Laboratuvarımız, kimerik antijen reseptörleri gibi yapay bağışıklık reseptörleri tasarlar ve bunların düzenleyici T hücresi biyolojisini nasıl etkilediğini inceler. Yeni DNA dizileri icat ederek ve insanlaştırılmış fare hastalık modellerini kullanarak, otoimmün hastalık, nakil reddi, kanser ve yaşlanma için tasarlanmış bağışıklık hücresi tedavileri oluşturmayı amaçlıyoruz. Düzenleyici T hücreleri için kimerik antijen reseptörleri tasarlarken, güçlerini göz önünde bulundurmak çok önemlidir.
Yüksek afiniteli CAR Treg'ler daha çok efektör T hücreleri gibi davranır, artmış inflamatuar sitokinler üretir ve daha fazla öldürme aktivitesi gösterir. Devam eden araştırmamız, CAR afinitesinin azaltılmasının CAR Treg'lerde sitokin profillerinin ve fonksiyonlarının iyileşmesine yol açtığını göstermektedir. CAR Treg alanı yeni doğuyor ve standardizasyondan yoksun.
Protokolümüz, CAR Treg'leri oluşturmak ve test etmek için sağlam, evrensel bir yaklaşım sunar. Bu, tekrarlanabilirliği artırır ve yeniliği hızlandırırken, aynı zamanda, özellikle Treg kıtlığının ve özel gereksinimlerin zorlukları göz önüne alındığında, CAR Treg araştırmalarında yeni olan laboratuvarlara rehberlik eder. Düzenleyici T hücrelerinin bağışıklık dengesini korumak ve doku iyileşmesini desteklemek için kullandığı mekanizmaları inceliyoruz.
Araştırmamız, CAR Treg sinyalizasyonunu ve işlevini anlamanın yanı sıra, CAR Treg tedavisinin mevcut stratejilere kıyasla benzersiz faydalar sağlayabileceği yeni hastalık bağlamlarını keşfetmeyi de içerir. Başlamak için, lökopak içeriğini 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. % 2 fetal sığır serumu ile eşit miktarda DPBS ekleyin ve bir pipetle hafifçe karıştırın.
Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g'da döndürün. Süpernatan aspire edildikten sonra,% 2 fetal sığır serumu ile iki mililitre DPBS'de hücre peletini sulandırın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna sekiz mililitre amonyum klorür çözeltisi ekleyin ve hafifçe ters çevirerek karıştırın.
Kopma ile yıkanmış hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 150 g'da döndürün. Süpernatanı aspire ettikten sonra,% 2 fetal sığır serumu ile 30 mililitre DPBS'de hücre peletini yeniden süspanse edin. Ardından, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 g'da 10'u sekiz ila 10 ila dokuz PBMC'nin gücüne düşürün.
Ve hücre ayırma tamponunda beş kez 10 ila mililitre başına yedi hücre gücünde bir konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Düzenleyici T hücrelerinin floresan destekli hücre sıralaması için, CD4 pozitif hücreleri beş dakika boyunca 500g'de döndürün. Ardından, hücreleri 200 mikrolitre DPBS'de yeniden oluşturun.
Her bir milyon hücre için, bir mikrolitre anti-insan CD4 FITC, bir mikrolitre anti-insan CD25 APC ve bir mikrolitre anti-insan CD127 PE ekleyin. Tüpü nazikçe girdapladıktan sonra, 30 dakika boyunca dört santigrat derecelik bir buzdolabına koyun. Hücreler% 2 fetal sığır serumu ile 10 mililitre DPBS ile yıkandıktan sonra, beş dakika boyunca 500 g'da döndürün ve lekeli hücreleri% 2 fetal sığır serumu ile DPBS'de mililitre başına yedi hücrenin gücüne 1.5 kez 10 kez hafifçe yeniden süspanse edin. Daha sonra, lekeli hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir filtre kapağından floresan destekli hücre ayırma tüplerine geçirin.
Üç mililitre RPMI10 ortamı içeren 15 mililitrelik toplama tüpleri hazırlayın ve bunları buzun üzerine yerleştirin. Son olarak, floresan destekli hücre sıralaması kullanarak CD4 pozitif, CD25 yüksek, CD127 negatif düzenleyici T hücrelerini ve CD4 pozitif, CD25 düşük, CD127 pozitif konvansiyonel T hücrelerini sıralayın. Başlamak için, aktivasyondan 48 saat sonra insan kanından izole edilen düzenleyici T hücrelerini alın ve yeniden askıya alın.
Hücreleri saydıktan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 g'da döndürün. RPMI10'daki düzenleyici T hücrelerini, mililitre başına 1.000 uluslararası birim interlökin-2 ile mililitre başına altı hücrenin gücüne 1.25 kez 10 kez yeniden askıya alın. Şimdi, her bir lentivirüs alikotunu bir mikrosantrifüj tüpünde 200 mikrolitredeki beş düzenleyici T hücresinin gücüne 2.5 çarpı 10'a ekleyin.
32 santigrat derecede bir saat boyunca 1.000 g'da spinokülat. Her 200 mikrolitrelik reaksiyonu 24 oyuklu bir plakaya taşıyın. Plakayı, gece boyunca bir doku kültürü inkübatöründe transdüksiyona tabi tutulan düzenleyici T hücreleri ile inkübe edin.
Son interlökin-2 konsantrasyonu mililitre başına 1.000 uluslararası birim olacak şekilde her bir kuyucuğu RPMI10 ortamı ile iki mililitreye kadar doldurun. Burada gösterildiği gibi akış sitometrisi kullanarak gen modifikasyon verimliliğini değerlendirin. Başlamak için, aktivasyondan 48 saat sonra 15 mililitrelik konik bir tüpte anti-CD3, CD28 boncukları ile yeniden askıya alınmış düzenleyici T hücrelerini alın.
Hücre süspansiyonunu bir mıknatıs içinde üç dakika inkübe edin. Mıknatısın içindeyken, ortamdaki hücreleri pipet aracılığıyla yeni bir tüpe aktarın. Boncuk çıkarıldıktan sonra, boncukları alınmış düzenleyici T hücrelerinin iki saat boyunca RPMI10'da dinlenmesine izin verin.
Ardından, düzenleyici T hücrelerini beş dakika boyunca 500 g'da döndürün. Süpernatan boşaltıldıktan sonra, hücreleri önceden ısıtılmış indirgenmiş serum ortamında dört kez 10 ila mililitre başına altı hücrenin gücünde yeniden süspanse edin. Düşük proteinli bağlayıcı 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerinde 100 mikrolitrelik alikot hücreleri.
Her numuneye 20.000 enfeksiyon çokluğunda kimerik antijen reseptörü adeno ilişkili virüs ekleyin ve yeniden askıya alın. Daha sonra, reaksiyon tüplerini doku kültürü inkübatöründe bir saat inkübe edin. İnkübasyon sırasında, iz gen lokusunu hedefleyerek 2,5 mikrolitre tek kılavuz RNA'ya 8,3 mikrolitre Cas9 proteini ekleyerek CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein komplekslerini hazırlayın.
Bileşenleri iyice karıştırdıktan sonra, ribonükleoprotein karışımını doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Ardından, yeni bir elektroporasyon tüpünü üç mililitre yüksek ozmolariteli elektroporasyon tamponu ile doldurun. Doldurulmuş elektroporasyon tüpünü, bir tık sesi duyulana kadar elektroporasyon sisteminin pipet istasyonuna yerleştirin.
Elektroporasyon sisteminde elektroporasyon koşullarını 2.200 volt, 20 milisaniye, bir darbe olarak ayarlayın. Adeno ile ilişkili virüs ile bir saatlik inkübasyon tamamlandığında, virüslü hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 g'da döndürün. Süpernatan aspire edildikten sonra, hücre peletini numune başına elektroporasyon sistemi tarafından sağlanan 100 mikrolitre hücre yeniden süspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin.
Ardından, numune başına 10.8 mikrolitre ribonükleoprotein kompleksi ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan bir pipetle iyice karıştırın. Şimdi, kelepçeyi açmak için pipeti ikinci durağına iterek 100 mikrolitrelik bir elektroporasyon ucu yerleştirin. Pipetin üst kafasını, kelepçe pistonun montaj mili ile güvenli bir şekilde yerine oturana kadar elektroporasyon ucuna yerleştirin.
Ucun herhangi bir boşluk olmadan sıkıca oturduğundan emin olmak için pipet üzerindeki aşağı doğru basıncı korurken düğmeyi kademeli olarak bırakın. Ardından, pipeti ilk durağa kadar bastırın ve elektroporasyon ucunu hücre ribonükleoprotein karışımına daldırın. Numuneyi herhangi bir kabarcık olmadan yavaşça pipetin içine çekin.
Pipeti, numuneyi içeren monte edilmiş elektroporasyon ucu ile bir tık sesi duyulana kadar dikey olarak E tüpüne yerleştirin. İnsan düzenleyici T hücreleri için en uygun ayarları onayladıktan sonra, hücreleri elektroporate etmek için dokunmatik ekranda Başlat'a basın. Dokunmatik ekranın görüntülenmesinin tamamlanmasını bekleyin.
Pipeti nazikçe çıkarın ve numuneyi hemen oyuk başına interlökin-2 içeren 2,5 mililitre önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen RPMI10 ortamı içeren hazırlanmış altı oyuklu plakaya aktarın. Plakayı doğrusal hareketlerle hafifçe salladıktan sonra, doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ertesi gün, 16 ila 18 saat sonra, ortamı antibiyotik içeren ortamla değiştirin.
Elektroporasyonlu düzenleyici T hücrelerini ve kültürü, mililitre interlökin-2 başına 1.000 uluslararası birim ile mililitre başına altı hücrenin gücüne 10'da sayın.
