Antikorlar rutin olarak laboratuvar tekniklerinde kullanılır ve tedavi ve tanı uygulamaları hızla genişlemektedir. Hızlı ve doğru antijen-antikor bağlama karakterizasyonu bu uygulamalar için kritik öneme yöneliktir. Kitle fotometrisi, son derece az miktarda malzeme kullanarak bağlayıcı yakınlıkları hızla ölçer.
Etiketleme veya immobilizasyon gerekmez ve aynı deneyden protein oliomerizasyonu ve saflığı hakkında bilgi elde edilebilir. Bu protokol sadece antikorları incelemek için değil, aynı zamanda 50 kilodaltondan daha büyük moleküler kütlesi olan proteinler için güçlü protein-protein bağlarını ölçmek için de kullanılabilir. Yumuşak uçlu forceps kullanarak başlayın ve sırayla damıtılmış su, etanol, distile su, izopropanol ve distile su ile yukarıdan aşağıya 24 tarafından 50 milimetre kapakları durulayın şişeleri yıkayın.
Son yıkamadan sonra, coverplardan kontaminasyonakmasını önlemek için kapakları aynı yönde temiz bir azot akışı ile kurulayın. 24 by 24 milimetrelik kapakları, gösterildiği gibi distile su ve etanol ile durulayın ve ardından temiz bir azot akışı ile kurutun. Kuruduktan sonra, alüminyum folyo bir parça üzerine 24 tarafından 24 milimetrelik coverslip yerleştirin ve coverslip üzerine çift taraflı bant şeritler yerleştirin.
Daha sonra 24'ü folyodan 24 milimetrelik kapak kesip 24'ün 50 milimetrelik kapak lının çalışma tarafına hafifçe bastırın. Afinite ölçümleri için antikor-antijen örnekleri hazırlamak için, toz partiküllerini ve agregalarını temizlemek için 0,22 mikron luk şırınga filtresinden en az iki mililitre PBS filtre uygulayın ve antikor ve antijen stoklarını santrifüj edin. Gerçek konsantrasyonlarını belirlemek için antikor ve antijen stoklarının 280 nanometre UV emiciliğini ölçün ve numune başına 50 mikrolitrelik son hacimde uygun antijen konsantrasyonları aralığında antikor-antijen karışımları bir titrasyon serisi hazırlayın.
Daha sonra antijen-antikor karışımlarını oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika kuluçkaya yatırarak bağlayıcı reaksiyonun kimyasal dengeye ulaşmasını sağlar. Antikor-antijen afinitesini kitle fotometrisi ile değerlendirmek için, alet hedefine bir damla mikroskop daldırma yağı uygulayın ve akış odasını mikroskop aşamasına yerleştirin. Akış odası kanalının bir ucuna 10 mikrolitre filtrelenmiş PBS ekleyin.
Arabellek kapiller eylem ile kanala girer. Veri toplama yazılımının odak denetim sekmesinde, ilk ayarlamaları yapmak için kaba sahne hareketini yukarı ve aşağı düğmelerini kullanın ve netlik sinyali okumasını görüntülemek için netliği tıklatın. Netlik değerini en üst düzeye çıkarmak için ince yukarı ve aşağı ayarlama düğmelerini kullanın ve odak izleme işlevini etkinleştirmek için odak ve kilit odağı'nı tıklatın.
Temiz bir slayt görüntüsü, gösterildiği gibi ilk antikor-antijen örneğinin %0,05'ine eşit veya altında bir sinyal değerine sahip olmalıdır ve sıvıyı küçük bir parça leke kağıdıyla diğer uçtan blotlamalıdır. Yüklemeden hemen sonra, 100 saniyelik verilere eşdeğer uygun kare sayısını elde etmek için kaydı tıklatın. Veri toplama döneminin sonunda, veriler için bir dosya adı girin ve Tamam'ı tıklatın, ardından dosyayı kaydetmek için örnek alın.
Kitle fotometri verilerini analiz etmek için ilgi dosyasını açın ve analiz et'i tıklatın. Kalibrasyon işlevini yüklemek için yükle'yi tıklatın ve analiz edilen verileri kaydetmek için dosyayı tıklatın ve sonuçları kaydedin. Örnekteki her türün göreceli konsantrasyonlarını elde etmek için, uygun olayları açın.
csv dosyası, uygun çizim ve analiz yazılımı içine Sütun M verileri kopyalamak ve moleküler kütle dağılımı arsa için çizim istatistikleri histogram fonksiyonu kullanın. Çizim özellikleri penceresini açmak, otomatik binning'i devre dışı bırakıp 2,5 kilodalton büyüklüğünde bir depo gözü seçmek için histograma çift tıklayın. Veri kutusu merkezlerini oluşturmak ve verileri saymak için uygula ve git'i tıklatın.
Histogramı Gaussian işlevlerine sığdırmak için, depo gözü merkezlerini ve sütunları sayar ve analiz zirvelerini ve taban çizgisi çoklu tepe sığması menü işlevini tıklatın. Dağıtım çizimindeki yaklaşık tepe konumlarını belirtmek için çift tıklatın ve NL sığmasını açın'ı tıklatın. XC tepe merkezleri için sabit onay kutularını kontrol edin ve değerlerini serbest antikor ve tek ve çift antijen-antikor komplekslerinin beklenen moleküler kütlelerine ayarlayın.
Genişlik parametreleri için paylaşım seçeneğini işaretleyin ve sığdır'ı tıklatın. Gaussian bileşenlerinin donatılmış tepe yükseklik değerleri, numunedeki her türün göreceli konsantrasyonunu temsil eder. Sonra en yüksek yükseklik değerlerinden her türün konsantrasyon fraksiyonu hesaplamak için denklemi kullanın.
Elektronik tablolama programı kullanarak denge sabitlerini hesaplamak için dissociation constant calculation'ı açın. xlsx çalışma sayfası. Bu çalışma sayfasında, 1 ile 10 arasındaki satırlarda sarı vurgulanan hücre değerleri denge sabithesaplamaları gerçekleştirmek için değiştirilebilir.
Nanomolar birimlerdeki tahmini dissosiasyon sabit değerlerini B1 ve B2 hücrelerine girin. Tahmini ayrışma sabit değerleri bilinmiyorsa, B1 ve B2 hücrelerindeki varsayılan değerleri değişmeden bırakın. Nanomolar birimlerdeki toplam antikor ve toplam antijen konsantrasyonlarını D2 ve E2 hücrelerine girin ve her tür için hesaplanan kesir değerlerini F2, G2 ve H2 hücrelerine girin. Titrasyonun genel analizini gerçekleştirirken, uygun veri fraksiyonu değerlerini 2 ile 10 satır arasında ekleyin. Çözücü parametreleri penceresinde, değişken hücre kutusunu değiştirerek ayarlanan hedef kutusu için B15 hücresini ve B1'den B2'ye kadar olan hücreleri seçin.
Seçeneği için min düğmesini seçin ve negatif olmayan denetim kutusu ile sınırlandırılmamış değişkenleri yapınseçeneğini işaretleyin, ardından çözme yöntemi olarak GRG doğrusal olmayanı seçin ve çöz'e tıklayın. En uygun dissosyasyon sabit değerleri B1 ve B2 hücrelerinde gösterilir. Ve kare hataların son toplamı B15 hücresinde gösterilir. Bu temsili deneyde, antijen-antikor karışımlarının moleküler kütle dağılımlarını ve sadece antikor örneğini elde etmek için sabit 25 nanomolar konsantrasyonve 0, 7.5, 15, 30, 60 ve 120 nanomolar insan alfa-trombin konsantrasyonlarında anti-insan trombin antikor içeren bir titrasyon serisi yapılmıştır.
Gaussian bileşenlerinin en uygun tepe yükseklik parametreleri tür konsantrasyon fraksiyonları elde etmek için normalleştirildi. Konsantrasyon fraksiyonu değerleri daha sonra antijen-antikor bağlayıcı afiyetleri elde etmek için küresel olarak uygun edildi. Deneysel konsantrasyon fraksiyonları ve serbest antikor için küresel uyum sonuçları, tek antijen-antikor kompleksi, ve çift antijen kompleksi daha sonra çizilmiş olabilir.
Doğru KD değerlerini elde etmek için, protein konsantrasyonlarının tüm reaksiyon türlerini doldurmak için dikkatle seçilmesi gerekir. Bir dizi antijen konsantrasyonu kullanarak bir titrasyon serisi hazırlamanızı öneririz. Verileri donatttan sonra, hata yansıtma yöntemi montaj hatası elde etmek için kullanılabilir, ancak denemeyi yinelemek ve ortalama bağlama afinite değerlerinin standart sapmalarını hesaplamak daha iyidir.
