저자들은 이 작업에 대한 여러 개인과 조직의 기여에 감사를 표하고자 합니다. 세포 및 유전자 치료 실험실(Cell and Gene Therapy Laboratory)과 펜실베이니아 중개 및 상관 연구 실험실(Penn Translational and Correlative Studies Laboratory)은 공정 개발 및 IND 제출 준비에 귀중한 지원을 제공했습니다. 멜리사 바르게세(Melissa Varghese)와 아만다 디노피아(Amanda DiNofia)는 이 원고의 기초가 되는 IND 제출을 위한 프로세스 개발 및 준비에 기여했습니다. 이 연구는 필라델피아 아동 병원의 세포 및 유전자 치료 협력 단체의 가속 보조금의 지원을 받았습니다. 저자들은 또한 기술 및 연구 지원에 대해 Miltenyi Biotec에 감사의 뜻을 전합니다. 그림 1 은 copyright © 2023 Miltenyi Biotec BV & Co. KG의 적용을 받습니다. 판권 소유.

임상 규모의 CAR-T 세포 제조를 위한 자동 프로세서

<ol>
	<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia.">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Shah, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+anti-CD20,+anti-CD19+CAR+T+cells+for+relapsed+B+cell+malignancies:+A+phase+1+dose+escalation+and+expansion+trial.">Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial.</a> Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+humanized+CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+(CAR)-modified+T+cells+in+children+and+young+adults+with+relapsed/refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 128 (22), 217 (2016).</li><li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+manufacturing+of+CAR-T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy.">Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li><li>Fern&#225;ndez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMP-compliant+manufacturing+of+NKG2D+CAR+memory+T+cells+using+CliniMACS+Prodigy.">GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy.</a> Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361 (2019).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20/19+chimeric+antigen+receptor+T+Cells+using+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center.">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li><li>Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+clinical+grade+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+produced+using+automated+CliniMACS+prodigy+system.">Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system.</a> Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).</li><li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li><li>Miltenyi Biotec. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CliniMACS Prodigy User Manual. , (2021).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells.">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li><li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry. , (2020).</li><li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry. , (2022).</li></ol>

S.K., S.G. 및 Y.W.는 Miltenyi Biotec으로부터 연구 지원을 받았습니다.

CAR-T 세포 치료제는 B세포 및 기타 악성 종양에 대한 유망한 치료법으로 부상했습니다. 그러나 기존의 CAR-T 세포 제조 방법은 높은 비용, 노동 집약적인 생산, 오염 위험을 증가시키는 개방형 단계 등 몇 가지 한계가 있습니다. 최근에는 이러한 한계를 해결하기 위해 Miltenyi CliniMACS Prodigy(이하 "프로세서")를 비롯한 여러 반자동 플랫폼이 등장했습니다. 이 원고에 설명된 프로세서에 통합된 T 세포 형?...

키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포의 입양 이식은 난치성 B 세포 악성 종양 1,2,3,4,5 환자를 치료하는 데 놀라운 효능을 보여주었습니다. 그러나 CAR-T 세포의 전통적인 제조 방법은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 고도로 전문화된 단계를 수행하기 위해 고도로 훈련된 기술자가 필요합니다. 예를 들어, 자가 CAR-T 세포 제품의 기존 제조 공정에는 밀도 구배 원심분리, T 세포를 농축하기 위한 용출 또는 자기 분리, 멸균 플라스크에서 바이러스 벡터를 사용한 활성화 및 형질도입, 수확 및 제형 전에 바이오리액터에서의 팽창이 포함됩니다. 최근 이 프로세스를 부분적으로 자동화하는 것을 목표로 하는 다양한 시스템이 등장했습니다. 예를 들어, Miltenyi CliniMACS Prodigy(이하, "프로세서"라 칭함)는 자동화된 방식으로 이러한 단계들 중 많은 것을 수행할 수 있는 자동화된 세포 처리 장치이다(6,7,8,9). 전통적이고 자동화된 CAR-T 제조 방법에 대한 심층적인 논의는 최근 리뷰 기사10에 제시되어 있습니다.
이 프로세서는 조혈 전구 세포 처리를 위한 미국 식품의약국(FDA) 승인 의료 기기인 CliniMACS Plus의 기능을 기반으로 합니다. 이 프로세서에는 세포의 자동 세척, 분획 및 배양이 가능한 세포 배양 장치가 포함되어 있습니다(그림 1). T 세포 형질도입(TCT) 공정은 수동 CAR-T 세포 제조를 대부분 복제하는 프로세서 장치 내의 사전 설정 프로그램입니다. TCT를 사용하면 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 사용자 정의 가능한 셀 처리가 가능합니다("활동 매트릭스", 그림 2). 프로세서는 많은 단계를 자동화하고 여러 장치의 기능을 하나의 기계로 통합하기 때문에 기술자의 교육과 전문 문제 해결 기술이 덜 필요합니다. 모든 단계가 폐쇄된 일회용 튜빙 세트 내에서 수행되기 때문에 프로세서는 개방형 제조 공정에 허용되는 것으로 간주되는 것보다 덜 엄격한 공기 처리 인프라가 있는 시설에서 작동할 수 있습니다. 예를 들어, ISO 클래스 8(EU 등급 C에 필적) 인증을 받은 시설에서 프로세서를 작동하고 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg"> 그림 1: T 세포 형질 도입 시스템을 사용한 CAR-T 세포 제조. 튜브 세트가 설치된 프로세서가 표시됩니다. 튜빙 세트를 사용하면 멸균 용접을 통해 처리 완충액, 배양 배지 및 렌티바이러스 벡터가 포함된 백과 같은 다른 구성 요소를 연결할 수 있습니다. 백혈구 채취 산물이 Application bag에 추가되면 T Cell Selection Beads로 라벨링하고 Separation column을 통과한 다음 Reapplication bag으로 옮길 수 있습니다. 그런 다음 선택된 세포는 배양용 기기의 배양 장치로 보내지고 활성화 시약으로 활성화됩니다(재료 표 참조). 최종 생성물은 Target cell bag에 수집됩니다. 공정 전반에 걸쳐 품질 관리를 위해 샘플을 무균으로 제거할 수 있습니다. 원 안의 회색 숫자는 튜빙 세트를 통해 액체 경로를 지시하는 프로세서의 번호가 매겨진 밸브를 나타냅니다. 11의 허가를 받아 복제했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg"> 그림 2: 활동 매트릭스. T 세포 선택 및 활성화 후 CAR-T 세포 제조 공정의 나머지 부분은 완전히 맞춤화할 수 있습니다. 활동을 추가하거나 삭제할 수 있으며 적절한 날짜와 시간에 예약할 수 있으며 활동 이후의 문화권 볼륨(Volume)을 지정할 수 있습니다. 예를 들어, 형질도입 활성은 1일차 오전 10:00에 시작하도록 구성되었고, 활동 종료 시 배양 부피는 100mL로 설정되었습니다. 활동 매트릭스는 재배 기간 동안 편집할 수 있습니다. 프로세스 상태는 처리 장치의 통합 화면에서 모니터링할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 원고의 목적은 프로세서를 사용하여 CAR-T 세포를 제조하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공하고 규제 기관이 임상시험용 신약(IND) 신청을 승인하는 데 필요할 수 있는 공정 중 및 제품 출시 테스트에 대한 지침을 추가로 제공하는 것입니다. 제시된 프로토콜은 공급업체가 권장하는 접근 방식에 가깝고 현재 단일 센터 연구자 주도 I/II 상 임상 시험에서 평가되고 있는 IND 28617의 기본 프로토콜입니다. 이 임상시험은 B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 또는 B 계통 림프구성 림프종(B-Lly) 환자를 위한 인간화 CD19 지향 자가 CAR-T 세포를 제조하기 위해 이 프로세서를 사용하는 것의 안전성과 효능을 결정하는 것을 목표로 합니다[NCT05480449]. 이 임상시험은 2022년 9월에 시작되었으며 B-ALL 또는 B-Lly에 0-29세 환자 최대 89명을 등록할 계획입니다. 우리는 원고에 시험의 일부 제조 결과를보고합니다.
원고는 따라야 할 단계가 포함된 프로토콜로 제시되었지만, 다른 사람들이 자신의 CAR-T 세포 제조 공정을 최적화하기 위한 출발점으로 간주되어야 한다는 점을 지적하고 싶습니다. 제시된 프로토콜에 대한 가능한 변이의 비포괄적 인 목록은 다음을 포함합니다 : 동결 보존 된 T 세포 대신 신선한 T 세포를 시작 물질로 사용; 다른 T 세포 농축 방법을 사용하거나 완전히 생략하는 단계; IL2 대신 IL7/IL15와 같은 다른 배지 및 사이토카인 칵테일을 사용합니다. 인간 AB 혈청의 농도를 변화시키거나 완전히 생략하는 것; 형질도입 시기; "multi-hit" transductions를 사용하여; 다양한 교반, 배양량 및 먹이 일정; 핵산 또는 비-렌티바이러스 벡터의 전기천공법을 포함하는 다양한 유전자 전달 방법을 사용하는 단계; 상이한 최종 제형 완충액 및/또는 동결 보호제를 사용하는 단계; 나중에 주입하기 위해 냉동 보관하는 대신 CAR-T 세포를 신선하게 주입합니다. 이러한 변화는 치료 제품의 세포 조성 및 효능에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>전체 프로세스 단계</td>
			<td>프로세스 데이</td>
			<td colspan="4">제품 상세 정보</td>
		</tr><tr><td>세포 농축</td>
			<td rowspan="2">0일차</td>
			<td colspan="4">CD4+/CD8+ T 세포 선택</td>
		</tr><tr><td>세포 활성화</td>
			<td colspan="4">T 세포 배양 파종 및 활성화</td>
		</tr><tr><td>세포 형질도입(Cell Transduction)</td>
			<td>1일차</td>
			<td colspan="4">렌티바이러스 transduction(배양 용량 100mL)</td>
		</tr><tr><td rowspan="12">세포 확장(세포 제형 후)</td>
			<td>2일차</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>3일차</td>
			<td colspan="4">배양 세척(1 사이클); 셰이커가 활성화되었습니다. 배양 부피가 200mL로 증가</td>
		</tr><tr><td>4일차</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>5일차</td>
			<td colspan="4">사료 (50 mL); 배양 용량이 최종 용량 250mL에 도달</td>
		</tr><tr><td>6일째</td>
			<td colspan="4">공정 중 샘플; 배지 교환(-125 mL / +125 mL)</td>
		</tr><tr><td>7일째</td>
			<td colspan="4">배지 교환(-150 mL / +150 mL) 또는 수확</td>
		</tr><tr><td>8일째</td>
			<td colspan="4">공정 중 샘플; 배지 교환(-150 mL / +150 mL) 또는 수확</td>
		</tr><tr><td>9일째</td>
			<td colspan="4">배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취</td>
		</tr><tr><td>10일째</td>
			<td colspan="4">공정 중 샘플; 배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취</td>
		</tr><tr><td>11일째</td>
			<td colspan="4">배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취</td>
		</tr><tr><td>12일째</td>
			<td colspan="4">배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취</td>
		</tr><tr><td>13일째</td>
			<td colspan="4">수확</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 프로세스 타임라인 및 개요. 이 표는 현재 임상 시험에서 사용되는 TCT 프로세스 단계를 요약한 것입니다[NCT05480449]. 이 과정은 CD4+/CD8+ 선택에 의한 T 세포 농축, 배양 파종 및 0일차에 활성화로 시작되며, 1일차에 형질도입이 이어집니다. 세포를 48시간 동안 휴지시킨 후 배양 세척, 배양량을 200mL로 늘리고 진탕 메커니즘을 사용하여 교반합니다. 6일째에 첫 번째 공정 중 샘플을 채취합니다. 최소 3회 용량의 CAR-T 세포(환자가 <50kg인 경우 5 × 10 6 CAR-T 세포/kg, 그렇지 않으면 2.5 × 108 CAR-T 세포) 및 품질 관리 테스트(~2 × 106 CAR-T 세포)에 충분한 세포가 확보되면 세포를 채취합니다. 또는 배양이 총 4-5 x 109 세포에 도달하면. 약어: TCT = T 세포 형질도입; CAR-T = 키메라 항원 수용체 T 세포; MACS = 자기 활성화 세포 분류.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 x 75 borosilicate tubes</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>TL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Reagent Bag</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL Transfer Set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>4R2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,000 mL Transfer Set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>4R2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep</td>
			<td>Tyco/Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bag Access</td>
			<td>Medline</td>
			<td>2300E-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 APC-Vio770 REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 CAR Detection Reagent Biotin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-129-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>555413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>340440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 VioBright FITC REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 VioBlue REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 APC-Vio770 REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Reference Beads 10um</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>B10-02-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Reference Beads 15um</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>B15-02-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Reference Beads 5um</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>B05-02-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Slides</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-SD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS CD4 GMP MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>276-01</td>
			<td>The CD4 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS CD8 GMP MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>275-01</td>
			<td>The CD8 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-021-201</td>
			<td>The buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Origen</td>
			<td>CP-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Bag 50 mL</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>200-074-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Vial, 1.8 mL</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12565171N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Vial, 4.5 mL</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12565161N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td></td>
			<td>Sterile filtered, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin 25%</td>
			<td>Grifols</td>
			<td>68516-5216-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin 5%</td>
			<td>Grifols</td>
			<td>68516-5214-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS GMP Recombinant Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-148</td>
			<td>The cytokines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS GMP T Cell TransAct</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>200-076-202</td>
			<td>The activation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoSeq Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4460623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, Hypodermic 14G</td>
			<td>Medline</td>
			<td>SWD200573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, SlideSafe 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>B-D305918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 2-200 &#956;L, individually wrapped</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022492209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 50-1000 &#956;L, individually wrapped</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022492225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets 10 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-27F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets 25 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-675-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets 5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-27E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte-A</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B2544X</td>
			<td>The electrolyte solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prodigy TS520 Tubing Set</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076- 600</td>
			<td>The tubing set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Field</td>
			<td>Medline</td>
			<td>NON21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin PE-Vio770</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 30 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TexMACS GMP Medium</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-306</td>
			<td>The medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Sampling Adapter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral Vector</td>
			<td>CHOP Clinical Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>huCART19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>The Baker Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS Prodigy</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>200-075-301</td>
			<td>The processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled Rate Freezer</td>
			<td>Planer/Kryosave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe nexgen-PTS150K</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mettler Balance</td>
			<td>Mettler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCD Sterile Tubing Welder</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sebra Tube Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varitherm</td>
			<td>Barkey</td>
			<td></td>
			<td>The dry thaw device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XN-330 Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chimeric antigen receptor t cell manufacturing on an automated cell processor

키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포는 다양한 악성 및 비악성 질환 치료를 위한 유망한 면역 치료 접근법을 나타냅니다. CAR-T 세포는 세포 표면 표적을 인식하고 결합하여 표적 세포를 죽이는 키메라 단백질을 발현하는 유전자 변형 T 세포입니다. 기존의 CAR-T 세포 제조 방법은 노동 집약적이고 비용이 많이 들며 오염 위험이 있을 수 있습니다. 자동화된 세포 프로세서인 CliniMACS Prodigy를 사용하면 폐쇄형 시스템에서 임상 규모로 세포 치료제를 제조할 수 있어 오염 위험을 최소화할 수 있습니다. 처리는 컴퓨터의 제어 하에 반자동으로 이루어지므로 프로세스에 대한 사람의 개입을 최소화하여 시간을 절약하고 변동성과 오류를 줄입니다.
이 원고와 비디오는 이 프로세서를 사용하여 CAR-T 세포를 제조하기 위한 T 세포 형질도입(TCT) 공정에 대해 설명합니다. TCT 과정에는 CD4+/CD8+ T 세포 농축, 활성화, 바이러스 벡터를 사용한 transduction, 확장 및 수확이 포함됩니다. 이러한 단계의 순서와 타이밍을 허용하는 기능인 활동 매트릭스를 사용하여 TCT 프로세스를 광범위하게 사용자 지정할 수 있습니다. 당사는 현행 우수제조관리기준(cGMP)을 준수하는 CAR-T 세포 제조에 대한 실무를 제공하고 임상시험용 신약(IND) 신청을 지원하는 필수 방출 테스트 및 전임상 실험에 대해 논의합니다. 임상 CAR-T 세포 제조를 위한 반자동 공정 사용의 타당성을 입증하고 장단점에 대해 논의합니다. 마지막으로, 소아 B세포 악성종양[NCT05480449]을 표적으로 하는 연구자 주도 임상시험을 이 제조 공정이 임상 환경에서 어떻게 적용될 수 있는지에 대한 예시로 설명합니다.

Adoptive transfer of T cells engineered to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown remarkable efficacy in treating patients with refractory B-cell malignancies1,2,3,4,5. However, the traditional manufacturing methods for CAR-T cells are labor-intensive, time-consuming, and require highly trained technicians to carry out highly specialized steps. For example, the traditional manufacturing process of an autologous CAR-T cell product involves density gradient centrifugation, elutriation&#160;or magnetic separation to enrich T cells, activation, and transduction with a viral vector in a sterile flask, and expansion in a bioreactor prior to harvest and formulation. Various systems have emerged recently that aim to partially automate this process. For example, the Miltenyi CliniMACS Prodigy (hereafter referred to as the &#34;processor&#34;) is an automated cell processing device that can perform many of these steps in an automated fashion6,7,8,9. An in-depth discussion of traditional and automated CAR-T manufacturing methods is presented in a recent review article10.
The processor builds upon the functionality of the CliniMACS Plus, a U.S. Food and Drug Administration (FDA)-approved medical device for the processing of hematopoietic progenitor cells. The processor includes a cell cultivation unit that allows for&#160;automated washing, fractionation, and cultivation of cells (Figure 1). The T cell transduction (TCT) process is a preset program within the processor device that largely replicates manual CAR-T cell manufacture. TCT allows for customizable cell processing using a graphical user interface (the &#34;Activity Matrix,&#34; Figure 2). Because the processor automates many steps and consolidates the functionality of multiple devices into one machine, it requires less training and specialized troubleshooting skills from technologists. Because all steps are performed within a closed, single-use tubing set, the processor may be operated in facilities with less stringent air-handling infrastructure than would be considered acceptable for an open manufacturing process. For example, we are operating the processor in a facility certified as ISO class 8 (comparable to EU grade C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg" /> 
Figure 1: CAR-T cell manufacturing using the T cell transduction system. Shown is the processor&#160;with the tubing set installed. The tubing set allows for connecting other components such as bags containing processing buffer, culture medium, and lentiviral vector via sterile welding. Once the leukapheresis product is added to the Application bag, it can be labeled with T Cell Selection Beads, passed through the Separation column, and then transferred into the Reapplication bag. Selected cells are then directed to the Cultivation unit of the instrument for culture and activated with the Activation reagent (see Table of Materials). The final product is collected in the Target cell bag. Throughout the process, it is possible to remove samples for quality control aseptically. Grey numbers inside of circles represent the numbered valves on the processor that direct the liquid path through the tubing set. Reproduced with permission from 11.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg" /> 
Figure 2: Activity Matrix. After T cell selection and activation, the remainder of the CAR-T cell manufacturing process is fully customizable. Activities&#160;can be added or deleted and scheduled for the appropriate day and time, and the culture volume after the activity can be specified (Volume). For example, the Transduction activity was configured to begin at 10:00 AM on Day 1, and the culture volume at the end of the activity was set as 100 mL. The Activity Matrix can be edited throughout the cultivation period. The status of the process can be monitored on the integrated screen of the processing device. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The aim of this manuscript is to provide a detailed walk-through of manufacturing CAR-T cells using the processor and additionally provide guidance on the in-process and product release testing that will likely be required by regulators to approve an investigational new drug (IND) application. The presented protocol stays close to the vendor&#39;s recommended approach and is the underlying protocol for IND 28617, which is currently being evaluated in a single-center investigator-initiated phase I/II clinical trial. This trial aims to determine the safety and efficacy of using this processor to manufacture humanized CD19-directed autologous CAR-T cells for patients with B cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) or B-lineage lymphoblastic lymphoma (B-Lly) [NCT05480449]. The trial started in September 2022 and is planned to enroll up to 89 patients ages 0-29 years with B-ALL or B-Lly. We report some manufacturing results from the trial in the manuscript.
We would like to point out that although the manuscript is presented as a protocol with steps to follow, it should be considered a starting point for others to begin optimizing their own CAR-T cell manufacturing process. A non-comprehensive list of possible variations to the presented protocol includes: using fresh instead of cryopreserved T cells as starting material; using a different method of T cell enrichment or omitting it altogether; using different media and cytokine cocktails such as IL7/IL15 instead of IL2; varying the concentration of human AB serum or omitting it altogether; timing of transduction; using &#34;multi-hit&#34; transductions; varying agitation, culture volumes, and feeding schedule; using different methods of genetic transfer including electroporation of nucleic acids or non-lentiviral vectors; using a different final formulation buffer and/or cryoprotectant; and infusing CAR-T cells fresh instead of cryopreserving for infusion at a later time. These variations may have a significant impact on the cellular composition and potency of the therapeutic product.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Overall Process Step</td>
			<td>Process Day</td>
			<td colspan="4">Technical Details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Enrichment</td>
			<td rowspan="2">Day 0</td>
			<td colspan="4">Selection of CD4+/CD8+ T cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Activation</td>
			<td colspan="4">T cell culture seeding and activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Transduction</td>
			<td>Day 1</td>
			<td colspan="4">Lentiviral transduction (100 mL culture volume)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="12">Cell Expansion (followed by cell formulation)</td>
			<td>Day 2</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 3</td>
			<td colspan="4">Culture Wash (1 cycle); Shaker activated; Culture volume increases to 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 4</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 5</td>
			<td colspan="4">Feed (50 mL); Culture volume reaches final volume of 250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 6</td>
			<td colspan="4">In-process sample; Media exchange (-125 mL / +125 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 7</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-150 mL / +150 mL) or Harvest&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 8</td>
			<td colspan="4">In-process sample; Media exchange (-150 mL / +150 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 9</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 10</td>
			<td colspan="4">In-process sample; Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 11</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 12</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 13</td>
			<td colspan="4">Harvest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Process timeline and overview. This table summarizes the TCT process steps employed in a current clinical trial [NCT05480449]. The process starts with T cell enrichment by&#160;CD4+/CD8+ selection,&#160;culture seeding,&#160;and activation on Day 0, followed by transduction on Day 1. Cells rest for 48 h, followed by a culture wash, an increase of the culture volume to 200 mL, and agitation using a shaking mechanism. On Day 6, the first in-process sample is taken. Cells are harvested once sufficient cells are available for at least three full doses of CAR-T cells (5 &#215; 106 CAR-T cells/kg if the patient is &#60;50 kg, otherwise 2.5 &#215; 108 CAR-T cells) and quality control testing (~2 &#215; 106 CAR-T cells); or once the culture reaches a total of 4-5 x 109 cells. Abbreviations: TCT = T cell transduction; CAR-T = chimeric antigen receptor T cells; MACS = magnetic-activated cell sorting.

저자 스포트라이트: CAR-T 세포 제조 및 유전자 치료제 생산의 발전 

자동화된 세포 프로세서에서 키메라 항원 수용체 T 세포 제조

The advantage of our protocol is that it is a semi-automated, closed system that still offers flexibility. The labor-intensive steps are replaced by the automation, which is run by a computer, and because it's run by a computer, the user can customize their protocol. This is also all done in a closed system.We found that the sort of stem cell laboratories that are commonly present in hospitals have the capability to produce clinical grade CAR-T cells at significantly lower cost than commercial alternatives. We think that our process could be easily adapted to make CAR-T cell specific for other targets, and also to manufacture other types of cell and gene therapies. Our team is poised to explore other CAR-T cell targets and new gene therapies.On a broader scale, cell and gene therapies are rapidly expanding, and we are excited to continue to support and innovate in this exciting field.

NCT05480449 임상시험의 초기 3회 CAR-T 제조 실행 결과는 아래 표 3에 나와 있습니다. 출발 물질, 벡터, 배양 사이토카인 및 AB 혈청 농도는 각 실행에 대해 일관되게 유지되었습니다. 제품은 7일 또는 8일에 수확되었습니다. 하루 평균 세포 성장율은 46%(총 세포 수 증가)였으며, 이는 TCT 과정이 세포 증식을 촉진하는 데 효과적임을 나타냅니다. 이러한 결과는 프로세서가 일관되고 재현 가능?...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in CAR-T Cell Manufacturing and Gene Therapy Production at JoVE.com

이 기사에서는 임상용 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 공정, 특히 T 세포의 바이러스 transduction 및 배양을 수행할 수 있는 자동 세포 프로세서를 사용하는 공정에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 권장 사항을 제공하고 초기 단계 임상 시험의 프로세스 개발 및 구현 중에 고려해야 할 함정을 설명합니다.

Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells represent a promising immunotherapeutic approach for the treatment of various malignant and non-malignant ...

우리 프로토콜의 장점은 여전히 유연성을 제공하는 반자동 폐쇄형 시스템이라는 것입니다. 노동 집약적인 단계는 컴퓨터에서 실행되는 자동화로 대체되며, 컴퓨터에서 실행되기 때문에 사용자가 프로토콜을 사용자 지정할 수 있습니다. 이 모든 것은 폐쇄형 시스템에서 수행됩니다.우리는 병원에서 흔히 볼 수 있는 줄기세포 실험실이 상용 대체품보다 훨씬 저렴한 비용으로 임상 등급의 CAR-T 세포를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것을 발견했습니다. 우리는 우리의 공정이 다른 표적에 대한 CAR-T 세포 특이성을 만들고 다른 유형의 세포 및 유전자 치료제를 제조하는 데 쉽게 적용될 수 있다고 생각합니다. 우리 팀은 다른 CAR-T 세포 표적과 새로운 유전자 치료법을 탐구할 준비가 되어 있습니다.더 넓은 범위에서 세포 및 유전자 치료는 빠르게 확장되고 있으며, 당사는 이 흥미로운 분야에서 계속 지원하고 혁신할 수 있게 되어 기쁩니다.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Chimeric Antigen Receptor T Cell Manufacturing on an Automated Cell Processor

1.7K 조회수.  Children’s Hospital of Philadelphia. 우리 프로토콜의 장점은 여전히 유연성을 제공하는 반자동 폐쇄형 시스템이라는 것입니다. 노동 집약적인 단계는 컴퓨터에서 실행되는 자동화로 대체되며, 컴퓨터에서 실행되기 때문에 사용자가 프로토콜을 사용자 지정할 수 있습니다. 이 모든 것은 폐쇄형 시스템에서 수행됩니다.우리는 병원에서 흔히 볼 수 있는 줄기세포 실험실이 상용 대체품보다 훨씬 저렴한 비?...