed system that still offers flexibility. The labor-intensive steps are replaced by the automation, which is run by a computer, and because it's run by a computer, the user can customize their protocol. This is also all done in a closed system.We found that the sort of stem cell laboratories that are commonly present in hospitals have the capability to produce clinical grade CAR-T cells at significantly lower cost than commercial alternatives. We think that our process could be easily adapted to make CAR-T cell specific for other targets, and also to manufacture other types of cell and gene therapies. Our team is poised to explore other CAR-T cell targets and new gene therapies.On a broader scale, cell and gene therapies are rapidly expanding, and we are excited to continue to support and innovate in this exciting field.

NCT05480449 denemesinin ilk üç CAR-T üretim çalışmasından elde edilen sonuçlar aşağıda Tablo 3'te sunulmuştur. Başlangıç materyali, vektör, kültür sitokinleri ve AB serum konsantrasyonları her çalışma için tutarlı tutuldu. Ürünler 7. veya 8. günde hasat edildi. Ortalama günlük hücre büyümesi %46 idi (toplam hücre sayısındaki artış), TCT işleminin hücre genişlemesini teşvik etmede etkili olduğunu gösteriyordu. Bu sonuçlar, işlemcinin tutarlı ve tekrarlanabilir...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in CAR-T Cell Manufacturing and Gene Therapy Production at JoVE.com

Bu makale, klinik kullanım için kimerik antijen reseptörü T hücreleri için, özellikle viral transdüksiyon ve T hücrelerinin kültivasyonunu gerçekleştirebilen otomatik bir hücre işlemcisi kullanarak üretim sürecini detaylandırmaktadır. Erken aşama bir klinik araştırmanın süreç geliştirme ve uygulaması sırasında göz önünde bulundurulması gereken önerilerde bulunuyor ve tuzakları açıklıyoruz.

Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells represent a promising immunotherapeutic approach for the treatment of various malignant and non-malignant ...

Protokolümüzün avantajı, hala esneklik sunan yarı otomatik, kapalı bir sistem olmasıdır. Emek yoğun adımların yerini bir bilgisayar tarafından çalıştırılan otomasyon alır ve bir bilgisayar tarafından çalıştırıldığı için kullanıcı protokolünü özelleştirebilir. Bunların hepsi de kapalı bir sistemde yapılır.Hastanelerde yaygın olarak bulunan kök hücre laboratuvarlarının, ticari alternatiflerden önemli ölçüde daha düşük maliyetle klinik sınıf CAR-T hücreleri üretme kabiliyetine sahip olduğunu bulduk. Sürecimizin, CAR-T hücresini diğer hedeflere özgü hale getirmek ve ayrıca diğer hücre ve gen terapilerini üretmek için kolayca uyarlanabileceğini düşünüyoruz. Ekibimiz diğer CAR-T hücre hedeflerini ve yeni gen terapilerini keşfetmeye hazır.Daha geniş bir ölçekte, hücre ve gen tedavileri hızla genişliyor ve bu heyecan verici alanda desteklemeye ve yenilik yapmaya devam etmekten heyecan duyuyoruz.

chimeric-antigen-receptor-t-cell-manufacturing-on-an-automated-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Chimeric Antigen Receptor T Cell Manufacturing on an Automated Cell Processor

1.7K Görüntüleme.  Children’s Hospital of Philadelphia. Protokolümüzün avantajı, hala esneklik sunan yarı otomatik, kapalı bir sistem olmasıdır. Emek yoğun adımların yerini bir bilgisayar tarafından çalıştırılan otomasyon alır ve bir bilgisayar tarafından çalıştırıldığı için kullanıcı protokolünü özelleştirebilir. Bunların hepsi de kapalı bir sistemde yapılır.Hastanelerde yaygın olarak bulunan kök hücre laboratuvarlarının, ticari alternatiflerden önemli ölçüde daha düşük maliyetle klinik sı...