K14-mCherry-H2B fareleri için Valentina Greco'ya teşekkür ederiz. Emory Üniversitesi Fizik Bölümü Makine Atölyesi'ne cam lamel diskleri ürettiği için minnettarız. Bu çalışma, ABD Gazi İşleri Bakanlığı BLRD Hizmeti'nden LS'ye Kariyer Geliştirme Ödülü #IK2 BX005370, MJMR'ye NIH Ödülleri RF1-AG079269 ve R56-AG072473 ve MJMR'ye I3 Emory SOM/GT Hesaplama ve Veri Analizi Ödülü ile finanse edilmiştir.

Bu araştırma, Emory Üniversitesi ve Atlanta Gazi İşleri Tıp Merkezi hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Canlı görüntüleme ekinin ters mikroskop aşamasına takılması
<ol><li>3B boyutları ve tasarımı (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2A), bir 3B yazıcıyı ve polilaktik asidi (PLA) belirten .stl dosyalarını (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3) kullanarak eki oluşturun.</li>
	<li>Ek parçayı (Şekil 2B,C) büyük mikroskop tablası oluğuna dikkatlice yerleştirin (Şekil 2C ve Şekil 3A). Kesici ucun her bir köşesinde bulunan dört vida deliği aracılığıyla kesici ucu sabitlemek için vidaları kullanın (Şekil 2B-C). NOT: Ek parça çift yönlüdür ve mikroskop aşamasının ve anestezi aparatının yönüne bağlı olarak 180° döndürülebilir.</li>
	<li>Isı plakasını geçme tapasına tarafı aşağı bakacak şekilde kaydırın (Şekil 2D), böylece ünite, fiş portu s'nin altından geçecek şekilde alt geçme oluklarının üzerine uzanır.tage (Şekil 3B).</li>
	<li>Ek parçadaki yivli dairesel açıklığı 40x silikon yağına daldırma objektifi ile hizalayın (Şekil 3C) ve objektifin ortasına silikon yağı uygulayın.<ol><li>Daha uzun sürelerde (>1 saat) görüntüleme yapıyorsanız, görüntüleme boyunca lamel / objektif arayüzünde kalacak bol miktarda yağ uygulayın. Lensin kenarlarına yağ dökülmesine izin vermeyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Yivli dairesel açıklık boyunca az miktarda vakumlu gres uygulamak için bir şırınga kullanın ve ek parçaya sızdırmaz hale getirmek için lamel diskini üstüne yerleştirin (Şekil 3D). NOT: Lamel diski, 35 mm x 10 mm'lik bir cam tabanlı hücre kültürü kabının (bir makine atölyesi tarafından gerçekleştirilir) duvarlarının çıkarılmasıyla oluşturulur.</li>
	<li>40x objektifi, yağ cam lamellerin altını öpene kadar yükseltin.</li>
</ol>2. İzofluran konfigürasyonu ve fare hazırlığı
<ol><li>Düşük akışlı elektronik buharlaştırıcı bileşenlerini (anestezi odası, hortum, buharlaştırıcı, kömür kabı) burun konisinin ve bağlı borunun ek parçaya ulaşmasını sağlayacak şekilde konumlandırın (Şekil 3A). DİKKAT: İzofluran bir inhalasyon anestezisidir ve dökülmeleri önlemek ve insan maruziyetini en aza indirmek için dikkatli kullanılmalıdır.</li>
	<li>Kullanmadan önce izofluran şişesinin ağırlığını ölçün ve kaydedin. Elektronik buharlaştırıcının kapağını izofluran şişesine takın.</li>
	<li>Güç kablosunu elektronik buharlaştırıcıya bağlayın. Mavi burun konisi klipslerini kapatın ve odadan kömür kutusuna hava akışına izin vermek için beyaz indüksiyon odası klipslerini açın. Hava akışına izin vermek için makinenin sol tarafındaki kırmızı ortam havası kapağını çıkarın.</li>
	<li>Sistemin 200 mL/dk (düşük akış) ve %2 izofluranda 5 dakika ısınmasına izin verin. NOT: Burun konisi ayarı seçilse de mavi burun konisi çizgisi kapalı, beyaz indüksiyon odası çizgisi açık kalmalıdır.</li>
	<li>Sistem uygun şekilde dengelendikten sonra, kalan izofluranı odadan çıkarmak için hatları temizleyin.</li>
	<li>Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve Yüksek Akış'ı seçin. Hayvanın vücudunu ek parçanın üzerine yerleştirmeden önce tüm fare hazırlığını (yani epilasyon, topikal ilaç dağıtımı, göz merhemi uygulaması vb.) tamamlayın. Ayak parmağı kıstırma refleks yöntemini kullanarak farenin tamamen uyuşturulduğunu onaylayın.<ol><li>Bacak uzatılmışken, fiziksel hasara neden olmadan ayak parmağını sıkıca sıkıştırmak için bir tırnağınızı kullanın. Fare uyarana pozitif bir tepki gösterirse (ör., bacak çekilmesi, ayak seğirmesi, vb.), Herhangi bir reaksiyon gözlenene kadar oda içinde anestezi uygulamaya devam edin. Uygun şekilde uyuşturulduktan sonra, fare solunum hızı dakikada ~ 55-65 nefese kadar yavaşlamalıdır18.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare tamamen uyuşturulduğunda, izofluran iletimini durdurmak için tekrar Yüksek Akış'ı seçin. Açmadan önce hazneyi boşaltın ve burun konisinden izofluran vermek için klipsleri (mavi: açık; beyaz: kapalı) ayarlayın. İzofluran dağıtımına devam etmek için burun konisi fareye takılıyken Düşük Akış'ı seçin.</li>
	<li>Ekli burun konisi ile izofluran boruyu, ek parçadaki köşe boru braketinden geçirin (Şekil 3A ve Şekil 5).</li>
</ol>3. İntravital görüntüleme için ek parçaya fare yerleşimi
<ol><li>Isı plakasını kontrolöre (ekli bir anal prob içeren) takın, gücü açın ve plakanın 36 °C'ye ulaşmasını bekleyin (Şekil 4A).</li>
	<li>Anestezi uygulanmış fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve ısı plakasının üzerine yerleştirin (Şekil 4B ve Şekil 5A). Farenin inhalan anestezi olmadan aktif olduğu süreyi en aza indirmek için hazneden yerleştirmeye hızlı bir şekilde transfer edin.</li>
	<li>Burun konisini fareye sabitleyin (Şekil 4B,C ve Şekil 5). Gerekirse, burun konisinin açısını ve konumunu daha da sabitlemek için bant kullanın.</li>
	<li>Anal probu takın ve fare vücut sıcaklığı ~36 °C'de sabit olana kadar kontrolör sıcaklığını ayarlayın (Şekil 4A,B). Fare uygun şekilde yerleştirildikten sonra, uygun vücut sıcaklığını daha fazla desteklemek için gerekirse ısıyı hapsetmek için plastik streç film kullanın (Şekil 4C).</li>
	<li>Fareyi, kafa lamel diskiyle hizalanacak şekilde konumlandırın ve metal bir kulak klipsi (Şekil 5A,B) veya bant (Şekil 5C) kullanarak kulağı cam lamellerin ortasına sabitleyin. NOT: Metal kulak klipsinin kulak üzerindeki basıncı, klipsi ek parçaya sabitleyen vida gevşetilerek ayarlanabilir. Klips sıkma esnekliğini artırmak için metal bir yay eklenebilir.<ol><li>Kulak klipsi konumunu değiştirmek için cıvatayı 2.5 mm Alyen anahtarıyla sökün ve ikincil bölgeye aktarın (Şekil 2B,C). Kulak klipsini yeniden monte ederken, klipsi ek parçaya ve ardından rondelayı üstüne yerleştirin. Klipsi döndürmek için hafif bir kuvvetle klipsi güvenli bir şekilde sabitlemek için bir cıvata kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreler odak noktasına gelene kadar objektif z konumlandırmasını ayarlayın (Şekil 6A,D). Deneysel hedeflere göre z-stack ve time-lapse parametrelerini ayarlayın ve görüntü alımına başlayın. NOT: Doğru kurulum sağlanırsa, fare kulağı en az 3 ardışık saat boyunca görüntülenebilir (Şekil 6A',D').<ol><li>Z-yığını sınırları ayarlandıktan sonra, foto ağartmayı en aza indirmek için hiçbir z-düzleminin aşırı doygun olmadığından emin olmak için lazer gücünü ve kazancını ayarlayın. z yığınının toplam kalınlığını, adım numaralarını (Nyquist örneklemesi önerilir) ve zaman aralıklarını kullanarak hızlandırılmış parametreleri belirleyin.</li>
		<li>Anestezi altında hayvan canlılığı, lazerle indüklenen fotoağartma/fototoksisite ve canlı görüntülemenin amacı (yani hücre bölünmesi dinamikleri, hücre-hücre etkileşimleri vb.) dahil olmak üzere birden fazla faktörü kullanarak görüntüleme parametrelerini (zaman aralıkları, toplam görüntüleme süresi vb.) belirleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Görüntülemenin sonlandırılması
<ol><li>Su sirkülasyonlu ısı yastığını açın ve görüntü alımının sonlandırılmasından en az 35 dakika önce Sürekli Döngü ve 30 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Görüntüleme tamamlandıktan sonra, izofluran iletimini durdurmak için elektronik buharlaştırıcıda Düşük Akış'ı seçin ve fareyi ambulatuvar olana kadar bir ısı yastığına taşıyın.</li>
	<li>Uyandıktan sonra, tamamen yürüyene kadar bir ısı yastığı üzerinde tutmaya devam ederken fareyi transfer kabına geri getirin. Yanıt verene kadar ısı yastığı üzerindeyken fareyi sürekli olarak izleyin.</li>
	<li>Elektronik buharlaştırıcıda, Menü Seç'e > Anestezik Kontrol'e tıklayın > Boş'a tıklayın. İzofluran şişesini sistemden çıkarın ve üreticinin kapağını şişeye geri yerleştirin.</li>
	<li>İzofluran şişesinin ve kömür bidonunun ağırlığını ölçün ve ağırlıkları kütüğe girin. Kömür bidonunun ağırlığı temel ölçümün 50 g üzerinde olduğunda, bidonu atın ve yeni bir ünite ile değiştirin. İzofluranı kilitli kutuya geri koyun.</li>
	<li>Lamel diskini çıkarın ve lens kağıdı ve lens solüsyonu ile silerek temizleyin. Yeniden kullanım için çizikleri önlemek için uygun şekilde saklayın.</li>
	<li>Anestezi tüpünü insert braketinden çıkarın ve insert parçayı mikroskop aşamasından sökün.</li>
</ol>

Cilt hücresi dinamiklerini izlemek için ters mikroskop kullanarak intravital görüntüleme

<ol>
	<li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment.">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li><li>Nal Chen, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy.">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196 (2022).</li><li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver.">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li><li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+imaging+of+breast+cancer.">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li><li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration.">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li><li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse.">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li><li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis.">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li><li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin.">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li><li>Pal Arndt, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra/extraglomerular+feedback+system.">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).</li><li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy.">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li><li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice.">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li><li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues.">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).</li><li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology.">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li><li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue.">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).</li><li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool.">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li><li>Ral Li, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response.">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Tal Tumbar, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).</li><li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy.">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışmada, inverted konfokal mikroskoplarda sağlam fare derisi epitelinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran yeni bir araç sunuyoruz. Bu buluş, en yaygın ve ucuz 3D yazdırılabilir malzeme olan PLA'dan yapılmıştır; Bu ek parça için tüm şirket içi 3D baskı maliyetleri 5 < tutarındadır. İki ayrı kesici uç parçası (Şekil 1, Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) ayar vidaları kullanılarak kolayca monte edilebili...

İntravital mikroskopi, hücre davranışlarının bozulmamış in vivo ortamlarında izlenmesini sağlayan güçlü bir araçtır. Bu benzersiz yöntem, akciğer1, beyin2, karaciğer3, meme bezi4, bağırsak5 ve cilt6 dahil olmak üzere karmaşık memeli organ sistemlerinin iç işleyişi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, bu yaklaşım, tümör gelişimi 7, yara iyileşmesi 8,9, inflamasyon 10 ve diğer çeşitli patolojiler sırasında hücre davranış değişikliklerini ortaya çıkarmıştır. Bu çalışmada, sağlam fare derisinde canlı epitelyal ve stromal dinamikleri görüntülemek için intravital mikroskopinin erişilebilirliğini artırmaya odaklandık. Memeli derisindeki hücre davranışlarını anlamak, bu dokunun olağanüstü rejeneratif ve tümörjenik kapasitesi nedeniyle yüksek klinik öneme sahiptir.
Farelerde intravital görüntüleme, doku derinliklerinde >100 μm11,12 yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlama yetenekleri nedeniyle öncelikle dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu cihazlar, daha kullanıcı dostu ve uygun maliyetli olan, kültürlenmiş hücreleri görüntüleme yeteneği sağlayan, görüntü elde etme sırasında tam karanlık gerektirmeyen ve genellikle daha güvenli olan ters konfokal mikroskopların çok yönlülüğünden ve daha genel erişilebilirliğinden yoksundur13,14. Bu çalışmada, bu yaklaşımı ters konfokal mikroskoplar için uyarlayarak intravital görüntüleme erişilebilirliğini önemli ölçüde artıran yeni bir araç sunuyoruz.
Burada, ters konfokal bir mikroskopta fare kulağı derisinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştırmak için birkaç temel özelliği içeren 3D baskılı özel bir sahne eki tasarımı sunuyoruz (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5). Bu özel özellikler, görüntüleme sırasında yetişkin bir farenin tüm gövdesinin tamamen düz durmasına izin veren bir ofset objektif deliği içerir. Bu, fare vücut hareketlerinin görüntüleme üzerindeki titreşimsel girişimini en aza indirir ve genellikle intravital görüntüleme ile birleştirilen bir uygulama olan solunumu azaltmak için ketamin ve ksilazin uygulama ihtiyacını ortadan kaldırır6. Ek olarak, kesici uçtaki köşe parantezleri, farenin yüzüyle hizalanacak şekilde bir izofluran burun konisini doğru şekilde konumlandırır, metal bir kulak klipsi, fare kulağını özel olarak oluşturulmuş bir lamel diskine sabitler ve isteğe bağlı çıkarılabilir kapalı döngü biofeedback ısı plakası, uzun görüntüleme oturumları sırasında fare vücut sıcaklığını desteklemek için ek parçanın içinde aynı hizada bulunur. Fare kafasının ve kulağının düz durması için gerekli olan düz bir yüzey sağlayan özel lamel diski, bir makine atölyesinde, genel bir lamel içeren hücre kültürü kabının duvarlarının kaldırılmasıyla üretildi. Lamel diski ve özel sahne eki ile birlikte 40x silikon yağına daldırma lensinin (1,25 sayısal açıklık [N.A.], 0,3 mm çalışma mesafesi) kullanılması, kulak dermisinin derinliklerinde >50 μm derinliğinde yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar.
Bu yeni ters çevrilmiş mikroskop aşaması ekinin işlevselliğini test etmek için, canlı bir transgenik K14-H2B-mCherry15 yetişkin farenin kulağında 3 saatlik bir zaman seyri boyunca tüm epidermal epitel katmanlarını kapsayan z-yığınlarını yakaladık (bu fare serisindeki epitel çekirdekleri kırmızı bir floresan etiketi içerir) (Şekil 6A-A'). Ayrıca, canlı bir transgenik Pdgfra-rtTA16'nın kulağında 3 saatlik bir zaman seyri boyunca cilt dermisi içindeki birkaç fibroblast tabakasını kapsayan z-yığınlarını yakaladık; pTRE-H2B-GFP17 yetişkin fare (bu fare serisindeki fibroblast çekirdekleri, doksisiklin indüksiyonunu takiben yeşil bir floresan etiketi içerir) (Şekil 6B-D'). Yüksek çözünürlüklü verilerimiz, x, y ve z düzlemlerinde sapma olmaması nedeniyle tutarlı bir kararlılık göstermekte ve böylece bu yeni intravital görüntüleme aracının ters mikroskoplarda kullanım için etkinliğini kanıtlamaktadır. Daha da önemlisi, bu 3D baskılı aşama ekinin boyutları, Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3'te açıklandığı gibi, herhangi bir ters çevrilmiş mikroskoba uyacak şekilde ayarlanabilir ve objektif açıklığın konumu, ilgilenilen belirli bir doku ve/veya hayvan modelinin görüntülenmesine daha iyi uyması için ek içindeki alternatif konumlara taşınabilir. Bu buluş, böylece bireysel laboratuvarları veya çekirdek tesis konfokal erişimi olan araştırmacıları, bu aracı benzersiz intravital görüntüleme ihtiyaçlarına uyarlamak için güçlendirebilir ve böylece çeşitli in vivo hücre biyolojisinin değerlendirilmesini kolaylaştırabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Qudi Tech</td>
			<td>i-Fast</td>
			<td>3D prints using PLA material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x 1.25NA silicone objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxR Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Swab</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76337-046</td>
			<td>Cream/ointment application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screwdriver (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Affiix insert to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screws x 4 (#6-32)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Screw insert into microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dish</td>
			<td>chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1811-002</td>
			<td>Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Plate controller</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2LV</td>
			<td>Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (1.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For M3 setscrew adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adjust tension on metal ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging Insert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>HPA030782-100uL</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape (or Scotch Tape)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-458</td>
			<td>Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal fastener</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used as ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:034459</td>
			<td>Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: K14-H2BPAmCherry</td>
			<td>Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University</td>
			<td></td>
			<td>Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as &#34;K14-H2B-mCherry&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK 
			Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:005104</td>
			<td>&#160;Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Sealing Wrap</td>
			<td>Glad</td>
			<td></td>
			<td>Enhance mouse warmth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MSPP-078932779</td>
			<td>Eye lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screws x 3 (M3; 6 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SS3M6</td>
			<td>Attachment for heatplate module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Immersion Oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Applied to 40x silicone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Heating Plate</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>HP-4M</td>
			<td>Provides heat to animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SF-01</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Grease</td>
			<td>Flinn Scientific</td>
			<td>AP1095</td>
			<td>Seals coverslip disk to insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hair removal&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulating heat pad</td>
			<td>Stryker Medical</td>
			<td>TP700</td>
			<td>for mouse revival post-imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined intravital imaging approach for long-term monitoring of epithelial tissue dynamics on an inverted confocal microscope

Normal ve anormal in vivo hücre davranışlarını anlamak, hastalığın başlamasını ve ilerlemesini engellemek için klinik müdahaleler geliştirmek için gereklidir. Bu nedenle, doku yapısının ve bileşiminin bozulmadan kaldığı hücre dinamiklerinin yerinde gözlemlenmesini kolaylaştıran görüntüleme yaklaşımlarını optimize etmek çok önemlidir. Epidermis, vücudun en dış bariyeri ve aynı zamanda en yaygın insan kanserlerinin, yani kutanöz cilt karsinomlarının kaynağıdır. Cilt dokusunun erişilebilirliği, noninvaziv intravital mikroskopi kullanarak bozulmamış hayvanlarda epitelyal ve dermal hücre davranışlarını izlemek için eşsiz bir fırsat sunar. Bununla birlikte, bu sofistike görüntüleme yaklaşımı, öncelikle, çoğu araştırmacı için giriş için önemli bir engel teşkil eden dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak elde edilmiştir. Bu çalışma, canlı transgenik farelerde kulak derisinin uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran, ters konfokal mikroskoplarla kullanıma uygun, özel olarak tasarlanmış, 3D baskılı bir mikroskop aşaması eki sunmaktadır. Ters mikroskop markasına ve tercih edilen modele uyacak şekilde özelleştirilebilen ve ek organ sistemlerini görüntülemek için uyarlanabilen bu çok yönlü buluşun, intravital mikroskopinin erişilebilirliğini önemli ölçüde artırarak daha büyük bilimsel araştırma topluluğu için paha biçilmez olacağına inanıyoruz. Bu teknolojik ilerleme, normal ve hastalık bağlamlarında canlı hücre dinamikleri hakkındaki anlayışımızı güçlendirmek için kritik öneme sahiptir.

Intravital microscopy is a powerful tool that allows the monitoring of cell behaviors in their unperturbed in vivo environments. This unique method has provided key insights into the inner workings of complex mammalian organ systems, including the lung1, brain2, liver3, mammary gland4, intestine5, and skin6. Furthermore, this approach has revealed cell behavioral alterations during tumor development7, wound healing8,9, inflammation10, and other diverse pathologies in situ. In this study, we focus on enhancing the accessibility of intravital microscopy to image live epithelial and stromal dynamics in intact mouse skin. Understanding cell behaviors in mammalian skin is of high clinical importance due to the remarkable regenerative and tumorigenic capacity of this tissue.
Intravital imaging in mice has&#160;been primarily performed using upright multiphoton microscopes due to their ability to provide high-resolution imaging at tissue depths &#62;100 &#181;m11,12. Nevertheless, these instruments&#160;lack the workhorse versatility and more general accessibility of inverted confocal microscopes, which are more user-friendly and cost-effective, provide the ability to image cultured cells, do not require complete darkness during image acquisition, and are generally safer, among other notable advantages13,14. In this study, we present a new tool that significantly enhances intravital imaging accessibility by adapting this approach for inverted confocal microscopes.
Here, we present a 3D-printed custom stage insert design that incorporates several key features to facilitate stable, long-term intravital imaging of mouse ear skin on an inverted confocal microscope (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, and Figure 5). These specialized features include an offset objective hole that allows the full body of an adult mouse to lay entirely flat during imaging. This minimizes the vibrational interference of mouse body movements on imaging and eliminates the need to administer ketamine and xylazine to dampen breathing, a practice often coupled with intravital imaging6. In addition, corner brackets on the insert correctly position an isoflurane nose cone to align with the face of the mouse, a metal ear clip immobilizes the mouse ear to a custom-built coverslip disk, and an optional detachable closed-loop biofeedback heat plate lies flush within the insert to support the mouse body temperature during long imaging sessions. The custom coverslip disk, which provides a flat surface essential for the mouse head and ear to lay flat, was generated in a machine shop by removing the walls of a generic coverslip-containing cell culture dish. The use of a 40x silicone oil immersion lens (1.25 numerical aperture [N.A.], 0.3 mm working distance) in conjunction with the coverslip disk and custom stage insert provides high resolution images &#62;50 &#181;m deep into the ear dermis.
To test the functionality of this new inverted microscope stage insert, we captured z-stacks spanning all epidermal epithelial layers over a 3 h time course in the ear of a live transgenic K14-H2B-mCherry15 adult mouse (epithelial nuclei in this mouse line contain a red fluorescent label) (Figure 6A-A&#39;). We also captured z-stacks spanning several fibroblast layers within the skin dermis over a 3 h time course in the ear of a live transgenic Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 adult mouse (fibroblast nuclei in this mouse line contain a green fluorescent label following doxycycline induction) (Figure 6B-D&#39;). Our high-resolution data demonstrate consistent stability by lack of drift in the x-, y-, and z-planes, thus proving the effectiveness of this new intravital imaging tool for use on inverted microscopes. Importantly, the dimensions of this 3D-printed stage insert can be adjusted, as described in Supplementary File 1, Supplementary File 2, and Supplementary File&#160;3, to fit any inverted microscope, and the positioning of the objective opening can be moved to alternative locations within the insert to better suit imaging a particular tissue and/or animal model of interest. This invention can thus empower individual laboratories, or investigators with core facility confocal access, to adapt this tool for their unique intravital imaging needs, thereby streamlining evaluation of diverse in vivo cell biology.

Yazar Spotlight: İn Vivo İntravital Görüntüleme için Ters Konfokal Mikroskopları Kullanmak İçin Bir Araç Geliştirme 

Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

We developed a tool to perform intravital imaging on live mice using an inverted confocal microscope. This enables us to track skin cell dynamics throughout homeostasis and compare cell behaviors during disease onset and progression. Multiphoton microscopy is the primary approach applied to achieve intravital cell tracking.However, the disadvantages of these microscopes include limited day-to-day imaging versatility, high cost, and technical complexity. Our new tool enables the use of versatile inverted confocal microscopes for in vivo intravital imaging. By modifying the design file, the stage insert dimensions can be customized to fit any make of inverted microscope.The objective hole can be resized and repositioned to fit any animal model and tissue of choice.

Canlı görüntüleme ekinin ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop üzerine uygun şekilde monte edilmesi ve ek parçanın üzerine transgenik bir farenin uygun şekilde yönlendirilmesi, ≥1 saatlik bir süre boyunca floresan etiketli, canlı kulak dokusunun z-yığınlarının elde edilmesiyle doğrulanır ve x, y- ve z eksenlerinde minimum sapma kanıtı vardır. Görüntüler tutarlı aralıklarla yakalanmalıdır (aralık süresi biyolojik soruya, floresan sinyalinin gücüne vb. bağlı olacaktır), böylece hü...

Watch this Scientific Journal Video about Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging at JoVE.com

Protokol, ters konfokal mikroskopi kullanarak intravital görüntülemeyi basitleştirmek için yeni bir araç sunar.

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Ters konfokal mikroskop kullanarak canlı fareler üzerinde intravital görüntüleme yapmak için bir araç geliştirdik. Bu, homeostaz boyunca cilt hücresi dinamiklerini izlememizi ve hastalığın başlangıcı ve ilerlemesi sırasında hücre davranışlarını karşılaştırmamızı sağlar. Multifoton mikroskobu, intravital hücre takibini sağlamak için uygulanan birincil yaklaşımdır.Bununla birlikte, bu mikroskopların dezavantajları arasında sınırlı günlük görüntüleme çok yönlülüğü, yüksek maliyet ve teknik karmaşıklık yer alır. Yeni aracımız, in vivo intravital görüntüleme için çok yönlü ters konfokal mikroskopların kullanılmasını sağlar. Tasarım dosyasını değiştirerek, sahne ekleme boyutları, herhangi bir ters mikroskop markasına uyacak şekilde özelleştirilebilir.Objektif deliği, tercih edilen herhangi bir hayvan modeline ve dokusuna uyacak şekilde yeniden boyutlandırılabilir ve yeniden konumlandırılabilir.

streamlined-intravital-imaging-approach-for-long-term-monitoring

Research

JoVE Journal

Biology

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

1.1K Görüntüleme.  Emory University School of Medicine. Ters konfokal mikroskop kullanarak canlı fareler üzerinde intravital görüntüleme yapmak için bir araç geliştirdik. Bu, homeostaz boyunca cilt hücresi dinamiklerini izlememizi ve hastalığın başlangıcı ve ilerlemesi sırasında hücre davranışlarını karşılaştırmamızı sağlar. Multifoton mikroskobu, intravital hücre takibini sağlamak için uygulanan birincil yaklaşımdır.Bununla birlikte, bu mikroskopların dezavantajları arasında sınırlı günlük görün...

Video: Yazar Spotlight: İn Vivo İntravital Görüntüleme için Ters Konfokal Mikroskopları Kullanmak İçin Bir Araç Geliştirme 

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It is therefore critical to optimize imaging approaches that facilitate the observation of cell dynamics in situ, where tissue structure and composition remain unperturbed. The epidermis is the body&#39;s outermost barrier, as well as the source of the most prevalent human cancers, namely cutaneous skin carcinomas. The accessibility of skin tissue presents a unique opportunity to monitor epithelial and dermal cell behaviors in intact animals using noninvasive intravital microscopy. Nevertheless, this sophisticated imaging approach has primarily been achieved using upright multiphoton microscopes, which represent a significant barrier for entry for most investigators. This study presents a custom-designed, 3D-printed microscope stage insert suitable for use with inverted confocal microscopes, streamlining the long-term intravital imaging of ear skin in live transgenic mice. We believe this versatile invention, which may be customized to fit the inverted microscope brand and model of choice and adapted to image additional organ systems, will prove invaluable to the greater scientific research community by significantly enhancing the accessibility of intravital microscopy. This technological advancement is critical for bolstering our understanding of live cell dynamics in normal and disease contexts.

The protocol presents a new tool to simplify intravital imaging using inverted confocal microscopy.

Biyoloji

Installing the Live Imaging Insert on an Inverted Microscope Stage

To begin installing the 3D printed live imaging insert on the inverted microscope stage, carefully place the insert into the large microscope stage groove. Using screws, secure each corner of the insert. Slide the heat plate into the side opening of the insert in a plug side down orientation, so the plate lays atop the lower insert grooves with the plug port underneath the stage.Align the grooved circular opening in the insert with a 40 x silicone oil immersion objective and apply silicone oil to the center of the objective. Then using a syringe, apply a small amount of vacuum grease along the grooved circular opening. Lay the cover slip disk on top of the opening to seal it onto the insert.Finally, raise the 40 x objective until it barely touches the bottom of the glass cover slip.

Canlı Görüntüleme Ekini Ters Mikroskop Tablasına Takma

Mounting the Mouse on the Live Imaging Insert for Intravital Imaging

Before placing the anesthetized mouse on the live imaging insert installed on the inverted microscope stage, thread the isoflurane tubing with the attached nose cone through the corner tubing bracket on the insert. After plugging the heat plate into the controller containing an attached anal thermometer probe and switching it on, transfer the anesthetized mouse from the induction chamber onto the heat plate. Then secure the nose cone onto the mouse.Insert the anal probe into the animal and adjust the controller to maintain a stable body temperature of about 36 degrees Celsius. Cover the properly-positioned mouse with a plastic cling wrap to trap body heat and elevate the body temperature. Position the mouse such that its head aligns with the cover slip disc and immobilize its ear onto the center of the glass cover slip using a metal ear clip or tape.After completing imaging, select the Low Flow option on the electronic vaporizer to cease isoflurane delivery. Transfer the mouse to a heating pad until it becomes ambulatory. After removing the cover slip disc, wipe it clean with lens paper and lens solution.Store it properly to avoid scratches for reuse. Next, detach the anesthetic tubing from the insert bracket and unscrew the insert from the microscope stage. The acquired Z-stacks of fluorescently-labeled live mouse ear tissue showed minimal drift in the x, y and z axes over time, validating the custom 3D printed live imaging inserts.The time points from a three hour time lapse movie of the mCherry positive mouse ear epidermal cells of an adult male mouse revealed a single z plane remaining in focus over the extended time. Similar observations were made from another three-hour time lapse movie of GFP positive ear dermal fibroblasts of an adult female mouse.