Bu çalışma DAL ödüllendirildi Sağlık / enstitünün (1ZIAHL006126) ve bir Lenfant Biyomedikal Doktora Sonrası Araştırma Bursu National Institutes intramural araştırma bölümü tarafından desteklenmiştir.

1.. Malzemeler Gerekli hazırlanması Üçüncü Instar Larva Brain eksplantasyona <ol><li> Mikrodiseksiyon için gerekli araçları hazırlamak. <ol><li> Öncelikle her pim yuvasına bir tek diseksiyon pimi koyarak iki diseksiyon araçları (bir neşter ve bir kanca) kurma. Elle veya pense (Şekil 1C) ile sıkıca işaretçilerine sabitleyin. </li><li> Yaklaşık 120 ° açı bir diseksiyon pin bükmek için eski bir çift forseps kullanın. Pim tutucu elinde olduğunda pimin üst yarısı düz yatıyor sağlamak için bir mikroskop altında bunu yapın. Bu araç, basılı veya doku yoluyla dilim bir neşter olarak kullanılacaktır. </li><li> Tutun ve doku kazımak için kullanılan bir kanca içine ikinci pimi bükmek için eski bir çift forseps kullanın. </li><li> Hasardan araçları korumak için bir pipet ile her kesme aletini örtün. Bakım, iyi-oluşturulmuş araçları süresiz diseksiyon için kullanılabilir. Gerektiğinde hasarlı veya deforme işaretçilerine değiştirin. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Orta diseksiyon hazırlayın. <ol><li> Bir doku kültürü kaputu, Schneider&#39;in kültür ortamı içine antibiyotik-antimikotik ek sulandırmak. Ek dahil medyayı girdap. </li><li> Takviye edilmiş ortam bir çok 5 ml&#39;lik numuneler hazırlayın. Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C&#39;de tüm medya saklayın. </li><li> Oda sıcaklığına kadar takviye edilen ortam içinde, 5 ml&#39;lik bir şişe ısıtın. Steril bir 5 ml şırınganın içine orta çizin ve bir steril 0.2 mikron şırınga filtresi üzerindeki vida. </li></ol></li><li> Diseksiyon için larva seçin. Beyin incelemek için kolay olacak gibi sürünerek üçüncü larva evresindeki seçmek için bir diseksiyon prob kullanın. İsteğe bağlı: Bir üzüm agar plaka üzerinde mevduat larvalar. Not: Bu erken dışarı tarama için ikinci veya birinci larva evresindeki zorlamak eğilimi olarak &quot;ıslak gıda,&quot; ile aşırı kalabalık şişeleri veya şişeleri kullanmayın. Not: Bazı genetik arka genç larvaları kullanılarak gerektirecek. Bu protokol etkilemez, ama d yapmak yokissection daha zor. </li></ol> Merkezi Sinir Sistemi 2. Diseksiyon <ol><li> Tek bir cam slayt üzerine, yaklaşık 3 cm ayırarak sıcak diseksiyon medyanın iki 50 ml havuzu oluşturun. Bir havuz ince diseksiyon (Şekil 1C) için kullanılan brüt diseksiyon ve diğer için kullanılacaktır. </li><li> Ortam damla birine çeşitli larva aktarın. </li><li> Diseksiyon mikroskop larvaları ile lamel taşıyın. Larvaların ön ve arka uçlarının fark edilebilir olduğu bu tür larvaları ihtiva eden havuza büyüt. </li><li> Tek bir larva orta bölgeyi kavramak için forseps bir çift kullanın. Öte yandan forseps ikinci bir çift almak ve aynı bölgeye yakın larva kavramak. Yavaşça yarısında larva gözyaşı ayrı forseps iki çift çekin. Lamel tüm larvaları için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın. </li><li> Bir dokuya aktararak larva vücudun posterior yarısı atmayın. </li><li> Bir larva yakınlaştırmak inci böyleceE anterior mouthhooks açıkça görülebilir. Üçüncü torasik ve birinci ön denticle bantlar arasındaki larva mouthhooks ters tarafta küçük bir kesik veya çentik oluşturmak için forseps iki çift kullanın. </li><li> Baskın olmayan el forseps ile mouthhooks kavrayın. Nazikçe bir ön-to-posterior yönde manikür soyulmaya, diğer yandan forseps kullanın. Merkezi sinir sistemi ortaya çıkıncaya kadar yavaş yavaş manikür soyulmaya devam ediyor. </li><li> Dokular forseps ile yırtılarak larva geri kalanından merkezi sinir sistemine izole edin. Merkezi sinir sistemini bozmayacağı dikkatli kullanın. Kritik adım: merkezi sinir sistemi üzerinde çekmeyin! Yırtık bir ventral sinir kablosu (Şekil 2A) veya bozuk optik loblar (Şekil 2B ve 2B &#39;) ile hasarlı örnekleri atın. </li><li> Lamel tüm larvaları için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın. Için sağlıklı eksplante doku aktarınince diseksiyon aşaması için lamel orta ikinci (temiz) havuz. </li><li> Beyinden periferik dokuyu (örneğin, göz, kanat ve bacak diskler) temizlemek için diseksiyon pin araçlarını kullanın. Coverglass için bağ dokusu çivileme, istediği (beyin) ve istenmeyen doku arasındaki neşter kaydırın. Aynı anda testere gibi hareketlerle lamel neşter basarken hafifçe istenmeyen doku uzak kızdırmak için kanca kullanın. </li><li> Kritik adım: Her beyinden gelen tüm diskleri kaldırmak için yavaş yavaş ve bilinçli çalışın. Beyin morfolojisini rahatsız dikkatli kullanın. Sağlıklı bir beyin bozulmamış bir ventral sinir kablosu ve simetrik, yuvarlak optik lobu (Şekil 2C) sahip olacaktır. </li></ol> 3.. Canlı Görüntüleme Brain Eksplante Montaj <ol><li> (Şekil 2B) yukarı bakacak net film ile 50 mm gaz-geçirgen kültür çanak ters çevirin. T ortamı üzerine küçük bir damla (yaklaşık 30 ul) biriktirilmesi için şırıngayı basınızyemeğin o merkezi. </li><li> Çanak orta damlasına kadar izole edilmiş beyinleri, bir defada, aktarın. Optik lobu altında bir beyin kaldırsanız kanca aracını kullanın. Alternatif olarak, ventral sinir kablosu uzanan aksonları kavramak için forseps kullanabilir. </li><li> Orta damla 5-10 beyinleri toplayın. Birçoğu gibi orta damla dibine tek beyinleri itmek için kesme pim araçlarını kullanarak beyinleri daldırın menisküs (Şekil 2E) tuzak olacaktır. </li><li> Yansıması için NB&#39;ler (Şekil 3A) bağlı olarak beyin hizalamak için diseksiyon pin araçlarını kullanarak beyinlerini yönlendirin. Görüntü dorsal Onaylanmış, (membran boyunca) aşağı bakacak ventral sinir kablosu yerleştirin. Görüntü anterio-ventral NBs, (uzakta membran) yukarı bakacak ventral sinir kablosu ile beyinleri yerleştirin. Tüm ventral sinir kordonları xy düzlemi içinde aynı yöne işaret etmektedir, öyle ki beyin hizalayın. </li><li> Bir şırınga ya da plastik transferi p kullanipette gaz geçirgen zar üzerine 4 halokarbon (HC) yağ damlaları (yaklaşık 30 ul her) yerleştirmek için. Petrol her damla hacmi birbirine ve orta damla eşdeğer olmalıdır. Uzay yağı damla kültür ortamının damla etrafında bir lamel dört köşesine tekabül edecek şekilde. Tamamlandığında, beş damla (yağ dört damla ve merkezi orta biri damla) Batı-tarzı zar (Şekil 3B) beş yönleriyle benzer olacaktır. </li><li> Bu aynı zamanda tüm 5 damla vurur şekilde montajı üzerinde bir # 1.5 22 mm lamel indirin. Örneklerin arasında eşit bir basıncın korunması da bozulacak olasılığını azaltır. Yağ ve orta lamel ağırlığı altında dağıtmak üzere yaklaşık 3 dakika bekleyin. Bir ortam çapraz-benzeri şekil (Şekil 3C ve 3D) oluşturacaktır. </li><li> Kritik adım: ince kağıt fitil (Figu kullanarak fazla ortamı kaldırarak beyinlerinin yüzeyi üzerine lamel Alt) 3C yeniden. Diseksiyon kapsamında örnek izlerken bunu. Ortam çıkarılır olarak, lamel daha düşük olacaktır. Lamel beyinleri dokunduğunda durdurun. Aşırı-fitil bu doku bozulması ya da beyin patlamalara neden olacak gibi. </li><li> Görüntüleme dorsal Onaylanmış (Şekil 3E), 3.9 adıma taşıyın. Görüntüleme anterio-ventral Onaylanmış ise, lamel biraz ventral sinir kablosu ipuçları yönünde (forseps ile yavaşça onu dürtmek) taşınmalıdır. Bu görüntüleme (Şekil 3F) kolaylaştırmak için lamel ile doğrudan temas halinde beyin lobları getiren döndürmek için beyin neden olur. </li><li> Halokarbonlu bir yağ (Şekil 3D), az miktarda lamel çevreleyen ile odası kapatın. Lamel sızma aşırı yağ küçültülmüş ve bir doku ile uzak lekelenen edilmelidir. </li></ol> Central Brain neuroblasts 4. Canlı Görüntüleme Not: Bu çalışma için, bir Nikon Eclipse Ti dönen diskkonfokal mikroskop (ters mikroskop) canlı görüntüleme için kullanılan; Bizim kurulum detayları önceden 31 yayınlanmıştır. Alternatif olarak, numune, bir dik sistemi kullanılarak görüntülenebilir. <ol><li> Sadece monte beyinleri üzerinde lamel daldırma bir damla yağ ekleyin. Bu, numunenin doğrudan üstünde amaç merkezi yardımcı olacaktır. </li><li> Kritik adım: bir sahne kuluçka 25 ° C&#39;lik sabit bir sıcaklıkta beyinleri koruyun. Yavaşça aşama inkübatör içine monte edilmiş örnek pozisyon ve kapak ile odasını kapsamaktadır. </li><li> Optik lobların merkez ve medial alanlarda ikamet büyük, yuvarlak hücreler odaklanarak iletilen ışık kullanarak merkezi beyin Onaylanmış bulun; epi-floresan kullanmayın. Bu uygulama ile daha kolay olur. Bu, mümkün olduğu kadar hafif olan en az miktarda için örnek göstermek için çok önemlidir. Zarar zamanlı görüntüleme beyinleri israf etmeyin. </li><li> Bir kez yerinde, konfokal kullanarak hızlı çekimlerininUygun yeri ve derinliği belirler. Ilk 10-15 mikron derinlik sınırlayın. Gerektiği gibi ayarlayın ve başka bir test görüntü almak. <ol><li> İsteğe bağlı adım: hayır xy kayma olmadığından emin olmak için ventral sinir kablosu bir test film toplayın. Sürüklenme tespit edilirse, yerleşmek için numune için 15-30 dakika bekleyin. Sürüklenme 30 dakika razı değilse, yeni bir örnek hazırlamak. Binbaşı sürüklenme genellikle aşırı yağ ilave geri takip edilebilir, ya da yağ eşitsiz boyutu montaj sırasında düşer. </li></ol></li><li> Eksenel kayması (z-drift) ortadan kaldırmak için bir kızılötesi LED kullanan bir sürekli otomatik odaklama aygıtı kullanın. Alternatif olarak, elle odak düzlemi düzeltin. </li><li> Ilgi konusu bir NB tanımlanır, görüntüleme rejimi ile devam edin. Tüm canlı hücre görüntüleme, lazer ışık miktarı, maruziyet süresi, kamera binning, objektif büyütme, zaman ve / veya z-adım aralığı ile tüm ampirik eldeki soruyu cevaplamak için belirli bir deney için optimize edilmelidir. Amacı ışık baraj en aza indirmek içinyaş iken yine de yararlı veri toplama. Ek rehberlik için açıklamalara bakın. <ol><li> Resim z-ekseninde 1 mikron aralıklı 12-14 görüntüleri toplayarak NB tüm hacmi. Aynı NB bir veya birden fazla hücre döngüsü yakalamak için zaman çözünürlüğü ayarlayın. Genel bir kural olarak, tek bir hücre döngüsü görüntüleme ve birden fazla hücre döngüsü için 1-3 dakika için 10-30 saniye aralıklarla aralıkları kullanın. </li></ol></li><li> Kritik adım: örnek mitoz süresini izleyerek sağlıklı olduğunu onaylayın. Mitoz fazla 15 dakika sürer, başka bir beyin geçmek. Sağlıklı bir beyin mitoz birkaç tur geçiren görüş aynı alanda bulunan birçok Onaylanmış gösterecektir. Her bir hücre döngüsü nedeniyle ışık hasarına biraz daha uzun bir öncekinden daha olduğuna dikkat edin. </li><li> Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, inkübasyon odası sökmeye ve gaz geçirgen kültürleme yemekler ama her atın. % 95 etanol ile kültür çanak yüzeyi durulayın ve bir doku ile de silin. Iki kez daha tekrarlayın. </li&gt; </ol> Immünofloresans için Brain 5. Hazırlanması <ol><li> Takviye edilen ortam içinde yaklaşık 0.2 ml ihtiva eden 1.5 ml tüp içine 20 ya da daha fazla eksplante beynini toplayın. </li><li> Tüpten Ortamı çıkarın ve (% 0.3 Triton X-100 ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi, PBS) 0.5 ml PBSTx ile bir kez beyinleri yıkayın. Beyin sıvının tüm değişimleri arasında tüpün dibe olsun. Triton X-100, deterjan doku nüfuz edilebilir kılınması için kullanılmaktadır. Genellikle durulama en az 30 saniye sürer; beyin tüpün dibine yerleşmiş bir kere sadece PBSTx çıkarın. </li><li> PBSTx içinde seyreltilmiş% 9 elektron mikroskobu sınıf paraformaldehidin 0.5 ml çözelti değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nutation kuluçkalayın. </li><li> Tehlikeli atık yönetmeliklerine göre sabitleştirici bertaraf edin. </li><li> 15 dakika boyunca 0.5 ml PBSTx ile örnekleri yıkayın. Taze PBSTx iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> 0.5 ml PBT (PBS, 1 ile çözüm yerine% Bovine Serum Albumin (BSA) ve% 0.1 Tween-20). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nutation kuluçkalayın. Bu adım, blok dokuya antikorun spesifik olmayan bağlanma. </li><li> % 4 normal keçi serumu (NGS) ile desteklenmiş PBT içinde seyreltilmiş 0.5 ml birincil antikor ile çözüm değiştirin. 4 ° C de bir gece nutation ile inkübe </li><li> Seyreltilmiş primer antikor atın veya kaydedin. </li><li> 15 dakika boyunca 0.5 ml PBT ile örnekleri yıkayın. Taze PBT iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> 0.5 modifiye PBT ml (PBS,% 2 BSA,% 0.1 Tween-20 ve% 4 NGS) ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nutation kuluçkalayın. </li><li> Tadil edilmiş PBT ile seyreltilmiş 0.5 ml ikincil antikor ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca nutation kuluçkalayın. </li><li> (% 0.1 Tween-20 ile PBS) 0.5 ml PBST ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nutation kuluçkalayın. Taze PBST&#39;de iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın. </li></ol><ol><li> Dikkatlice slayt merkezinin soluna doğru sınırlayan damla bir cam slayt üzerinde bir damla olarak örnekleri aktarın. </li><li> Slaydın merkezine monte orta büyük bir düşüş (çapı yaklaşık 2 cm) (örneğin, Aqua-Poly/Mount) ilave edin. Sola doğru olan PBST havuz kaçının. </li><li> Montaj orta havuzuna PBST havuzundan beyinleri aktarmak için forseps kullanın. Beyinleri üstüne doğrudan montaj orta ekleyerek kendi yönünü bozabilir ve kaçınılmalıdır. </li><li> , Bir ışık mikroskobu altında, yukarı bakacak görüntüsü olacak yüzü montaj ortamı içinde örnekleri düzenlemek. </li><li> Işık mikroskobu altında sürgü ile, yavaş yavaş örneklerin üstünde bir # 1,5 daha düşük bir cam lamel. İsteğe bağlı adım: hafifçe lamel iterek küçük hava kabarcıklarını yerinden oynatın. </li><li> Montaj orta slaytlar yalan, bir gecede birkaç saat veya polimerize düz, ışık ver, oda sıcaklığında, koruma. </li><li> Slaytlar bir sonraki gün görüntü verilen ya da önceden görüntüleme için saklanabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Truman, J. W., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+patterns+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+for+identified+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells+in+the+Drosophila+central+nervous+system.">Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system.</a> Development. 116, 855-863 (1992).</li><li>Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+asymmetry+for+proper+fitness,+function,+and+fate.">Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate.</a> Chromosome research. 21, 271-286 (2013).</li><li>Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+neural+stem+cell+proliferation+by+intermediate+progenitor+cells+in+Drosophila+brain+development.">Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development.</a> Neural development. 3, 5 (2008).</li><li>Bowman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressors+Brat+and+Numb+regulate+transit-amplifying+neuroblast+lineages+in+Drosophila.">The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila.</a> Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).</li><li>Boone, J. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+type+II+neuroblast+lineages+containing+transit+amplifying+ganglion+mother+cells.">Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells.</a> Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li><li>Savoian, M. S., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+primary+cultures+of+Drosophila+melanogaster+larval+neuroblasts.">Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts.</a> Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).</li><li>Fleming, S. L., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flattening+Drosophila+cells+for+high-resolution+light+microscopic+studies+of+mitosis+in+vitro.">Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).</li><li>Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Mad2+to+the+kinetochore+requires+the+Rod/Zw10+complex.">Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex.</a> Current biology. 15, 856-861 (2005).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li><li>Lucas, E. P., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+the+proper+connection+between+the+centrioles+and+the+pericentriolar+matrix+requires+Drosophila+centrosomin.">Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin.</a> J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+amplification+can+initiate+tumorigenesis+in+flies.">Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies.</a> Cell. 133, 1032-1042 (2008).</li><li>Conduit, P. T., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnn+dynamics+drive+centrosome+size+asymmetry+to+ensure+daughter+centriole+retention+in+Drosophila+neuroblasts.">Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome research. 6, 533-549 (1998).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).</li><li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome.">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat. Commun. 2, 243 (2011).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Live+Cell+Imaging+and+Automated+4D+Analysis+of+Drosophila+Neuroblast+Lineages.">Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells+by+transgenic+RNAi.">Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi.</a> Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Siegrist, S. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+cues+orient+the+cell+division+axis+in+Drosophila+embryonic+neuroblasts.">Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts.</a> Development. 133, 529-536 (2006).</li><li>Broadus, J., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+cues,+intrinsic+cues+and+microfilaments+regulate+asymmetric+protein+localization+in+Drosophila+neuroblasts.">Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).</li><li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila:+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms.">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li><li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lis1/dynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li><li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+the+model+to+the+test:+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity,+axon+outgrowth,+and+axon+targeting.">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li><li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Canlı hücre görüntüleme kök hücre ACD, hücre soylarının farklılaşmasını düzenleyen mekanizmaları incelemek için kullanılan çok değerli bir yaklaşım ve kompleks dokuların morfolojisi olan. Araştırma grupları tarihsel NB ACD görselleştirmek için çeşitli teknikler istihdam olmasına rağmen, bu yaklaşımlar genellikle öncelikle beyin dokusu bozulmadan sola veya ayrışmış olup olmadığını açısından farklılık iki kategoride toplanabilir. Görüntüleme ...

Kök hücreleri erken gelişim sırasında hücresel çeşitlilik oluşturmak ve yetişkin dokularda hasar gören hücrelerin yerine bir farklılaşma denge ve kendini yenileme korumak. Bu homeostazının düzenlenmesi kaybı ve zararlı doku dejenerasyonu ya da tümör oluşumu ile sonuçlanabilir kök hücre popülasyonunun aşırı genişlemesini hem de önler. Nöroblastomun (Onaylanmış) Drosophila merkezi sinir sistemi (Şekil 1A) embriyonik aşamalarında 1, 2 sırasında o ilk formu çok çalışılan nöral kök hücrelerdir. Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Onaylanmış iki eşitsiz kaderde hücreleri üretmek için asimetrik hücre bölünmesi (ACD) tekrarlanan mermi tabi. ACD sentrozom, çoğu hücre 3&#39;ün mikrotübül organizasyon merkezi olarak hareket olmayan zar organeller tarafından yönlendirilmektedir. Mitoz sırasında NB centrosomes düzenlemek ve apikal-bazal polar boyunca bipolar mitotik iğ yönlendirmekSığ ekseni. Bölünmesi NB ayrılması üzerine, kök hücre kaderini belirlemek apikal kader belirleyici ve farklılaşma belirtmek bazal kader belirleyici, eşitsiz kızı hücrelere ayrılmış olan. Larva orta beyinde, Onaylanmış iki tür bunların sayısı, konumu, transkripsiyon faktörü ifadesi ve hücre soyu (Şekil 1A) 4-6 ile ayırt edilebilir. I Onaylanmış en bol olan yazın ve yaklaşık 90 tanesi beyin 7 her optik lob ön ve arka tarafı doldurmak. Bu Onaylanmış transkripsiyon faktörü asense (Ase) ifade ve karakteristik bir kendini yenileyen NB bölmek ve bir küçük ganglion anne hücre (GMC; Şekil 1B). Her GMC iki nöron veya glia (Şekil 1B) oluşturmak için tek bir terminal bölümü uğrar. Buna karşılık, her bir optik lobun arka tarafını doldurmak sekiz Tip II NBs Ase ifadesini 5. yoksundur. Onlar ACD geçmesibir kendini yenileyen NB ve bir ara nöral progenitör (INP) üretmek. INP da, asimetrik 3-5 kez böler. InP rejenerasyonu ve tek GMC 4 üretiminde Bu bölümler bir sonuç her biri. Toplu olarak, özel NB kimliği ve GMC doğum zamansal sırası, yetişkin merkezi sinir sisteminin nöronal şaşırtıcı çeşitliliğine yol açar. NB ACD temelini hücre biyolojisi çok canlı hücre görüntüleme tekniklerinin kullanılması ile geliştirilmiştir Anlamak. Görüntü canlı NB&#39;ler için araştırmacılar tarafından kullanılan yayınlanan protokolleri yaygın olarak değişebilir. Genel olarak, bununla birlikte, bu yöntemler, larva beyin değişmeden kalır ya da mekanik olarak ayrışmış olup olmadığını ayırt iki genel kategoride toplanabilir. Her iki teknik araştırmacının uygulamaya bağlı olarak, farklı avantaj ve dezavantajları var. Canlı NB hücre Divi ortaya Erken raporlarları larva beyin manuel ayrışma bir dereceye içerir. Bu protokoller detay 8 bulaşıyor ya da cam lamelleri Onaylanmış kısa vadeli birincil kültürleri büyümek için ayrı 9 beyin alay. Görüntüleme geliştirmek için, yuvarlak Onaylanmış genellikle cam slaytlar 8 veya agaroz pedleri 9 ile ya lamelleri üzerinde düzleştirilir. Düzleştirilmiş hücreler optik geliştirilmiş olmasına rağmen, bu teknikler çoğu zaman bölünme karık gerileme ve birden çok kez bölmek için yetersizlik de dahil olmak üzere, NB mitotik kusurlarına yol açar. Bu nedenle, manuel Ayrışma ve larva beyin dokusunun fiziksel bozulmasını hem içeren protokolleri genellikle sadece çok kısa vadeli (yani., Bir hücre döngü ya da daha az) uygulamaları için uygundur. Aynı şekilde, yarı silinmesine veya tamamen cam slaytlar ve lamelleri arasındaki sağlam beyinleri düzleştirme birinin bir, yaklaşık 30 dakikalık bir süre için 10, belirli bir örnek görüntüleme harcayabilir zamanını sınırlar. Bu sınırlama, thi rağmenyaklaşımı başarıyla 11-14 kullanılmaktadır. Görüntü canlı için son çabalar NBs limiti izole hücrelerin fiziksel bozulma ayrışmış. Bu teknikler, birden fazla hücre bölünmesi devir için hücre kültürlerinin sürdürmek için gerekli olan uygulamalar için özellikle yararlıdır. Örneğin, el ile ayrışmış beyinlerinden alınmış dağılmış hücrelerden, kısmen uzun süreli görüntüleme 16 fibrinojen ve trombin 15 karışımından yapılan bir pıhtı gömülü olabilir. Seçenek olarak ise, eksplante beyin kimyasal olarak, enzim bir sonraki el ile bir pipet ucu ile tekrar geçirilerek kesintiye kolajenaz, ve daha sonra poli-L-lisin-kaplamalı cam alt yemekler 17, 18, ​​kaplama ile ayrıştırılmış ilk olabilir. Fibrinojen ya da poli-L-lisin ya cam yemekleri Kaplama önemli fiziksel bozulma olmadan mümkün olduğu lamel onları yakın getirerek, yuvarlak hücrelerin yayılmasını eki ve hafif teşvik etmektedir. Additi yılında, bu yöntemler, hali hazırda pertürbasyon farmakolojik deneyler 18 için değiş tokuş edilebilir bir ortam içinde kültür edilmesini Onaylanmış içerir. Genel olarak, doğrudan kaplama NBs uzun vadeli görüntüleme yetenekleri ödün vermeden görüntüleme optik geliştirir dağıldılar. Son zamanlarda, ayrışmış Onaylanmış uzun vadeli kültürlemenin açıklayan bir protokol 19 ayrıntılı olmuştur. Ancak, bu yaklaşım sınırlamaları olmadan değildir. Canlı ayrışmış Onaylanmış görüntüleme için çeşitli uyarılar vardır. Dağılmış bir hücre alanında, örneğin, uzamsal olarak sağlam bir beyin 1 düzenlenmesiyle belirli NB soy tespit etmek zordur. Aynı şekilde, Tip II ayrışmış doku içinde Onaylanmış karşı Tip I ayırt örneğin worniu-GAL4, asense Gal80-20 gibi soy ajanları ya da alt tip spesifik transgenlerin, ekspresyonuna olmadan da zordur. Bu transgenler, bazı uygulamalar için oldukça yararlı olsa da, bu eski transgenler için araştırmacılar sınırı yokturUAS güçlendirici elemanın 21 kontrolünde preslenmiş ve daha karmaşık genetik düzenleri gerektirir. Onaylanmış mekansal ya da zamansal geliştirilmesiyle ilgili çalışmalar, bu nedenle, bir sağlam doku bağlamında in vivo görüntüleme gerektirir. Ayrıca, ayrışmış embriyonik Onaylanmış çalışmaları önemli polarite interfaz lokalizasyonu 22, 23, belirleyicilerinin için bitişik hücrelerin fiziksel temas kritik olduğunu gösterir. Bu çalışmalar tamamen izole NBs artık değişmez mitotik iğ ekseni korumak göstermektedir. Bunun yerine, bu hücreler nedeniyle belki de apikal centrosome konumlandırma 22 kaybı daha randomize mili ekseni ve ardışık GMC tomurcukları arasındaki ayrılık, geniş açıları gösterilecek. Larva NB&#39;ler ve komşu hücreler arasındaki ilişki yaygın olarak incelenmiştir olmasına rağmen, bu larva kök hücre mikroçevresinin hücre polarite veya diğer değindiği olabileceğini dikkate değerdavranışları. Larva Onaylanmış fizyolojik içeriği muhafaza edilmesi için, tüm beyinlerinden biz görüntü ACD. Görüntüleme ayrışmış NB&#39;ler ile ilişkili doğal sınırlamalar dikkate alındığında, bizim laboratuvar ve diğerleri bütün larva beyinlerinden NB KHA görüntü ardışık tur protokolleri kurduk. Görüntü bozulmadan beyin teknikler genellikle doku bozulmasını veya zarar görmesini önlemek ve gaz değişimi için izin vermek için esnek bir membran ile kültür odasının bir tarafında cam sert yüzey değiştirin. Bazı yöntemler böcek kültür ortamı, serum ve on larva 24 izole edilmiş organlarla yağ, askorbik asit içeren bir karışım içerisinde eksplante beyinleri montaj içerir. Bu NB hücre bölünmesini teşvik 25 bilinen bir mitojen salgılayan için izole edilmiş yağ gövdeleri eklenir. Bu protokol üzerinde 3 saat için doku bütünlüğünü koruyan ve uzun süreli görüntüleme 24, 26-28 için uygun, bu nedenle,. Son zamanlarda, boylam açıklayan bir protokolaskorbik asit, serum ve yağ organlar mevcudiyetinde sağlam larva beyinlerin g İÇİ görüntüleme 29, ayrıntılı edilmiştir. Doku maruz ne de hareketsizleştirilir için önemlisi, bu yaklaşım kültürleme ortam değiştirilir uygulamalar için daha az faydalı olan (örneğin, vb, ilaç araştırmaları, imüno-,.). Bizim laboratuvar uzun vadeli görüntüleme 30, 31 canlı larva beyinlerinin bütün montaj hazırlanmasını kolaylaştırmıştır. Başkaları üzerinde bizim protokolüne ana avantajı basitliği: bizim gözlemler NB KHA görüntü ardışık tur için gerekli katkı maddeleri ne serum, askorbik asit, insülin, ne de yağ organları gösterir. İnsülin gibi katkı maddeleri, kök hücre bölünmesi 32 ve Drosophila yumurtalık 33 toplu hücre göçü uzun görüntüleme için yararlı olmuştur, ancak eden görüntüleme ortamı sta basit bir karışımından oluşur, onlar, NB ACD için önemsiz görünmektedirndard böcek hücre kültürü ortamı bulaşmasını önlemek için antibiyotik-antimikotik ile takviye edilmiştir. Yeniden gaz-geçirgen veya cam alt kültür yemekleri kullanımı sayesinde, biz ardışık NB acds birkaç tur sürdürmek mümkün olmuştur. Aynı eksplante örnekler hali hazırda, bağışıklık ve sabit dokusu ile diğer işlemler için de kullanılabilir. Bu protokol, biz detay sağlam larva beyinlerinin diseksiyonu, yanı sıra canlı ve sabit hem de analiz için beyin hazırlanması.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="851">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td style="width:167px;">A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Schneider&#39;s S2 Medium</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td>A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider&#39;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Glass coverslips, #1.5 22X22 mm</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Minutien dissecting pins</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Dissecting needle/probe with plastic handle</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe filter, 0.22 mm pore size</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe 5 mL&#160;</td>
			<td style="width:185px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">plastic transfer pipet</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S30467-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:380px;">paraformaldehyde, 32% EM-grade</td>
			<td style="width:185px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714</td>
			<td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">DAPI (4&#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18606-20</td>
			<td>A water-soluble mounting medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Kök hücreler, eşitsiz kader potansiyelli iki döl hücreleri üretmek için asimetrik bölün. Asimetrik kök hücre bölünmesi çalışmanın sağlam bir alan olmuştur yöneten mekanizmaların anlaşılması, geliştirilmesi ve hastalık onların alaka önüne alındığında. Bunlar genetik uysal ve bir kez, her saat hücre bölünmesinin ardışık mermi geçmesi için, Drosophila merkezi sinir sistemi veya neuroblasts kök hücreler, kök hücre bölünme çalışma için vazgeçilmez modellerdir. Yaklaşık 100 nöral kök hücre canlı görüntüleme çalışmaları için mikroskopi Bu model sistemi, özellikle faydalı bir hale getirir, her iki larva beyin lob her yüzeyine yakın olarak yerleştirilir. Bu çalışmada, yaygın kök hücre bölünmeleri görselleştirmek için kullanılan çeşitli yaklaşımlar gözden ve biz göreceli avantaj ve bozulmamış beyin dokularında karşı ayrışmış çalıştırırız bu tekniklerin dezavantajlarını ele. Biz de detay bizim simplified protokol canlı hücre görüntüleme için Üçüncü dönem larva ve sabit analiz uygulamaları bütün beyinleri eksplantasyona için kullanılır.

Canlı görüntüleme, NB ACD düzenleyen mekanizmalar bir dizi açıklamıştır. Önceki görüntü elde etme için, bu uygun görüntüleme koşulları belirlemek için gereklidir. Bu canlı hücre görüntüleme süresi ile kare yakalama hızını dengelemek için gereklidir. Ince hücre analizi için, örneğin, geçici artış ve optik çözünürlük gerekli olabilir. Tek bir NB hücre döngüsü (Şekil 4A) imgelerken, görüntüler yakalanır hangi hızı fotohasar tanıtan olmadan artabilir. T...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts at JoVE.com

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

14.7K Görüntüleme.  National Institutes of Health.  Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir. 

Video: Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral line-widths and allows high-resolution spectra to be obtained from extracts, intact cells, cell cultures, and more importantly intact tissue to investigate relationships between metabolites and cellular processes. In vivo HRMAS 1H-MRS studies have yet to be reported in the live fruit fly Drosophila melanogaster. Drosophila, as a simpler genetic organism, allows the multiple biological functions and various evolutionarily conserved signaling pathways to be examined at the whole organism level and it is a useful model for investigating genetics and physiology. To this end, we developed and implemented an in vivo HRMAS 1H-MRS method to investigate live Drosophila at 14.1 T. Here, we outline an HRMAS 1H-MRS protocol for the molecular characterization of Drosophila with a conventional MR spectrometer equipped with an HRMAS probe. This technique is a novel, in vivo, non-destructive Drosophila metabolite measurement approach, which enables the identification of disease biomarkers and thus may contribute to novel therapeutic development.

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

This technique enables the use of high-resolution magic angle spinning proton MR spectroscopy (HRMAS 1H-MRS) for molecular characterization of live Drosophila melanogaster with a conventional 14.1 tesla spectrometer equipped with an HRMAS probe.

Canlı Manyetik Rezonans Spektroskopisi Drosophila melanogaster Magic Açısı İplik kullanarak

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Nörobilim

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Doğrusal Agaroz Kanallar kullanarak Okuyacak<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Tarama Davranış

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.