Biz sensörleri oyma ifade bitki hat sağlanması için video hazırlama ve Bhavna Chaudhuri yardım için Philipp Denninger teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (MCB 1.021.677), WBF, Ulusal Sağlık Enstitüleri Enerji Departmanı (DE-FG02-04ER15542) ve SRQGG ile Howard Hughes Tıp Enstitüsü&#39;nden hibeleri tarafından desteklenen bir EMBO Uzun tarafından desteklenmiştir dostluk vadeli. MM Alexander von Humboldt Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Not: steril koşullar altında tüm adımları hazırlık adımları gerçekleştirin. 1. Tohum Çimlenmesi Plastik Konileri hazırlanması <ol><li> 5 mm arasında bir kalınlığa kadar% 1 agar içeren büyüme medyumu ile bir 10 santimetrelik bir petri tabağına doldurun. Biz Hoagland orta 4 değiştirilmiş bir buçuk gücü, ancak orta kompozisyon bireysel deneysel gereksinimlerine uygun olarak seçilmelidir. </li><li> Orta halen sıvı iken, Petri gelen orta 5 ul ile 10 ul pipet uçları doldurmak için bir çok kanallı pipet kullanın. </li><li> Orta katı kadar daha sonra dik katı büyüme ortamı içeren Petri içine 4 mm uzunluğunda plastik huni ve yere kesip, pipet ucu kutusu dolu ipuçları saklayın. </li></ol> 2. Tohum Çimlenmesi ve Fide Büyümesi <ol><li> 5 dk için% 5 NaOCI tohum sterilize yüzey, steril su ile üç kez yıkanır daha sonra, orta-dolu konik her birinin üstünde tek bir tohum yerleştirmeks. </li><li> 4 at Micropore bandı (3M) ve mağaza ile çanak Seal ° C çimlenme senkronize etmek. </li><li> Üç gün sonra, çimlenme başlatmak için bir büyüme kabine plakaları aktarın. Bizim büyüme koşulları 16h yüksek light/8h karanlık döngüsü az 23 ° C (100 μE m -2 s -1 Işık yoğunluğu) vardır. </li><li> 5 ve 7 gün çimlenme sonrası arasında, fidan RootChip transfer için hazır olmalıdır. Bu zamanda, kök uçları plastik koni alt çıkış yakın olması gerekir. Bir mikroskop altında fide sağlık, kök uzunluğu ve, varsa, bir floresan işaretleyici ifade edin. </li><li> Yonga üzerine transfer için tek tek fidan işaretleyin. Durumda birinde on kadar fidan seçin aktarımı sırasında zarar görmüş. </li></ol> 3. RootChip üzerine Fidan Transferi <ol><li> Uzun vadeli deneyler için RootChip sterilize edilmesi, sarmakkağıt mendil, bir cam petri yer ve otoklavda cihaz. </li><li> RootChip soğuduktan sonra, sıvı besi ile örtün. RootChip tamamen daldırılmış gerekir, ancak sıvı seviyesini RootChip yüzeyi üzerinde en fazla 3 mm arasında olmalıdır. </li><li> 20 ul pipet ile, orta ile gözlem odasına doldurmak için kök giriş ve çıkış haznesi ile orta çekin. </li><li> Tak plastik konileri RootChip girişleri içine adım 2.5 seçili. Konileri koylarda rahatça oturmalıdır. RootChip optik cam ince bir tabaka üzerine monte edildiğinden, çip çok fazla baskı uygulamayın. </li><li> Sıvı bir ortamda gece RootChip inkübe edin. Kayan önlemek için, yonga üzerine iki cam slaytlar yerleştirin. Bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve çanak kapatın. </li><li> Bir manyetik karıştırıcı ile montaj aktarın ve hafifçe orta ajitasyon. </li><li> RootChip Kullanıcı girişleri li normal cihaza 30 ° açıyla kanallar kesişirkanalları (Şekil 1A) içine kök büyümesi litate. Daha fazla istenen yönde büyümeyi desteklemek için, çıkışlarının çip ters tarafında Petri altında bir cam slayt koyarak biraz montaj eğin. </li><li> Bir zamanlayıcı bağlı: aydınlık / karanlık döngüsü korumak için, bir halka lamba (100 μE m -2 s -1 Işık yoğunluğu) ile fide aydınlatır. </li></ol> 4. Taşıyıcının RootChip Bağlanması <ol><li> Ertesi gün, sıvı besi (Şekil 1B) ile yapışmalı, basınçlandırılabilir şişe doldurun. </li><li> Yonga taşıyıcı ters çevirin ve düz bir yüzeye yerleştirin. Sıvı ortamdan RootChip çıkarın ve çip taşıyıcı alt diyafram içine PDMS tarafı aşağı yerleştirin. Orient çip, böylece kontrol tabakası içeren girişler yan taşıyıcı yan duvarda basınç borusu bağlayıcı yan karşı karşıyadır. </li><li> Kapağı cam kurulayınhafifçe kağıt mendil ile blotting tarafından çip alt. Bant ve doğru montaj ile tüm taşıyıcı RootChip sabitleyin. </li><li> Boru bağlantı 5 cm uzunluğunda parçalar halinde esnek plastik microbore boru (Tygon, 0.20 &quot;ID x 0,060&quot; OD) kesme ve paslanmaz çelik borular microbore (New England Küçük Tüp, 0.025 &quot;OD x 0.013&quot; ID x 0.75 &quot;bağlayarak yapılır uzunluğunda). çip üzerindeki ilgili kontrol katmanı girişine, bir şırınga ve fişi her tüp konnektörü kullanılarak su ile boru bağlantı doldurun. su daha sonra kontrol katmanı kanallar dolduracaktır ve mikromekanik vanaları için basınç iletmek için kullanılır. </li><li> Medya / çözüm şişe (ler) içine hatlarının uçlarından takın. Hava bir şırınga ile çözüm flakonuna basınç uygulayın. Çözüm flakon içinde artan hava basıncı çizgileri içine sıvı zorlar. </li></ol> 5.. Mikroskop de RootChip Montaj <ol><li> Microsc üzerine yerleştirmek taşıyıcıope aşamasında. Odada titreşimleri nedeniyle deney boyunca değişen montaj olasılığını azaltmak için, taşıyıcı sahne ucun çentikler içine tam olarak oturmalıdır. </li><li> Çip ile çipi vanalar ve orta akışını hava basıncı tarafından kontrol edilir. Düzenleyicileri ile iki çizgi, bir ana basınç hattının kapalı dallı edilmektedir - one kanallardan orta akışını kontrol etmek için kullanılır ve diğer kontrol tabakasının itme-up valf harekete solenoid vantuzlardan bağlanmıştır. Selenoid vana vana USB denetleyicisi (Rafael Gomez-Sjöberg, Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı tarafından geliştirilen) ile bilgisayardan işletilmektedir. Çip bağlamadan önce hem basınç regülatörleri kapatın. </li><li> Derlemenin içinde nemi yüksek tutmak için taşıyıcı rezervuarlarının su birkaç ml ekleyin. Bu adım kurumasını bitkileri korumak için uzun süre deney boyunca tekrarlanmalıdır. T en aza indirmek için hacim düşük tutunmikroskop dökülmüş olabilir sıvı o miktarı. Uzun vadeli deneyler için, çip çıkışlarından çıkış microbore boru (adım 4.4) ile rezervuar için çip çıkışları bağlayarak taşıyıcının rezervuarların içine yönlendirilmesini edilebilir. Alternatif olarak, yonga yüzeyi üzerinde biriken çıkış pipet ile toplanabilir. </li><li> Levha koruyucular gelen şeffaf plastik (C-Line) kare yaprak hazırlayın. Toplama yüksek nem korumak için çift taraflı bant ile taşıyıcıya şeffaf plastik Fix. </li><li> Çip üzerinden halka ışık yerleştirin ve aydınlık / karanlık döngüsü korumak. Halka ışık direkt aydınlatma resim koleksiyonu engel olacak şekilde, floresan işaretleri kullanan herhangi bir deney başlamadan önce kapatılmalıdır. </li></ol> 6. LabView Arayüzü kullanarak RootChip İşletim LabView yazılım platformu için RootChip denetleyici arayüzü yapabilirsinizweb sitemizden indirilebilir <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> Çip üzerinde vanalar selenoid hava vanaları açarak bu durumda, kontrol katmanı basınç uygulanarak kapatılır. Denetleyici arabirimi vana sayısı aşağıdaki butona tıklayarak vanaları harekete izin verir. Parlak yeşil bir çip vanası (Şekil 2B) basınç ve kapama uygulamaları gösterir. Basınç regülatörleri açmadan önce kontrol arayüzü her üç çözüm emme supabı etkinleştirin. Not: kontrol arayüzü sistemin durumunun izlenmesi sağlayan bir geri besleme döngüsü sahiptir. Bu özellik kontrol arayüzü &quot;Readback&quot; butonuna basarak aktif edilebilir. </li><li> Kontrol katmanı için basınç regülatörü açın ve başlangıçta 15 psi ayarlayın, ardından akışı katman için düzenleyici açın ve başlangıçta 5 psi olarak ayarlayın. Bağımlıarzu edilen akış oranı rı, daha sonra basınç ayarlanabilir. </li><li> Orta odaları temizlemek için tercih edilen besi için giriş vanasını açın. </li><li> Mikroskop altında akış yolları kontrol edin. Tipik olarak, hava akışı kanal içinde tutulur ve çıkarılması gerekir. Ayrıca, kontrol tabakasının kanalları hala tüp konnektörleri (çıkmaz dolum) gelen su ile zorla ve değiştirilmesi gerekir hava içerir. Her iki işlem tüm hava PDMS içine kanalları (&quot;gaz giderme&quot;) zorla kadar sekiz odalarına her birkaç kez (5 psi) püskürtülerek elde edilir. Not: denetleyici arabirimi deneyler otomatikleştirmek için programlanabilir. Bu tür rutinleri gazdan arındırmak çip da kullanılabilir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar RootChip asal amacı, entegrasyon yüksek seviyesi ile tek bir cihazda bir görüntüleme platformu ve perfüzyon sisteminde birleştirmektir. Manipülasyonu göstermek içinköklerin mikroçevresinin biz koyu gıda boyası (hidroponik orta 1:4 dilüsyon) ile odaları temizlendi ve odaların içinde sıvı değişimi ölçülür. 5 psi önerilen basınç anda yaklaşık 1.5 ul / dk (Şekil 3) hesaplanan bir akış hızında 10 saniye içinde tam bir değişim ölçülür. Biz de bu durumda karanlıkta yetiştirilen ve harici bir enerji kaynağı (Şekil 4) olarak 10 mM glukoz ile birlikte olarak, fidelerin kök gelişimi gözlenmiştir. Gibi hafif ve orta bileşimi olarak büyümeyi koşullarına bağlı olarak, bitkiler üç gün için RootChip kadar görülebilir. RootChip Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) 5-7 dayalı genetik olarak kodlanmış nanosensors ifade kökleri hücre içi glukoz ve galaktoz düzeyleri izlemek için kullanılır olmuştur. Yonga Roots glukoz veya galaktoz solüsyon kare darbeleri ile perfüze edildi ( <strong&gt; Şekil 5). Şekerler hücre içi seviyelerini izlenmiş ve burada gösterilen donör ECFP yoğunluğuna alıcı fluorofor Citrine yoğunluğu bir oranı olarak ifade edilir. Oranında artış şeker birikimi gösterir. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. RootChip ilkesi. <ol class="ualpha"><li> RootChip köklerin büyüme ve görüntüleme için sekiz gözlem odaları bulunmaktadır. Tohumlar ilk plastik konileri filizlenmeye - plastik pipet uçları imal - hangi katı ortam ile doldurulur. Kök ucu ortam içinden geçerek sıvı ortamın büyür ve sürekli bir akış odası içinde sabit tutar koşulları haznesi ulaşır. Mikromekanik vanalar (kırmızı) akışını kontrol. Çip bir optik cam kapak üzerine monte edilmiştir. Ölçeksizdir çizimi. (Grossmann ve ark., 2011 Bitki Hücre izniyle uyarlanmıştır.) </li><li> Schdiyafram (kırmızı) ile bir basınçlandırılabilir çözeltisi şişeden eme. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Bağlama ve RootChip montaj. <ol class="ualpha"><li> Tam olarak bağlı RootChip ve taşıyıcı üstten görünümü bir inverted mikroskop üzerine monte edilmiş. </li><li> Programı valving sistemi ve kontrol arabirimi gösteren. Tek bir odaya sıvı akışı yönlendirmek için bir ayar vanası için bir örnek gösterilmiştir. Iken vanalar 4 tek vanalar, gruplar halinde 3 fiiller sonucu vana 0 olarak 8 fiiller sonucu. Bu sistem ile tek bir vana odasının bir kombinasyonu aktive tarafından ele alınabilir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Gözlem ch çözümleri değişimiamberleri. boya çözeltisi kullanılarak bir gözlem odasında sıvı alışverişi Görselleştirilmesi. Görüntü parlak alan ve boya sinyalin yanlış renkli yoğunlukta bir kaplama olduğunu. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. On-chip kök büyümesi. Gözlem bir floresan ifade eden bir tek büyüyen kök 20h boyunca glikoz / galaktoz için nanosensor FRET. Zaman formatı: ss: dd; ölçek çubuğu: 100 mikron. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5. Ile ölçülmesi hücre içi şeker düzeyleri nanosensors FRET. <ol class="ualpha"><li> Sensörünün miktarı kök ucu içinde sitrin yoğunluğu (sol) olarak gösterilir. Hücre içi arasında tepki glikoz veya galaktoz çözeltisinin uygulanması için nanosensor oranlı metrik görüntüler olarak gösterilir FRET. (Grossmann ve ark izniyle uyarlanmıştır., 2011 Plant Hücre) Ölçek çubuğu:. 100 mikron. </li><li> Takip üç tekrarlanan kare glikoz bakliyat (yeşil) ve galaktoz (kırmızı) bir tepki olarak oran değişiklikleri FRET. </li></ol>

<ol>
	<li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors:+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells.">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li><li>Loqu&#233;, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wir&#233;n, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake.">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li><li>Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+maltose+uptake+in+living+yeast+cells+by+fluorescent+nanosensors.">Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li><li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants.">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li><li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip.">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+Compatibility+of+Poly(dimethylsiloxane)-Based+Microfluidic+Devices.">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Klasik büyüme yöntemleri üzerinde RootChip başlıca avantajları mikroskopi için minimal invaziv hazırlanması, geri dönüşümlü ve tekrar tekrar kök çevrelerini değiştirme yeteneği ve birkaç gün bir süre içinde gelişimsel olarak yetkili ve fizyolojik sağlıklı doku sürekli gözetim için, kapasitesi vardır. Daha önce, fide jölelenmişti medya dikey yetiştiği ve sadece bir kez 8 de tek kök ölçüm izin deney, hemen önce bir perfüzyon sistemine aktarılabilir. Mikroakışkan araçları Arabidopsis için değil, düşük entegrasyon seviyesi 9 veya perfüzyon kontrolü 10 görülmemiştir. RootChip hassas akış rehberlik yoluyla deneyler otomatikleştirmek yeteneği ile bütünleşme yüksek düzeyde birleştirir. Tüm mikroakışkan cihazlar 11 karakteristik özelliği, bu platform, diğer bir avantajı, bu sıvı, sadece minimum miktarda gerekli somun ile kök talep edilen birHatta birkaç gün süren deneyler için rients. RootChip şu anda tek kullanımlık bir cihaz olarak tasarlanmış, ancak fişleri üretim maliyetleri düşük olduğundan, tüketilen reaktif küçük miktarlarda hala çok düşük maliyetli yonga yapar. Fide sağlığı garanti etmek için alınması gereken birkaç önemli adım vardır: Plastik koni içinde hacim havaya maruz kaldığında kurumaya başlayacak sadece 3-4 ul vardır. Dolayısıyla konileri hızlı yonga üzerine aktarılır ve kökler yeterli su ile tedarik edecek gözlem odaları, ulaşana kadar nem oranının yüksek tutulması önemlidir. 4,2-4,5 adımlar hızlı ve fide kurumasını önlemek için kesintisiz yapılmalıdır. Adımlar 3,5-3,8 kökleri gözlem odalarına büyümeye sırasında sıvı ortamda çip kuluçka açıklar. Bu adım c içine çip monte edilerek atlanabilirarrier hemen ve büyüme ortamı ile sürekli perfüzyon başlıyor. Bazı avantajları vardır Ancak, biz, gece büyüme ortamında iliklerine tavsiye: filizlere gözlem odasına büyüdükçe kurumuş olma ihtimali daha azdır bu yüzden nemli bir ortam oluşturur 1); 2) çip sıvı içinde kalıyor, bu yüzden Gaz alma (adım 6.4) daha hızlı olacaktır. Düşük solüt konsantrasyonu ile medya kullanmak önemlidir. Daha konsantre solüsyonlar çip birkaç gün içinde kullanıldığında, özellikle çökelmesi ve kanalları tıkayabilir. Cihaz, hava basıncı hattına bağlı sonra, orta akışı vanalar hidrolik basınç değiştirerek kontrol edilir. Mikromekanik vanalar doğru kapatılması sağlamak için, akış basıncı yaklaşık üç kat daha fazla kontrol basıncı seçmek önemlidir. Sıvı kök girişlerinin basılmış olacaktır gibi akış basıncı 15 psi geçmemelidir. Yüksek basınç may da çip kullanılamaz hale getirmektedir çip, bir delaminasyon neden olur. RootChip bir sınırlandırma PDMS gözenekli ve hidrofobik olmasıdır. Malzeme sulu çözeltiler pratik olarak eylemsiz iken, organik bileşikler 12 absorbe edebilir. Bu organik bileşikler, bu bileşiğin besleme girişinde durduruldu da malzemenin akabilir gibi çözeltilerin hızlı bir değişim ile karışabilir. Porozite nedeniyle, organik çözücüler kullanılarak PDMS 12 şişmesine neden olabilir. Biz ürün bitkilerinin kökleri ile RootChip optimize ve örneğin, kendi programını genişletmek için devam etmektedir. Biz tedavi ve gözlem için kök erişimi iyileştirerek, RootChip gibi mikroakışkan araçları root araştırma yeni ufuklar açacaktır inanıyorum.

<table border="1"><tbody><tr><td> Öğeler </td><td> Kaynak </td><td> Bilgi </td></tr><tr><td> Yonga taşıyıcı, yazılım ve diğer bilgileri. </td><td> Carnegie Enstitüsü - DPB </td><td> Taşıyıcı imalat, kontrol yazılımı ve daha fazla bilgi için CAD ​​ve CNC dosyalarını web sitesinden indirebilirsiniz <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> Taşıyıcılar da bu web sitesinden sipariş edilebilir. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> Stanford Döküm </td><td> Maske tasarım ve üretim protokolleri istek üzerine mevcuttur. Hazır kullanımı RootChips sipariş edilebilir <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> Chip denetleyici </td><td> -Ev inşa-</td><td> Otomatik valf kontrol sistemi başlangıçta Rafael Gomez-Sjöberg, Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuarı tarafından geliştirildi. Nasıl kendi aktüatörlü vana denetleyicisi oluşturmak için ayrıntılı bir talimat bulunabilir <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

time-lapse fluorescence imaging of arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the rootchip

Kök bitkinin fiziksel çapa olarak fonksiyonları ve bu tür bitkilerin topraktan edindiğiniz azot, fosfor, sülfat ve eser elementler olarak su ve mineral besin alımı sorumlu bir organdır. Biz yüksek mahsul üreten sürdürülebilir yaklaşımlar geliştirmek istiyorsak, daha iyi kök besinlerin geniş bir spektrum kaplıyor ve simbiyotik ve patojen organizmalar ile etkileşime, nasıl geliştiğini anlamak gerekir. Bu hedefleri gerçekleştirmek için, biz dakika gün arasında değişen süreler içinde mikroskobik ayrıntılı köklerini keşfetmek gerekiyor. Tabanlı mikro cihaz, görüntüleme 1 (Şekil 1) için hazırlık sırasında köklerine herhangi bir fiziksel stres kaçınarak bize Arabidopsis fidecilikten büyümeye ve görüntü kökleri sağlar - Biz RootChip, bir polidimetilsiloksan (PDMS) geliştirdi. Cihaz sıvı akışını yönlendirmek için mikromekanik vanalar featuring çatallı kanal yapısı içerençözeltisi girişlerden itibaren sekiz gözlem odalarına 2 her birine. Bu perfüzyon sistemi kök mikro kontrollü ve kesinlik ve hız ile değiştirilmiş izin verir. Odalarının hacmi dolayısıyla testi çözümün sadece az miktarda gerektiren, yaklaşık 400 nl olduğunu. Burada gerçek zamanlı çözünürlüklü görüntüleme tabanlı yaklaşımlar kullanılarak RootChip kök biyolojisi çalışmaları için ayrıntılı bir protokol sağlar. Kökler time lapse mikroskobu kullanarak birkaç gün içinde analiz edilebilir. Kökler besin çözümler veya inhibitörleri ile perfüze edilebilir ve sekiz fidan paralel olarak analiz edilebilir. Bu sistem, kimyasal maddeler, gen ekspresyonunun floresans bazlı analizi, ve biyosensör analizi varlığında veya yokluğunda büyüme kök analizi de dahil olmak üzere, geniş bir uygulama alanı için potansiyele sahip, örneğin nanosensors 3 FRET.

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip at JoVE.com

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Bu makale RootChip içinde Arabidopsis fide ekimi için bir protokol, mikroskobik kök izleme ve hücre içi metabolit düzeylerinin FRET tabanlı ölçümü ile büyüme koşullarını otomatik kontrol birleştiren bir mikroakışkan görüntüleme platform sağlar.

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

time-lapse-fluorescence-imaging-arabidopsis-root-growth-with-rapid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.5K Görüntüleme.  Carnegie Institution for Science. Bu makale RootChip içinde Arabidopsis fide ekimi için bir protokol, mikroskobik kök izleme ve hücre içi metabolit düzeylerinin FRET tabanlı ölçümü ile büyüme koşullarını otomatik kontrol birleştiren bir mikroakışkan görüntüleme platform sağlar.

Video: Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

Fibröz Proteinler gerin ve Tedbir Roman Yerçekimi Kuvveti Spektrometresi kullanır gösterilmesi

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

Biyomühendislik

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gümüş Tohum aracılığı Büyüme Yöntemi ile Altın Nanostar Sentezi

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture cellular behaviors involved in developmental processes.&#160; The ability to track and follow cell movements is limited by sample movements that occur due to drift of the sample or, in some cases, growth during image acquisition. Tracking cells in datasets affected by drift and/or growth will incorporate these movements into any analysis of cell position. This may result in the apparent movement of static structures within the sample. Therefore prior to cell tracking, any sample drift should be corrected. Using the open source Fiji distribution 1 &#160;of ImageJ 2,3 and the incorporated LOCI tools 4, we developed the Correct 3D drift plug-in to remove erroneous sample movement in confocal datasets. This protocol effectively compensates for sample translation or alterations in focal position by utilizing phase correlation to register each time-point of a four-dimensional confocal datasets while maintaining the ability to visualize and measure cell movements over extended time-lapse experiments.

Time-lapse microscopy allows the visualization of developmental processes. Growth or drift of samples during image acquisition reduces the ability to accurately follow and measure cell movements during development. We describe the use of open source image processing software to correct for three dimensional sample drift over time.

4D Eşodaklı Time-lapse Görüntüleme ardından Numune Drift Düzeltme

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

Yumuşak Litografi Değişimi Ile Kök Yüzey Mikroyapısının Biyomimetik Replikasyonu

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Ultra Hızlı Doppler ile Kan Akışı Görüntüleme

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...