WS, UKRI Geleceğin Liderleri Bursu [MR / V02213X/1] tarafından desteklenmektedir. El yazması metin ve grafikler, Refeyn'in bilimsel iletişim ekibinin (Panagiota Paganopoulou, Neus Torres Tamarit ve Catherine Lichten) desteğiyle hazırlandı. Ayrıca Camille Hetez, Sofia Ferreira ve Matthias Langhorst'tan gelen değerli geri bildirimlere de teşekkür ederiz.

1. Enstrümanların hazırlanması ve yazılımın başlatılması
<ol><li>Kütle fotometresini açın ve herhangi bir ölçüme başlamadan önce en az 1 saat açık bırakın. NOT: Bunun nedeni, cihazın sabit bir sıcaklığa ulaşması gerektiğidir. Kütle fotometresini 1 saat boyunca açık bırakmamak, kütle kaymasına ve dolayısıyla yanlış sonuçlara neden olabilir.</li>
	<li>Gücü açarak ve izolasyon düğmesine basarak (kütle fotometresinin altında) titreşim önleyici tabloyu açın. Titreşimler, kütle fotometrisi cihazının performansını sınırlar, bu nedenle titreşim önleyici tablo, maksimum cihaz hassasiyetini sağlamak için önemlidir. Mikroakışkan kutusunu açın.</li>
	<li>Veri toplama yazılımını ve mikroakışkan kontrol yazılımını başlatın. Hava kompresörünü açın.</li>
</ol>2. Protein örneklerinin, tamponun ve temizleme solüsyonlarının hazırlanması
<ol><li>Temiz bir 200 mL şişeye 200 mL PBS (pH 7.4) tamponu ve ikinci bir 200 mL şişeye 200 mL PBS (pH 5.0) tamponu ekleyin. NOT: Sonraki adımlarda 200 mL'lik şişelerin "L" Akış Birimi Sensörüne bağlanması gerekecektir. Kalibrasyon ölçümü için pH 7.4 PBS tamponu ve numune ölçümü için pH 5.0 PBS tamponu kullanın.</li>
	<li>0.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde, toplam 60 μL'lik bir hacim için IgG (2 μM) ve FcRn'yi (20 μM) 1:10 oranında karıştırın.<ol><li>FcRn ve IgG için stok çözeltileri sırasıyla 91.9 μM ve 13.5 μM'dir. Toplam 60 μL hacim için bir santrifüj tüpünde 9 μL stok IgG + 13 μL stok FcRn + 38 μL PBS (pH 5.0, oda sıcaklığı [RT]) karıştırarak reaksiyonu hazırlayın. İki reaktan için nihai konsantrasyonlar IgG için 2 μM ve FcRn için 20 μM idi. Bu işlem boyunca tüm protein stoklarını buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Başka bir 0.5 mL santrifüj tüpünde, 20 μM konsantrasyonda 20 μL β-Amilaz kalibranı dağıtın.<ol><li>Örnek olarak, burada kullanılan β-Amilaz kalibranını hazırlamak için 2.3.1.1-2.3.1.2'de açıklanan prosedürü izleyin.<ol><li>Şişedeki 20 mg β-Amilaz tozunu, 5.6 mg / mL'ye ve 100 μM'lik bir molar konsantrasyona (moleküler ağırlık 56 kDa olduğu için) karşılık gelen 3.57 mL PBS (% 5 gliserol) içinde yeniden süspanse edin.</li>
			<li>20 μM'ye seyreltmek için, 100 μM'lik stoğun 200 μL'sini 1 mL'lik bir santrifüj tüpünde 800 μL PBS (pH 7.4, RT) ile birleştirin.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Numuneleri RT'de en az 30 dakika inkübe edin. NOT: Kütle fotometresini açtıktan sonra numuneyi ve kalibant seyreltmelerini hazırlamaya başlayın. Bu deney için numuneler 120 dakika inkübe edildi.</li>
	<li>Üç adet 50 mL'lik santrifüj tüpünde, alikot: 50 mL PBS (pH 7.4) - temizleme solüsyonu 1 (CS1), 50 mL 0.5 M NaOH - temizleme solüsyonu 2 (CS2) ve 50 mL %100 IPA - temizleme solüsyonu 3 (CS3).</li>
</ol>3. Deney kurulumu
<ol><li>Numuneyi ve kalibantı yüklemek için, kalibant santrifüj tüpünü 4 konumuna ve numune santrifüj tüpünü mikroakışkan kutusunun 5 konumuna yerleştirin (Şekil 1).</li>
	<li>Temizleme solüsyonlarını yüklemek için CS1, CS2 ve CS3'ü mikroakışkan kutusunun 1, 2 ve 3 konumlarına yerleştirin (Şekil 1). NOT: Numune, kalibant ve temizleme solüsyonları çoklu anahtara (m-anahtarı) bağlanır. M anahtarı, "S" akış birimi sensörüne bağlanır.</li>
	<li>Tampon hattına bağlanan kapağı 200 mL (pH 7.4) tampon şişesine vidalayın. NOT: Tampon hattı, "L" akış birimi sensörüne bağlı olan bir kapatma vanasına bağlıdır. Kapatma vanası, tampon akışı durdurulduğunda oluşabilecek herhangi bir sifonlama etkisini önler. Sifonlama, tampon rezervuarına geri dönen seyreltilmiş artık sıvıdan tamponun kirlenmesine neden olabilir.</li>
	<li>Mikroakışkan çipi bir hazırlık plakasına yerleştirin. "S" akış birimi sensörünün diğer boru ucunu mikroakışkan çipindeki ilk kanalın "S girişi" içine itin (Şekil 1). Örnek hat tamamlandı.</li>
	<li>"L" akış birimi sensörünün diğer boru ucunu mikroakışkan çipteki ilk kanalın "Tampon girişine" itin (Şekil 1). Tampon hattı tamamlandı.</li>
	<li>Çıkış akışını toplamak için, mikroakışkan çipindeki ilk kanalın "Çıkışına" bir tüp itin; diğer ucunu, atık olarak alınabilir bir şişeye veya behere akacak şekilde konumlandırın (Şekil 1).</li>
</ol>4. Numune ve tampon hatlarının tampon ile astarlanması
<ol><li>Tampon hattındaki manuel kapatma vanasını açın.</li>
	<li>Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, tampon hattı akış hızını 1000 μL/dk'ya ayarlayın ve tampon hattı basıncının 110 mbar'ı aşmadığından emin olun (Şekil 2). Akış, tampon hattında otomatik olarak başlayacaktır (Şekil 1). NOT: Tampon hattı basıncı 110 mbar'ı aşarsa, bunun nedeni akış sensöründen geçen hava olabilir. Basınç birkaç saniye içinde normale dönmezse, potansiyel olarak bir tıkanıklık vardır (genellikle bağlantılarda sıkışmış boru nedeniyle). Bu durumda, akışı durdurun ve kapatma vanasından başlayarak tampon hattındaki bağlantıları kontrol edin.</li>
	<li>Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, m-anahtarının 1. konumunu seçin (PBS tamponuna karşılık gelir), ardından numune hattı akış hızını 8 μL/dk'ya ayarlayın ve numune hattı basıncının 350 mbar'ı aşmadığından emin olun. Akış, numune hattında otomatik olarak başlayacaktır (Şekil 1).</li>
	<li>Hava kabarcıklarını çıkarmak ve çıkıştan çıkarıldıklarından emin olmak için çipte sıkışan kabarcıkların yakınında yukarıdan hafif bir basınç uygulamak için bir pipet ucu (veya başka bir yumuşak plastik bileşen) kullanın. NOT: Kullanılan kanalın 'mikser' ve 'gözlem alanı' (Şekil 1) bölümlerindeki tüm baloncukları çıkardığınızdan emin olun. Çipe zarar verebileceğinden çok fazla itmemeye dikkat edin.</li>
</ol>5. Mikroakışkan çipin kütle fotometresine yerleştirilmesi ve odağın bulunması
<ol><li>Kütle fotometresinin objektifine bir damla mikroskop daldırma yağı sürün.</li>
	<li>Mikroakışkanlar çipini, "Numune Girişi" yukarı bakacak şekilde kütle fotometresinin tutucusuna yerleştirin ve s'ye bağlı tutun.amps (Şekil 1). Tüm boru bağlantılarının takılı kaldığından emin olun.</li>
	<li>Veri toplama yazılımını kullanarak, kanal 1'in "Gözlem alanının" hedefle uyumlu olduğundan emin olmak için sahneyi hareket ettirin (Şekil 1).</li>
	<li>Kütle fotometresi kapağını kapatın ve veri toplama yazılımındaki Damlacık Seyreltme Odak Bul seçeneğine basın.</li>
	<li>Veri toplama yazılımının sol alt köşesindeki beyaz odak halkasını kontrol edin (Şekil 3). Halkadaki boşluklar, daldırma yağında bir hava kabarcığının varlığını gösterir; Bunu, sahne hızını maksimuma çıkararak ve sahneyi yavaşça yanal olarak hareket ettirerek kaldırın.</li>
	<li>Odaklama tamamlandıktan sonra, ilk kaydı çekmeden önce 2-3 dakika bekleyin. Ardından, 1 dakikalık bir ölçüm kaydetmek için Kaydet'e basın ve (ölçümü gözlemleyerek) hiçbir kirlilik görünmediğinden emin olun. NOT: Kirlilikler cam yüzeyde veya tamponda olabilir. Veri toplama yazılımındaki Keskinlik değeri %4,5'in üzerinde olmalıdır.</li>
</ol>6. Kütle fotometrisi kalibrasyonu
<ol><li>Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, m-anahtarını konum 4'e (kalibrete karşılık gelen) getirin ve numune hattı akış hızının 8 μL/dak olarak ayarlandığından ve numune hattı basıncının 350 mbar'ı aşmadığından emin olun (Şekil 2).<ol><li>Kalibrant, çip boyunca akışa başlayacaktır. Yaklaşık 1,5-2,5 dakika bekleyin (veya kalibrant veri toplama yazılımında tutarlı bir şekilde görünene kadar). Süre, numune hattı boru uzunluğuna bağlı olarak değişebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibant tutarlı bir şekilde görüldüğünde (yani, olay sayısı doğru bir kütle fotometrisi ölçümü için yeterli olduğunda), mikroakışkanlar kontrol yazılımında akış hızını bu deney için hedef seyreltme seviyesi olan 0,5 μL/dk'ya düşürün. NOT: Daha yüksek bir akış hızıyla başlamak, kalibrantın çipe ulaşması için gereken süreyi azaltır.</li>
	<li>Ölçüm yüzeyine inen "çok az" veya "çok fazla" molekül olmadığından emin olun (Şekil 4).<ol><li>İniş olayı yoğunluğu "ideal" değilse (Şekil 4), mikroakışkanlar kontrol yazılımında akış hızını değiştirin. Olay yoğunluğu çok düşükse, iyi ayrılmış iniş olayları gözlemlenene kadar (ancak 8 μL/dk'yı aşmayın) numune akış hızını artırın. Çok yüksekse, numune akış hızını azaltın (ancak 0.1 μL/dk'nın altına düşmeyin).</li>
		<li>Numune tüpünde kalibant hacmi azalıyorsa, hava enjekte etmekten kaçınmak için m-anahtarı konumunu PBS pH 7.4 çizgisine (konum 1) değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kaydet'e basın ve 60 sn ölçüm yapın. Dosyayı seçilen bir klasöre kaydedin. NOT: Veri toplama yazılımı, uzantısı .mp olan dosyalar üretir.</li>
</ol>7. Numune hattının temizlenmesi ve akışın durdurulması
<ol><li>Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, m-anahtarının 2. konumuna geçin ve numune basıncını 800 mbar'a değiştirin (Şekil 2). Sistemi CS2 (NaOH) ile 4 dakika boyunca yıkayın.</li>
	<li>M-switch'in 3. konumuna geçin ve sistemi CS3 (IPA) ile 4 dakika boyunca yıkayın.</li>
	<li>M-switch'in 1. konumuna geçin ve sistemi 1 dakika boyunca CS4 (PBS) ile yıkayın.</li>
	<li>Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, numune hattı ve tampon hattı basınçlarını 0'a ayarlayarak tüm akışı durdurun ve tampon valfini kapatın.</li>
	<li>Çipi sahneden ayırın ve tekrar hazırlama plakasına yerleştirin. Tüm boruları ayırın ve numune boru ucunu bir atık şişesine yerleştirin. Hedefi izopropanol ve mendillerle temizleyin.</li>
</ol>8. Kütle fotometrisi örneğinin ölçülmesi
<ol><li>200 mL (pH 7.4) tampon şişesine bağlı kapağı sökün ve 200 mL (pH 5.0) tampon şişesine vidalayın.</li>
	<li>3.4-5.6 adımlarını tekrarlayın, ancak çipin ilk kanalı yerine ikinci kanalını kullanın.</li>
	<li>Mikroakışkanlar kontrol yazılımında, m-anahtarını konum 5'e (örneğe karşılık gelen) getirin, numune hattı akış hızını 8 μL/dk'ya ayarlayın ve numune hattı basıncının 350 mbar'ı aşmadığından emin olun (Şekil 2).</li>
	<li>Numuneyi ölçmek için 6.2-6.4 arasındaki adımları tekrarlayın.<ol><li>Kullanılacak akış hızlarını hesaplamak için, akış hızındaki katlama farkının istenen numune seyreltme faktörü ile eşleştiğinden emin olun. Örneğin, burada 2000x'lik seyreltmeyi elde etmek için, akış hızları 2000 faktörü ile farklılık gösterir; tampon akış hızı 1000 μL/dk ve numune akış hızı 0,5 μL/dk'dır. Bir deneyin sonunda, temizleme protokolünü takip ederek hatları daima temiz bırakın.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Veri analizi
<ol><li>Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, veri analiz yazılımını başlatın (Şekil 5).</li>
	<li>Sol üstteki artı (+) simgesine tıklayın ve .mp calibrant dosyasını seçin. Yazılım yüklenen dosyayı analiz etmeye başlayacaktır. Ölçümün boyutuna ve sayısına bağlı olarak bu işlem birkaç dakika sürebilir<ol><li>Veri toplama yazılımı ile veri alırken veri analiz yazılımındaki .mp dosyalarını analiz etmeyin, çünkü bunu yapmak elde edilen verilerin kalitesini düşürebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kütle kalibrasyonu oluştur düğmesine basın (sağ altta). Takılan tepe noktalarının kontrast değerleriyle doldurulmuş bir tabloyu gösteren bir iletişim kutusu açılacaktır.</li>
	<li>Değerleri, takılan tepe noktaları için bilinen kütle değerlerine değiştirin (β-amilaz için bu değerler 56 kDa, 112 kDa ve 224 kDa'dır) ve Kaydet'e basın. Yeni oluşturulan kalibrasyon dosyası (.mc uzantılı) Kütle Kalibrasyonu panelinde (veri analiz yazılımının sol alt kısmında) görünecektir (Şekil 6).</li>
	<li>Sol üstteki artı (+) simgesine tıklayın ve .mp örnek dosyasını seçin.</li>
	<li>Şekil 5'te gösterildiği gibi bir kütle histogramı oluşturmak için Analiz sekmesine gidin, Histogram modunu ve Kütle grafiği seçeneğini seçin. Kutu genişliğini, Kütle Limitlerini ve diğer parametreleri gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>Şekilleri dışa aktarmadan ve/veya tüm çalışma alanını bir .dmp dosyası olarak kaydetmeden önce istenirse Şekiller sekmesinde çizimi daha fazla özelleştirin.</li>
</ol>

Kütle Fotometrisi Analizi Konsantrasyon Aralığının Mikroakışkanlar ile Genişletilmesi

<ol>
	<li>Arter, W. E., Levin, A., Krainer, G., Knowles, T. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions+in+solution.">Microfluidic approaches for the analysis of protein-protein interactions in solution.</a> Biophysical Reviews. 12 (2), 575-585 (2020).</li><li>Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+transient+protein+complexes+determined+via+diffusion-independent+microfluidic+mixing+and+fluorescence+stoichiometry.">Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 122 (49), 11554-11560 (2018).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Methods+in+structural+biology:+Cryo-electron+microscopy.">Editorial: Methods in structural biology: Cryo-electron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1041386 (2022).</li><li>Herling, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+real-time+detection+and+quantification+of+protein-ligand+interactions.">A microfluidic platform for real-time detection and quantification of protein-ligand interactions.</a> Biophysical Journal. 110 (9), 1957-1966 (2016).</li><li>Soltermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+by+molecular+counting+with+mass+photometry.">Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry.</a> Angewandte Chemie International Edition. 59 (27), 10774-10779 (2020).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+antibody-antigen+affinity+by+mass+photometry.">Rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61784 (2021).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+affinity+of+protein-protein+interactions+on+a+single-molecule+level+by+mass+photometry.">Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry.</a> Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Zijlstra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microfluidic+dilution+for+single-molecule+spectroscopy+of+low-affinity+biomolecular+complexes.">Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).</li><li>MassFluidix&#174; HC system for rapid dilution via microfluidics. Available from: <a target="_blank" href="https://www.refeyn.com/massfluidix-hc-system">https://www.refeyn.com/massfluidix-hc-system</a> (2023)</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Jarmoskaite, I., AlSadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+evaluate+binding+affinities.">How to measure and evaluate binding affinities.</a> eLife. 9, e57264 (2020).</li><li>Monnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+IgG+variants+with+increased+FcRn+binding+using+random+and+directed+mutagenesis:+Impact+on+effector+functions.">Selection of IgG variants with increased FcRn binding using random and directed mutagenesis: Impact on effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 39 (2015).</li><li>. Refeyn TwoMP: Transforming biomolecular characterisation Available from: <a target="_blank" href="https://www.refeyn.com/twomp-mass-photometer">https://www.refeyn.com/twomp-mass-photometer</a> (2022)</li><li>Lai, S. -. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+mass+analysis+of+intact+ribosomes+by+mass+photometry+and+Orbitrap-based+charge+detection+mass+spectrometry.">Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and Orbitrap-based charge detection mass spectrometry.</a> iScience. 24 (11), 103211 (2021).</li><li>Wu, D., Piszczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+protocol+for+mass+photometry+experiments.">Standard protocol for mass photometry experiments.</a> European Biophysics Journal. 50 (3-4), 403-409 (2021).</li><li>Vaughn, D. E., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+pH-dependent+antibody+binding+by+the+neonatal+Fc+receptor.">Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor.</a> Structure. 6 (1), 63-73 (1998).</li><li>Niebling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+screening+pipeline+for+Cryo-EM+grid+preparation+of+membrane+proteins.">Biophysical screening pipeline for Cryo-EM grid preparation of membrane proteins.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 882288 (2022).</li><li>Paul, S. S., Lyons, A., Kirchner, R., Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+oligomer+populations+in+real+time+during+protein+aggregation+using+single-molecule+mass+photometry.">Quantifying oligomer populations in real time during protein aggregation using single-molecule mass photometry.</a> ACS Nano. 16 (10), 16462-16470 (2022).</li><li>Schulz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+increased+complexity+and+specificity+at+the+dawn+of+form+I+Rubiscos.">Evolution of increased complexity and specificity at the dawn of form I Rubiscos.</a> Science. 378 (6616), 155-160 (2022).</li><li>Malay, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-stable+gold-coordinated+protein+cage+displaying+reversible+assembly.">An ultra-stable gold-coordinated protein cage displaying reversible assembly.</a> Nature. 569 (7756), 438-442 (2019).</li><li>Hundt, N., Cole, D., Hantke, M. F., Miller, J. J., Struwe, W. B., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+molecular+mechanism+underlying+protein+polymerization.">Direct observation of the molecular mechanism underlying protein polymerization.</a> Science Advances. 8 (35), eabm7935 (2022).</li><li>Acharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RPA+domains+promote+recruitment+and+the+helicase-nuclease+activities+of+Dna2.">Distinct RPA domains promote recruitment and the helicase-nuclease activities of Dna2.</a> Nature Communications. 12, 6521 (2021).</li><li>Ebberink, E. H. T. M., Ruisinger, A., Nuebel, M., Thomann, M., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+production+variability+in+empty+and+filled+adeno-associated+viruses+by+single+molecule+mass+analyses.">Assessing production variability in empty and filled adeno-associated viruses by single molecule mass analyses.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 27, 491-501 (2022).</li><li>Melo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+distributions+of+gold+nanoparticles+in+solution+measured+by+single-particle+mass+photometry.">Size distributions of gold nanoparticles in solution measured by single-particle mass photometry.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 125 (45), 12466-12475 (2021).</li></ol>

Myndert Claasen ve Zornitsa Kofinova, bu makalede kullanılan kütle fotometresi ve mikroakışkan sistemini üreten Refeyn Ltd'nin çalışanlarıdır. Weston Struwe, Refeyn Ltd.'nin hissedarı ve danışmanıdır.

Burada özetlenen protokol, düşük afiniteli protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve ölçmek için bir yöntem sağlar. Hızlı seyreltme mikroakışkan sistemine bağlı bir kütle fotometresi kullanır. Kütle fotometrisi, 30 kDa ila 6 MDa aralığındakiler için biyomoleküller16 çözeltisindeki moleküler kütleyi güvenilir bir şekilde ölçebilen, etiketsiz, biyoanalitik bir araçtır. Kütle fotometrisi, numuneleri tek tek analiz eden tek moleküllü bir teknik olduğundan, genellikle 100 pM-100 nM konsantrasyon aralığındaki numunelerle sınırlıdır. Bu aralığın üzerinde, cam yüzeye inen moleküller uzamsal olarak üst üste binecek ve bu da düşük veri kalitesine neden olacaktır; Bu aralığın altında, sağlam analiz yapmak için çok az veri elde edilir7. Önemli bir sonuç, protein etkileşimlerinin araştırılmasını, bu aralıktaki bağlı ve bağlanmamış türlerin bir karışımını oluşturanlarla sınırlayabilmesidir.
Burada, kütle fotometrisine uygun numune konsantrasyonları aralığını etkili bir şekilde genişletmek için hızlı seyreltme mikroakışkan sistemi kullanmak için adım adım bir protokolü detaylandırdık. Numuneyi mikroakışkan çip üzerinde seyrelterek ve daha sonra 50 ms içinde dedektör gözlem penceresi boyunca akıtarak, sistem, etkileşim dengesi değişmeden önce seyreltilmemiş numunede bulunan kompleksleri yakalar. Numune, bireysel ölçümler sırasında sürekli olarak dedektöre iletilir. Bu koşullar altında, numune ölçüldüğünde, düşük afiniteli etkileşimler için bile kompleksin %95'i bozulmadan kalacaktır - mikro azı dişleri sırasınagöre bir KD ve 1 s-1 kadar hızlı ayrışma oranları ile.
Bu şu şekilde hesaplanabilir: İleri hızı kfve geri hızı kb olan bir reaksiyon <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq01.jpg" style="margin: auto;"> için,
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq02.jpg" style="margin: auto;">
Dengede, üç türün (A, B ve karmaşık AB) konsantrasyonları sabit kalır, bu yüzden <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq03.jpg" style="margin: auto;"> ve <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq04.jpg" style="margin: auto;">. Bozulmanın (bu durumda seyreltme) kompleksin ayrışmasına neden olabileceği, ancak ileri (birleşme) reaksiyonunun ilerlemediği muhafazakar varsayımı altında, kf [A] [B] terimi ihmal edilebilir olarak ele alınabilir ve aşağıdaki basitleştirme yapılabilir:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq06.jpg" style="margin: auto;">
İntegral, dengenin bozulmasından sonraki zamanda kompleks konsantrasyonu için aşağıdaki ifadeyi verir:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq07.jpg" style="margin: auto;">
Dengenin bozulmasından sonra t zamanında bağlı kalan kompleksin fraksiyonu şu şekildedir:
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq08.jpg" style="margin: auto;">
= 50 ms'de, kb≈ 1 s-1 ile bir reaksiyon için, kesir sınırı 0.95 veya %95'tir.11,12.
IgG monoklonal antikoru trastuzumab'ın FcRn'nin çözünür alanına bağlanmasını araştırmak için burada ve daha önce5 kütle fotometrisi kullanıldı. İki bağlayıcı ortağın asidik pH17'de nanomolar afinite ile bağlandığı bildirilmiştir. Bağlayıcı ortaklar pH 5.0'da iken oluşan komplekslerin bolluğunu kalitatif olarak değerlendirmek için kütle fotometrisi kullanıldı ve numuneler ek bir mikroakışkan sistem aracılığıyla hızla seyreltildi. Prosedür, daha önce bildirilen sonuçlara dayalı olarak belirli protein-protein etkileşimi için optimize edildi5. Aynı prosedür, kullanıcıların söz konusu sistem için hangi tamponların kullanılacağı, ilk protein konsantrasyonu, beklenen stokiyometri ve etkileşimin bir dengeye ulaşmasına izin vermek için gereken inkübasyon miktarı gibi deneysel koşulları önceden bilmeleri veya optimize etmeleri koşuluyla, diğer etkileşimleri incelemek için de kullanılabilir.
IgG-FcRn karışımı manuel olarak seyreltildiğinde, bu proteinlerinetkileşime girdiği bilinmesine rağmen, IgG-FcRn komplekslerinin varlığını tespit etmek zordu5. Bu makale, hızlı seyreltme yaklaşımının, bu komplekslerin önemli ölçüde artmasına neden olduğunu göstermektedir. Aynı numune için, hızlı seyreltme kullanıldığında, 1: 1 FcRn-IgG kompleksleri ve 2: 1 FcRn-IgG komplekslerinin her ikisi de açıkça gözlendi. Karmaşık oluşumdaki bu farklılıklar, geniş bir konsantrasyon aralığında biyomoleküler etkileşim sistemlerinin incelenmesinin önemini göstermektedir.
Ek olarak, bu sonuçlar aynı zamanda zayıf etkileşimleri yakalamak için tek molekül analiziyle mikroakışkanların kullanılmasının basit olduğunu ve yöntemde önemli bir boşluğu doldurduğunu göstermektedir. Hızlı seyreltme mikroakışkanlarının kütle fotometrisi ile kombinasyonu, analitik bir teknik olarak kütle fotometrisinin avantajları nedeniyle çekici avantajlar sunar. Yani, kütle fotometrisi etiket gerektirmez, minimum numune hazırlığını içerir ve ölçümler çözelti içinde yapılır. Bu protokol için, kütle fotometrisinin bir diğer önemli avantajı, oluşan tüm türleri ayırt etme ve ölçme yeteneğidir (>30 kDa'lık belirgin bir kütleye sahip olmaları şartıyla). Bu, örneğin, bağlanma ve bağlanmama oranlarını ölçebilen, ancak stokiyometri bilgisini kolayca sağlayamayan SPR'nin aksinedir8.
Bu protokol ve daha genel olarak kütle fotometrisi deneyleri için, birkaç husus yardımcı olacaktır. İlk olarak, nihai protein konsantrasyonu, kütle fotometrisinin ölçebileceği sınır dahilinde olmalıdır (100 pM-100 nM). Başlangıç inkübasyon konsantrasyonu ayrıca mikroakışkan sistem aralığında (90 μM'ye kadar) olmalı ve etkileşimin gerçekKD'sinin üzerinde olacak şekilde teorize edilmelidir10. Önerilen başlangıç noktası, μM konsantrasyonunda etkileşen türler arasında 1:1 konsantrasyon karışım oranıdır. Oran daha sonra 1:2, 1:5 veya bu etkileşim durumunda olduğu gibi 1:10 olarak değiştirilebilir. Protein etkileşimleri hakkında daha önce herhangi bir bilgi yoksa, kullanıcının, bileşenlerin afinitesinin sunulan yöntem tarafından sürdürülen konsantrasyon aralığında olup olmadığını belirlemek için her bir partner için yüksek bir konsantrasyonla (önerilen 20 μM) başlayarak deneyi optimize etmesi gerekecektir (yani, kompleksler oluşur). Optimizasyon, doğru karışım oranını belirlemek için etkileşim bileşenlerinden birinin etkileşimlerini veya titrasyonunu teşvik etmek için diğer tampon koşullarının seçilmesini de içerebilir. Bunlar belirlendikten sonra, çalışma ve yöntem için en uygun koşullara izin vermek için konsantrasyonları ve akışları optimize etmek, örneğin daha iyi tepe çözünürlüğü sağlamak için konsantrasyonları azaltmak mümkündür.
İkincisi, bu deneyi başarılı bir şekilde tekrarlamak için safsızlıklar en aza indirilmelidir. Kütle fotometrisi ölçümlerini olumsuz etkilediği bilinen yaygın safsızlık kaynakları arasında saflaştırmadan sonra kalan diğer proteinler veya hücresel kalıntılar, filtrelenmemiş tamponlar, misel oluşturan deterjanlar (çok yüksek konsantrasyonda varsa) ve yüksek konsantrasyonlarda tuz, gliserol veya diğer bileşenler içeren tamponlar bulunur. Yukarıdaki Protokolde tartışıldığı gibi, mikroakışkan sistemdeki kabarcıklar çıkarılmalıdır. Boru sisteminde veya numuneler yüksek yüzey gerilimine sahipse ve köpük oluşumuna eğilimliyse kabarcıklar oluşabilir. Daldırma yağında da kabarcıklar oluşabilir ve bu kabarcıklar odak halkasından algılanabilir (Şekil 3). Protokolde açıklanan adımlar kullanılarak kabarcıklar çıkarılamıyorsa, başka bir çözüm de numuneyi bir desikatör ve bir vakum pompası kullanarak gazdan arındırmak ve numuneyi birkaç dakika düşük basınç altında bırakmaktır. Yüksek konsantrasyonlu protein çözeltilerinin girdaplanması veya çalkalanması önerilmez, çünkü bu eylemler kabarcık oluşumunu teşvik edebilir.
Spesifik bir protein-protein etkileşiminin ölçümü burada gösterilmiş olsa da, aynı protokol önemli bir modifikasyon olmaksızın diğer protein-protein etkileşim sistemlerine de uygulanabilir. Bu protokolün gelecekteki bir başka yönü, kütle fotometrisi 5,7 bağlamında başka bir yerde açıklandığı gibi, tanımlanan kompleksleriçin KD değerlerini hesaplamak için ölçümleri kullanmak olacaktır. Önceki çalışmalar, manuel seyreltme ve daha güçlü etkileşimler içeren deneylerden elde edilen verileri kullanırken, mikroakışkan cihazda daha fazla iyileştirmenin uygulanması koşuluyla (artan akış sensörü doğruluğu ve pompa stabilitesi gibi) analiz ilkesi bu bağlamda kolayca uygulanabilir.
Protein-protein etkileşimlerinin ötesinde, kombine kütle fotometrisi ve hızlı seyreltme mikroakışkan yaklaşımı için daha geniş uygulamalar olması muhtemeldir. Kütle fotometrisi, numune saflığını, agregasyonunu ve homojenliğini değerlendirmek için kullanılabilir18,19; protein oligomerizasyonu20, makromoleküler montaj21 veya polimerizasyon22'yi inceleyin; ve diğer alanlarda. Kütle fotometrisi analizi ayrıca proteinlerin ötesine uzanır; Nükleik asitler ve proteinler23, viral partiküller24 ve nanopartiküller25 arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılmıştır. Bu nedenle bu protokol, birleşik kütle fotometrisi mikroakışkan sisteminin önemli bir uygulamasını tanımlar - tek tek moleküller ve kompleksler düzeyinde zayıf protein-protein etkileşimlerinin doğrudan ölçülmesini sağlar. Mevcut uygulamanın değeri yüksektir, çünkü genellikle incelenmesi zor olan etkileşimleri kritik terapötik alanlarla ilgili olarak doğrudan karakterize etme olasılığını ortaya çıkarır. Bu birleşik yaklaşım, onlarca mikromolar ile konsantrasyonlara sahip numuneler için daha geniş bir araştırma yelpazesi için temel teşkil edebilir.

Protein-protein etkileşimleri, bağışıklık regülasyonundan DNA replikasyonuna ve translasyonuna kadar çoğu hücresel fonksiyonun altını çizer. Sonuç olarak, yaşam bilimleri boyunca, yaygın olarak oluşan çeşitli heterojen kompleksler arasında çok çeşitli etkileşimleri araştırmak için temel bir ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, bunların tespiti, karakterizasyonu ve nicelleştirilmesi, özellikle düşük afiniteli etkileşimler için genellikle zordur1.
İmmünopresipitasyon testleri genellikle yüksek afiniteli etkileşimleri tespit etmek için kullanılır, ancak düşük afiniteli ve geçici etkileşimler için tespit büyük ölçüde mümkün değildir2. Floresan teknikleri de kullanılabilir, ancak floresan etiketlerin potansiyel olarak rahatsız edici bir şekilde eklenmesini gerektirir2. Cryo-EM, yüksek uzamsal çözünürlükle oluşturulan protein komplekslerinin yapısal bir anlık görüntüsünü ve bir topluluk okumasını sağlayabilir, ancak aynı zamanda tipik olarak düşük afiniteli etkileşimleri görüntülemek için çok düşük konsantrasyonlarda çalışmayı gerektirir. Cryo-EM ayrıca maliyet, erişilebilirlik, numune hazırlama ve analiz süresi ile ilgili zorlukları da beraberinde getirir3.
Ek olarak, yüzey plazmon rezonansı (SPR), protein-protein etkileşimlerini ölçmenin popüler bir yolu haline gelmiştir, ancak bağlanma dengesini etkileyebilen ve değişken açılma oranlarına neden olabilen protein immobilizasyonu gerektirmesine rağmen, böylece ölçüm doğruluğunu azaltır 4,5. Ayrıca, veri toplama ve analizinden önce birkaç tahlil adımını içerir6.
Kütle fotometrisi, protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için kullanılan tek moleküllü bir tekniktir 5,6,7. Tek moleküllerin veya komplekslerin kütlesini, bir cam lamel8'in yüzeyine indiklerinde saçtıkları ışığa dayalı olarak ölçerek çalışır. Kütle fotometrisi ölçümleri, bağlanma ortaklarının nispi bolluğundan ve oluşturdukları komplekslerden bağlanma afinitelerini ölçmek için kullanılmıştır5. Bununla birlikte, diğer tek moleküllü teknikler gibi, ölçülecek numunenin konsantrasyonu tipik olarak 100 nM'den az olmalıdır. Konsantrasyon daha yüksekse, cam yüzeye inen moleküller uzamsal olarak üst üste binecek ve bu da düşük veri kalitesine neden olacaktır7. Sonuç olarak, bu düşük konsantrasyonlarda ayrışan daha zayıf etkileşimler(KD ~ mikro azı dişleri), bağlanmamış ve bağlı türlerin gerekli karışımını gözlemlemek mümkün olmadığı için güvenilir bir şekilde ölçülemez5.
Burada, yeni bir birleştirilmiş mikroakışkan kütle fotometri cihazına dayalı olarak bu sınırlamanın üstesinden gelen bir yaklaşımı açıklıyoruz. Spesifik olarak, kütle fotometrisi ile ölçülebilen etkileşim aralığını etkili bir şekilde genişletmek için kütle fotometresi ile birlikte bir mikroakışkan sistem kullanılır. Mikroakışkanların, zayıf etkileşimleri tespit etmek için hızlı seyreltme de dahil olmak üzere protein-protein etkileşimlerini araştırmak için bir dizi olasılık sunduğu gösterilmiştir 1,9. Burada açıklanan sistem, numuneyi bir mikroakışkan çip üzerinde 10.000 kata kadar hızlı bir şekilde seyrelterek ve hemen çipin gözlem alanı boyunca akıtarak çalışır, bu da kütle fotometrisi ölçümünün, moleküllerin seyreltme işlemine başladığı andan itibaren 50 ms içinde başlamasını sağlar10. Seyreltme, numune ve tampon, çip üzerindeki bir ters Tesla valf karıştırıcısında birleştirildiğinde meydana gelir ve iki çözeltinin nispi akış hızları, meydana gelen seyreltme miktarını belirler (bkz. Protokol adımı 8). Akış hızı, mikroakışkan kontrol yazılımı ile kontrol edilebilir. Akış hızının değiştirilmesi, kütle fotometresi tarafından ölçülen camın yüzeyindeki iniş olaylarının sayısını etkileyebileceğinden, türün göreceli popülasyonunu değiştirebilir.
Sürecin hızı, etkileşimin bütünlüğü bozulmadan önce ölçümün tamamlanması için yeterince hızlıdır (daha fazla ayrıntı için ayrıca Tartışmaya bakın). Bu, birinci dereceden reaksiyonlar teorisine kısa bir bakışla anlaşılabilir.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq01.jpg" style="margin: auto;"> İleri (ilişkilendirme) oran sabiti kf, geri (ayrışma) oran sabiti kb ve denge ayrışma sabiti (KD) şu şekilde tanımlanır:
KD= kb/ kf
Protein bağlanması için, kfgenellikle reaktanların difüzyonu11 ile sınırlıdır ve bu nedenle 106-10 7 M-1·s-1 aralığı ile sınırlıdır. aralığı sınırlı olduğundan, düşük afiniteli (KD ~ mikro azı dişleri) bir reaksiyon kb≈ 1 s-1 olacaktır. Yani, kb= kf · KD= (106 M-1·s-1) (10-6 M) = 1 s-1, kompleksin yarı ömrü 0.7 s11,12 civarındadır.
Örnek sistemimiz, IgG monoklonal antikoru trastuzumab'ın, etkileşimli ortaklar olarak bilinen IgG neonatal Fc reseptörünün (FcRn) çözünür alanına bağlanmasıdır13. Tek başına konvansiyonel kütle fotometrisi kullanılarak elde edilen daha önce yayınlanmış veriler (yani, numunelerin manuel seyreltilmesiyle), proteinlerin birden fazla tür oluşturduğunu gösterdi. FcRn monomerleri, FcRn dimerleri ve bağlanmamış IgG açıkça görülürken, IgG-FcRn kompleksleri (1: 1 ve 1: 2 oranlarında) da (pH 5.0'da) tespit edildi, ancak sadece çok düşük bollukta5. Bu gözlem, daha yüksek bir konsantrasyonda ölçüldüğünde IgG-FcRn kompleks oluşumunun daha net bir şekilde tespit edilip edilemeyeceği sorusunu gündeme getirmektedir. Gerçekten de, kütle fotometrisini burada açıklanan birleştirilmiş bir hızlı seyreltme yaklaşımıyla birleştirmek, ölçülen parçacıklarındaki bir artışla karmaşık oluşumun daha sağlam kanıtlarını sağladı.
Burada tarif edilen kütle fotometrisi ve mikroakışkan protokolü, mikromolar aralığakadar bir KD ile komplekslerin oluşumunu karakterize etmeyi mümkün kılar. KD'nin ampirik bir şekilde belirlenmesi, akış sensörü doğruluğu, pompa stabilitesi, çipten çipe varyasyonlar ve gözlem penceresi içindeki ölçüm konumu üzerinde daha fazla iyileştirme gerektirecektir, çünkü tüm bu faktörler numunenin seyreltildiği andan ölçülmeye kadar geçen süreyi etkileyecektir.
Aynı yaklaşım, bir kütle fotometresi (30 kDa ila 6 MDa) ile analiz için uygun aralığa giren farklı moleküler ağırlıklara (en az 25 kDa ile ayrılmış) sahip olmaları koşuluyla, herhangi bir çözünür protein arasındaki bağlanmayı araştırmak için de uygulanabilir. Elde edilen içgörüler, hücresel işlevlerin mekanik bir şekilde anlaşılmasından yeni biyoterapötik ilaçların tasarımına kadar çeşitli bağlamlardaki çalışmalar için yardımcı olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>20880.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td>AcquireMP (v2022 R1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td>DiscoverMP (v2022 R1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCRN, His-Tag</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRP0624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herceptin (IgG)&#160;</td>
			<td>Cambridge Bioscience</td>
			<td>HY-P9907-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass photometer</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td>TwoMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics box</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td>MassFluidix HC system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics chip</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td>MassFluidix HC chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics control software</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>OxyGEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>K812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Amylase, from sweet potato</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8781</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein complex formation at micromolar concentrations by coupling microfluidics with mass photometry

Kütle fotometrisi, biyomoleküler etkileşimlerin ve etiketsiz çözelti içinde karmaşık oluşumun incelenmesini sağlayan çok yönlü bir kütle ölçüm teknolojisidir. Kütle fotometrisi genellikle 100 pM-100 nM konsantrasyon aralığındaki numuneleri analiz etmek için uygundur. Bununla birlikte, birçok biyolojik sistemde, düşük afiniteli veya geçici etkileşimleri incelemek için daha konsantre numunelerin ölçülmesi gerekir. Burada, kütle fotometrisi ile nanomolar dan onlarca mikromolar kısma kadar analiz edilebilen numune konsantrasyonları aralığını etkili bir şekilde genişleten bir yöntem gösteriyoruz. 
Bu protokolde, kütle fotometrisi, mikromolar konsantrasyon aralığında çözelti içinde protein komplekslerinin oluşumunu araştırmak için yeni bir mikroakışkan sistem ile birleştirilir. Mikroakışkan sistem ile kullanıcılar, kütle fotometrisi ölçümünden birkaç milisaniye önce nanomolar aralığa seyreltme ve ardından istenen daha yüksek bir konsantrasyonda bir numuneyi tutabilir. Seyreltme hızı nedeniyle, numunenin dengesi değişmeden önce veriler elde edilir (yani, kompleksin ayrışması). 
Teknik, bir immünoglobulin G (IgG) antikoru ile yenidoğan Fc reseptörü arasındaki etkileşimleri ölçmek için uygulanır ve statik kütle fotometrisi ölçümleri ile ölçülemeyen yüksek dereceli komplekslerin oluşumunu gösterir. 
Sonuç olarak, kütle fotometrisi ve mikroakışkanların kombinasyonu, mikromolar konsantrasyon aralığındaki numuneleri karakterize etmeyi mümkün kılar ve daha zayıf afinitelere sahip biyomoleküler etkileşimleri ölçmede uzmandır. Bu yetenekler, biyoterapötiklerin geliştirilmesi ve tasarımı da dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda uygulanabilir ve çeşitli protein-protein etkileşimlerinin kapsamlı bir şekilde karakterizasyonunu sağlar.

Protein-protein interactions underline most cellular functions, from immune regulation to DNA replication and translation. As a result, there is a fundamental need throughout the life sciences to investigate a vast range of interactions across diverse heterogenous complexes that are commonly formed. However, their detection, characterization, and quantification are often challenging, particularly for low-affinity interactions1.
Immunoprecipitation assays are often used to detect high-affinity interactions, but for low-affinity and transient interactions, detection is largely unfeasible2. Fluorescence techniques can also be used but require the potentially disruptive addition of fluorescent labels2. Cryo-EM can provide a structural snapshot and an ensemble readout of the protein complexes formed with high spatial resolution but also typically requires working at concentrations that are too low for imaging low-affinity interactions. Cryo-EM also brings challenges related to cost, accessibility, sample preparation, and analysis time3.
Additionally, surface plasmon resonance (SPR) has become a popular way to quantify protein-protein interactions, although it requires protein immobilization, which can affect the binding equilibrium and result in variable on-rates, thus reducing measurement accuracy4,5. It also involves several assay steps prior to data collection and analysis6.
Mass photometry is a single-molecule technique that has been used to analyze protein-protein interactions5,6,7. It works by measuring the mass of single molecules or complexes based on the light they scatter when they land on the surface of a glass coverslip8. Mass photometry measurements have been used to quantify binding affinities from the relative abundance of binding partners and the complexes they form5. Nevertheless, like other single-molecule techniques, the concentration of the sample to be measured should typically be less than 100 nM. If the concentration is higher, the molecules landing on the glass surface will overlap spatially, resulting in poor data quality7. Consequently, weaker interactions (KD ~micromolars), which dissociate at these lower concentrations, cannot be measured reliably since it is not possible to observe the necessary mixture of unbound and bound species5.
Here, we describe an approach that overcomes this limitation based on a new coupled microfluidics mass photometry device. Specifically, a microfluidics system is used in combination with the mass photometer to effectively expand the range of interactions that can be quantified by mass photometry. Microfluidics has been shown to offer a range of possibilities for investigating protein-protein interactions, including rapid dilution to detect weak interactions1,9. The system described herein operates by rapidly diluting the sample up to 10,000-fold on a microfluidic chip and immediately flowing it across the observation area of the chip, enabling the mass photometry measurement to start within 50 ms from when the molecules began the dilution process10. The dilution occurs when the sample and buffer are combined in a reverse Tesla valve mixer on the chip, with the relative flow rates of the two solutions determining the amount of dilution that occurs (see Protocol step 8). The flow rate is controllable with the microfluidic control software. Altering the flow rate can change the relative population of the species as it can impact the number of landing events on the surface of the glass, which is what is measured by the mass photometer.
The speed of the process is fast enough for the measurement to be completed before the integrity of the interaction has been disrupted (for further details, see also the Discussion). This can be understood through a brief look at the theory of first-order reactions, where <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65772/65772eq01.jpg" style="margin: auto;" />. The forward (association) rate constant is kf, the backward (dissociation) rate constant is kb, and the equilibrium dissociation constant (KD) is defined as
KD = kb / kf
For protein binding, kf is generally limited by the reactants&#39; diffusion11 and so is restricted to the range of 106-107 M-1&#183;s-1. Because the range of is limited, a low-affinity (KD ~micromolars) reaction will have kb &#8776; 1 s-1. That is, kb = kf&#160;&#183; KD = (106 M-1&#183;s-1) (10-6 M) = 1 s-1, with the complex&#39;s half-life around 0.7 s11,12.
Our example system is the binding of the IgG monoclonal antibody trastuzumab to the soluble domain of the IgG neonatal Fc receptor (FcRn), which are known interacting partners13. Previously published data obtained using conventional mass photometry alone (i.e., with manual dilution of samples) showed that the proteins form multiple species. FcRn monomers, FcRn dimers, and unbound IgG were clearly visible, while IgG-FcRn complexes (at 1:1 and 1:2 ratios) were also detected (at pH 5.0) but only with very low abundance5. This observation prompts the question of whether IgG-FcRn complex formation could be more clearly detected if measured at a higher concentration. Indeed, combining mass photometry with a coupled rapid dilution approach described here provided more robust evidence of complex formation by an increase in their measured particles.
The mass photometry and microfluidics protocol described here makes it possible to characterize the formation of complexes with a KD up to the micromolar range. An empirical determination of the KD will require further improvements on the flow sensor accuracy, pump stability, chip-to-chip variations, and measurement location inside the observation window, as all these factors would influence the time from when the sample is diluted to being measured.
The same approach could be applied to investigate binding among any soluble proteins, provided they have distinct molecular weights (separated by at least 25 kDa) that fall into the range suitable for analysis with a mass photometer (30 kDa to 6 MDa). The insights obtained could be helpful for studies in a range of contexts - from gaining a mechanistic understanding of cellular functions to the design of new biotherapeutic drugs.

Yazar Gündemi: MassFluidix Teknolojisi Kullanılarak Çözeltideki Düşük Afiniteli Protein Etkileşimlerinin Karakterizasyonu

Mikroakışkanların Kütle Fotometrisi ile Birleştirilmesiyle Mikromolar Derişimlerde Protein Kompleksi Oluşumunun Analizi

This protocol demonstrates a completely new way to analyze low affinity protein complexes. It allows researchers to detect and characterize certain protein interactions even when they are weak or transient, which has generally been very difficult or even impossible before. Protein interactions are crucial for cell function, but detecting and measuring them can be challenging.Mass photometry is a great tool for quantifying protein complex formation, but it has limitations with dilute samples. We're solving this problem with MassFluidix. The research gap we are addressing is how scientists can reliably characterize low affinity interactions between proteins in solution.The advantages of our approach are that it allows you to look for weak protein interactions in solution without the need for labels or immobilization. So researchers can observe the proteins of interest and how they interact without worrying that they're disrupting the system they're looking at.

IgG monoklonal antikoru trastuzumab ile IgG neonatal Fc reseptörünün (FcRn) çözünür alanı arasındaki etkileşimi ölçmek için kütle fotometrisi kullanıldı. İki proteinin 1:10'luk bir karışımı (IgG için 2 μM'de ve FcRn için 20 μM'de) PBS'de sırasıyla 10 nM ve 20 nM'ye manuel olarak seyreltildi.
Seyreltme adımı gereklidir çünkü tek moleküllü bir kütle ölçüm tekniği olan kütle fotometrisi yalnızca 100 pM-100 nM aralığındaki numuneleri analiz edebilir. Bu aralığın dışındaki konsantrasyonlara sahip numuneleri ölçmeye çalışmak, sonuçların doğruluğunu tehlikeye atabilir (Şekil 4). Bu deney, daha önce 5,6 olarak tanımlandığı için bu Protokole dahil edilmemiştir.
Bir kütle fotometrisi deneyinde üretilen kütle histogramlarında, her iniş olayı için saçılma sinyalinin (veya 'kontrastın') gücü x ekseni üzerinde çizilir ve kütle-kontrast kalibrasyon adımı aracılığıyla moleküler kütleye dönüştürülür. Bu arada, y ekseni belirli bir kütle (veya kontrast) ile sayılan molekül sayısını gösterir. Bu nedenle, bir tepe noktası, x ekseninde gösterilen moleküler ağırlıklar aralığında bir molekül popülasyonunun varlığını gösterir. Zirveyi oluşturan olayların (sayımların) sayısı, o popülasyonun boyutunu yansıtır.
Manuel seyreltme ile kütle fotometrisi ölçümü, proteinlerin beklenen moleküler ağırlıklarına dayanan en büyük iki tepe noktasının, bağlanmamış FcRn monomerlerine (~ 50 kDa) ve IgG antikor monomerlerine (~ 150 kDa) karşılık geldiği bir kütle histogramı ile sonuçlandı (Şekil 7). Daha önce yayınlanan kütle fotometrisi verilerine5 benzer şekilde, bağlanmamış türler belirginken, komplekslere karşılık gelen kütle aralıklarındaki zirveler çok daha az belirgindi.
Deney, kütle fotometrisi ölçümünden hemen önce karışımı gerekli konsantrasyona seyreltmek için hızlı seyreltme mikroakışkan bir sistem kullanılarak tekrarlandı. Bu yaklaşım, manuel seyreltme adımı sırasında ayrışmış olabilecek ek düşük afiniteli komplekslerin tespit edilmesini sağladı. Manuel seyreltme deneyi sırasında kullanılan aynı 2000x seyreltme faktörünü elde etmek için, 1:10 numune karışımı (IgG için 2 μM konsantrasyonda ve FcRn için 20 μM konsantrasyonda) mikroakışkan çip üzerine 0.5 μL/dk hızında akıtıldı, PBS tamponu (pH 5.0) ile birlikte 1 mL/dk'lık bir akış hızında. Ölçüm sırasında proteinlerin bozulmadığından emin olmak için, numunelerin 120 dakika inkübasyonunu takiben mikroakışkan sistem ile akış altında IgG (2 μM) ve FcRn (20 μM) ölçüldü. Bireysel kontrol ölçümleri protein bozulması göstermedi (Ek Şekil 1)
Hızlı seyreltme uygulanan numune için, FcRn monomerlerine (53 kDa), FcRn dimerlerine (97 kDa) ve IgG monomerlerine (148 kDa) karşılık gelen pikler tekrar gözlemlenebilir. Ayrıca, 196 kDa ve 251 kDa'da, 1:1 ve 1:2 stokiyometrili IgG-FcRn komplekslerine karşılık gelen iki ek tepe açıkça gözlenmiştir (Şekil 7). Bu iki kompleks için beklenen kütleler sırasıyla 200 kDa ve 250 kDa idi. Kütle ölçümündeki değişkenlik, bu çalışmada kullanılan kütle fotometresi için ölçüm hatası dahilindedir, ±5%14'tür (1:1 kompleks için %2 ve 1:2 kompleks için %0,4).
Bu komplekslerin sadece hızlı bir şekilde seyreltilmiş numunede bulunması, daha düşük konsantrasyonlarda, manuel bir seyreltme işlemine göre hızlı, ancak mikroakışkan sistem15 ile elde edilen hızlı seyreltme işlemine göre yavaş bir oranda ayrışma eğiliminde oldukları fikriyle tutarlıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig01.jpg"> Şekil 1: Mikroakışkanların kütle fotometrisi ile birleştirilmesi. (A,B) Bu protokolde kullanılan mikroakışkan kutusu, (A) ön ve (B) üstten görüldüğü gibi. Temizleme solüsyonları 1-3 pozisyonlarına, numuneler ve kalibrantlar ise 4-6 pozisyonlarına yerleştirilir. Tüm çözümler, "Küçük" akış birimi sensörüne bağlı olan m-switch'e bağlanır. (C) Tüm sisteme genel bakış. Bilgisayar (sol üst), mikroakışkan kutusuna (tampon ve numune tüplerinin yanında gösterilmiştir) ve mikroakışkan çipinin bulunduğu kütle fotometresine (sağ altta) bağlanır. Küçük akış hızı monitörü (FRMS) numune hattındaki akışı izlerken, büyük akış hızı monitörü (FRML) tampon akışını izler. Numune ve tampon hattı borusu, kütle fotometresinin içine yerleştirilmiş mikroakışkan çip üzerindeki bir kanala bağlanır. (D) Her çipin üç kanalı vardır. FRMS, numune girişine ve FRML tampon girişine bağlanır. Karıştırıcı alanı, hızlı numune seyreltmesinin gerçekleştiği yerdir, gözlem alanı ise kütle fotometrisi ölçümlerinin yapıldığı yerdir. Çipte sızıntı olmadığından emin olmak için çıkış, ek bir akış sensörü tarafından izlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig02.jpg"> Şekil 2: Mikroakışkan kontrol yazılımı. Bu yazılımla, akış hızlarını, mikroakışkan sistemin basınç hatlarını ve çoklu anahtarın (m-anahtarı) konumunu ayarlayın ve izleyin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig03.jpg"> Şekil 3: Yağdaki kabarcıkların varlığının belirlenmesi. Veri toplama yazılımından alınan örnekler, daldırma yağında hava kabarcıklarının varlığını gösteren net, kesintisiz bir odak halkasını (solda) ve 'kırık' bir halkayı (sağda) göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig04.jpg"> Şekil 4: Molekül iniş olaylarının sayısının çok az, ideal veya çok fazla olduğu numune konsantrasyonlarının temsili örnekleri. Mikroakışkanlar çipindeki gözlem alanının yüzeyine inen moleküller, kütle fotometrisi görüntüsünün oransal görünümünde karanlık noktalar olarak görünecektir. Optimal olarak, istenen konsantrasyon, veri toplama sırasında (ortada) ideal bir iniş olayı yoğunluğunun gerçekleşmesini sağlamalıdır. İniş olayı yoğunluğu çok düşükse (üstte, 'Çok az'), kütle fotometrisi verilerinin doğru istatistiksel analizi tamamlanamaz. Çok yüksekse (altta, 'Çok fazla'), iniş molekülleri uzamsal olarak üst üste binecek ve bu da düşük veri kalitesine neden olacaktır. Bu görüntüler, bir kütle fotometresi kullanılarak veri toplama yazılımı ile yakalandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig05.jpg"> Şekil 5: Kütle fotometrisi için veri analiz yazılımının ekran görüntüsü. Burada, veri toplama yazılımından dışa aktarılan .mp dosyaları, verileri analiz etmek için yüklenebilir. İşlenen verilerden rakamlar oluşturulabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig06.jpg"> Şekil 6: Bu deney için kütle kontrast kalibrasyonunun ekran görüntüsü. Kullanılan kalibrant, üç tür oluşturduğu bilinen β-Amilaz idi: monomer (56 kDa), dimer (112 kDa) ve tetramer (224 kDa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65772/65772fig07.jpg"> Şekil 7: Kütle histogramları, yalnızca hızlı numune seyreltmesinden sonra karmaşık oluşumu ortaya çıkarır. Kütle histogramları ve karşılık gelen en uygun Gauss dağılımları, manuel seyreltme (turuncu) veya mikroakışkanlarHC sistemi (mavi) yoluyla hızlı seyreltmeyi takiben IgG ve FcRn içeren numunelerin ölçümleri için gösterilmiştir. Kütle etiketleri, Gauss eğrilerinden elde edilen ortalama değerlerin, hızlı seyreltmeden sonra ölçülen kütle histogramlarına uyduğunu gösterir. Manuel seyreltmeden sonra, FcRn monomerlerine (manuel seyreltme ile ölçüldüğü gibi 52 kDa) ve IgG monomerlerine (152 kDa) karşılık gelen pikler gözlendi. Hızlı seyreltmeden sonra, FcRn ve IgG monomerlerine ek olarak, 1: 1 ve 1: 2 stokiyometri ile FcRn dimerlerine ve IgG-FcRn komplekslerine karşılık gelen pikler de açıkça gözlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/65772fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Veriler Şekil 1: Hızlı seyreltmeden sonra kontrol numunelerinin kütle fotometrisi ölçümleri, protein bozunması göstermez. (A) Yalnızca FcRn numunesi için kütle histogramı ve en uygun Gauss dağılımı. Hızlı seyreltmeden önceki ilk numune konsantrasyonu 20 μM idi ve akış hızı 0,5 μL/dk olarak ayarlandı. FcRn monomerlerine (53 kDa) ve FcRn dimerlerine (97 kDa) karşılık gelen kütle zirveleri gözlenebilir. (B) Sadece IgG (Herceptin) numunesi için kütle histogramı ve en uygun Gauss dağılımı. Hızlı seyreltmeden önceki ilk numune konsantrasyonu 2 μM idi ve akış hızı 1 μL/dk olarak ayarlandı. IgG monomerine (155 kDa) karşılık gelen tek bir kütle zirvesi gözlemlenebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65772/Supplementary%20Data%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry at JoVE.com

Bu protokol, düşük afiniteli protein-protein etkileşimlerini araştırmak için kütle fotometrisini yeni bir mikroakışkan sistemle birleştirir. Bu yaklaşım, düşük afiniteli ölçümleri mümkün kılan ve kütle fotometrisinin uygulanabilirliğini genişleten çözelti içindeki yüksek konsantrasyonlu komplekslerin hızlı bir şekilde seyreltilmesine dayanmaktadır.

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without ...

Bu protokol, düşük afiniteli protein komplekslerini analiz etmek için tamamen yeni bir yol göstermektedir. Araştırmacıların, daha önce genellikle çok zor ve hatta imkansız olan, zayıf veya geçici olduklarında bile belirli protein etkileşimlerini tespit etmelerine ve karakterize etmelerine olanak tanır. Protein etkileşimleri hücre fonksiyonu için çok önemlidir, ancak bunları tespit etmek ve ölçmek zor olabilir.Kütle fotometrisi, protein kompleksi oluşumunu ölçmek için harika bir araçtır, ancak seyreltik örneklerle sınırlamaları vardır. Bu sorunu MassFluidix ile çözüyoruz. Ele aldığımız araştırma boşluğu, bilim adamlarının çözeltideki proteinler arasındaki düşük afiniteli etkileşimleri nasıl güvenilir bir şekilde karakterize edebilecekleridir.Yaklaşımımızın avantajları, etiketlere veya immobilizasyona ihtiyaç duymadan çözelti içinde zayıf protein etkileşimlerini aramanıza izin vermesidir. Böylece araştırmacılar, ilgilendikleri proteinleri ve nasıl etkileşime girdiklerini, baktıkları sistemi bozduklarından endişe etmeden gözlemleyebilirler.

analysis-protein-complex-formation-at-micromolar-concentrations

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

1.3K Görüntüleme.  Refeyn Ltd.. Bu protokol, düşük afiniteli protein komplekslerini analiz etmek için tamamen yeni bir yol göstermektedir. Araştırmacıların, daha önce genellikle çok zor ve hatta imkansız olan, zayıf veya geçici olduklarında bile belirli protein etkileşimlerini tespit etmelerine ve karakterize etmelerine olanak tanır. Protein etkileşimleri hücre fonksiyonu için çok önemlidir, ancak bunları tespit etmek ve ölçmek zor olabilir.Kütle fotometrisi, protein kompleksi oluşumunu öl...

Video: Yazar Gündemi: MassFluidix Teknolojisi Kullanılarak Çözeltideki Düşük Afiniteli Protein Etkileşimlerinin Karakterizasyonu

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without labels. Mass photometry is generally suited to analyzing samples in the 100 pM-100 nM concentration range. However, in many biological systems, it is necessary to measure more concentrated samples to study low-affinity or transient interactions. Here, we demonstrate a method that effectively expands the range of sample concentrations that can be analyzed by mass photometry from nanomolar to tens of micromolar. 
In this protocol, mass photometry is combined with a novel microfluidics system to investigate the formation of protein complexes in solution in the micromolar concentration range. With the microfluidics system, users can maintain a sample at a desired higher concentration followed by dilution to the nanomolar range - several milliseconds prior to the mass photometry measurement. Due to the speed of the dilution, data is obtained before the equilibrium of the sample has shifted (i.e., dissociation of the complex). 
The technique is applied to measure interactions between an immunoglobulin G (IgG) antibody and the neonatal Fc receptor, showing the formation of high-order complexes that were not quantifiable with static mass photometry measurements. 
In conclusion, the combination of mass photometry and microfluidics makes it possible to characterize samples in the micromolar concentration range and is proficient in measuring biomolecular interactions with weaker affinities. These capabilities can be applied in a range of contexts - including the development and design of biotherapeutics - enabling thorough characterization of diverse protein-protein interactions.

This protocol combines mass photometry with a novel microfluidics system to investigate low-affinity protein-protein interactions. This approach is based on the rapid dilution of highly concentrated complexes in solution, which enables low-affinity measurements and broadens the applicability of mass photometry.