This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

NOT: Bu protokol açıklanan tüm hayvan prosedürleri Sağlık 26 National Institutes Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. protokol (MO13M391) Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Yenidoğan Fare Kurban, Diseksiyon ve Fiksasyon <ol><li> CO 2 inhalasyon yoluyla bir yenidoğan fare Kurban. </li><li> Hemen diz üstünde hindlimb kesti. Yaklaşık doğum sonrası güne kadar 7, bacak kemikleri bir kriostat sonradan bölüm büyük laboratuvar makas veya keskin bıçak ile kesmek için yeterince yumuşak ve. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit, 10 ml hindlimb yerleştirin. </li><li> Daldırma 4 ° C&#39;de 4-24 saat paraformaldehid hindlimb düzeltmek. Embriyonik doku sadece birkaç saat gerektirirtespitin s. <ol><li> Bu TÜNEL deneyi verimliliği azaltabilir gibi, 24 saat daha uzun tespit kaçının. </li></ol></li><li> Sukroz çözeltisi içinde daldırarak hindlimb cryoprotect. <ol><li> Aynı 15 ml tüp içinde, PBS içinde% 10 sakaroza paraformaldehit değiştirme, 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> PBS içinde% 30 sakroz Change, 4 ° C &#39;de veya borunun alt arka bacak lavabolar kadar gece boyunca inkübe edilir. Doku sükroz steril olarak filtreden geçirilmiş olması koşuluyla, daha uzun bir süre için% 30 sukroz içinde bırakılabilir. </li></ol></li></ol> 2. Doku Gömme <ol><li> Orta gömme ile etiketlenmiş gömme kalıp yarım doldurun. </li><li> Bir kalıp duvarına mümkün olduğu kadar yakın kesilmiş yüzü, gömülü maddenin üzerine hindlimb yerleştirin. Kalıbın dışına hindlimb yönünü işaretleyin. <ol><li> Birkaç arka ayakların göm ve aynı blokta kesti. Ancak, tüm hin sağlamak için önemlidirblokta dlimbs bacak ekseni boyunca seviyeleri eşleşen en bölümleri elde etmek için birbirlerine paralel yönlendirilmiştir. </li></ol></li><li> Orta gömme arka ayakların örtün. Orta dökerken arka ayaklarında vardiya halinde, künt uçlu forseps veya bir kürdan ile yeniden yönlendirin. </li><li> En az 15 dakika boyunca oda sıcaklığında doku sızmaya gömme orta izin verin. </li><li> Doğrudan kuru buz veya kuru buz üzerinde izopentanın yerleştirin kalıpları orta gömme dondurmak için. Her zaman kalıpları seviyede tutmak ve gömülü doku kaymasını önlemek için emin olun. </li><li> Birkaç aya kadar için kesmek için hazır olana kadar -80 ° C&#39;de dondurulmuş kalıpları tutun. </li></ol> 3. Cryosectioning Gömülü Uzuvlar <ol><li> -20 ° C&#39;ye ayarlayın kriyostat bölme sıcaklığı, -18 ° C malzeme sıcaklığında; Gerekirse aşağı nesne sıcaklığını ayarlamak. </li><li> En az 30 dakika boyunca kriyostat bölmesinde içindeki doku bloğu dengelenmesi. Doğru blok sıcaklığıerature bölümü kalitesi için çok önemlidir. </li><li> 10 um ya da daha az bir kalınlıkta enine kesitler halinde kesilmiştir. Kalın bölümler tamamen TUNEL reaktif nüfuz olmayacaktır. Anti-roll plaka, bıçak, bıçak ve açısını kullanın (tipik olarak 5 °) kriostat için tavsiye. </li><li> Oda sıcaklığında gelatin- veya vectabond kaplı cam lam üzerine bölümleri toplayın. Kuru buz üzerinde bir slayt kutuya hemen yerleştirin. Kol ulaşılabilecek kriostat yakınına yerleştirilen kuru buz ile ayrı bir kapta slayt kutusunu saklayın. <ol><li> 100-200 mikron atlama, ekstremitenin uzun ekseni boyunca enine seri bölümleri kesin. Her seri seviyesinde en az 3 komşu bölümleri toplayın. </li></ol></li></ol> Piyasada Satılan Kit kullanarak Arka ayağın Bölüm 4. TÜNEL Testi (oda sıcaklığında tüm adımları belirtilmediği sürece) <ol><li> Oda sıcaklığında ve kuru bir gecede ya da hafta sonu bölümleri ile slaytlar çözülme. </li><li> Immersin göre bölümleri rehydrateCoplin kavanoz, 2 x 10 dakika boyunca PBS g kayar. Bir laboratuarda Kuru mümkün olduğunca bölüm etrafında kadar sıvı kaldırarak, silin. </li><li> Permeabilize bölümler <ol><li> Olmayan bir proteolitik, saponin tabanlı ticari reaktif veya% 0.5 Tween20 ve% 0.05 PBS Triton X100 birini kullanın. </li><li> Bir nem odasına slayt yerleştirin. Yeterli su kutusunun alt kapağı için eklenen basit bir nem odası, sıkı kapaklı boş bir pipet ucu kutusu. </li><li> Bölümü kapsayacak şekilde slayt üzerine Pipet yeterli reaktif (50 ul yenidoğan fare bacaklarda için yeterlidir). Tekrarlanan ajitasyon slayt kaldırın bölümüne neden olabilir, bölüm doğrudan pipetle etmeyin. </li><li> Künt uçlu forseps kullanarak, reaktif damla yaymak için bölümün üstüne parafilm küçük bir dikdörtgen koyun ve tamamen bölümü kapsamaktadır. Herhangi kabarcıklar parafilmle altında formu, hafifçe kuru, onu kaldırın ve yeniden. </li><li> Permeabili ile slaytlar inkübekapalı bir nem odası içinde 1 saat boyunca yattığı reaktifi. Bölümler slayt kaldırın başlarsanız, permeabilizasyon süresi 30 dakikaya düşürülebilir. </li><li> Bir Coplin kavanoz 2 x 5 dakika PBS slaytlar yıkayın. Parafilm dikdörtgenler yukarıda kalması gerekir ve daha sonra çıkarılır ve atılır edilebilir. </li><li> Bir laboratuar kullanarak, mümkün olduğunca bölümler etrafında kadar sıvı kurutun wipe. </li></ol></li><li> TdT-aracılı DNA sonu etiketleme <ol><li> (50 ul yenidoğan fare bacaklarda için yeterlidir) doku bölümünü kapsayacak şekilde slayt üzerine 1x TdT etiketleme tampon, pipet yeterli etiketleme tampon yapmak için kit talimatlarını izleyin. 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. Alternatif olarak, bir coplin kavanoza TdT etiketleme tampon slayt batırmayın. </li><li> TdT etiketleme karışımı yapmak için kit talimatlarını izleyin. Kit, kobalt, magnezyum ve manganez katyonları içerir; manganez katyonu iskelet kası, sinir sistemi Tiss de dahil olmak üzere, çeşitli dokuların üzerinde çalışırdaah karaciğer, deri ve kemik. </li><li> Bir pozitif kontrol için, TdT etiketleme karışımı DNase (kit etiketli &quot;Nukleaz&quot;) ekleyin. Seçenek olarak ise, kiti talimatlarına göre, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca nükleaz tamponu içinde DNase ile pozitif bir kontrol bölümü ön-muamele. Çapraz bulaşmayı önlemek için uzak diğer deneysel bölümlerden DNaz çözüm ve DNaz-tedavi bölümleri tutun. </li><li> Bir negatif kontrol için, etiketleme karışımından TdT enzimi atlarsanız. </li><li> Bir laboratuar mümkün olduğunca slayt kadar TdT etiketleme tampon kaldırmak için mendil kullanın. Sürgü (bölüm başına 50 ul) üzerine pipetle TdT etiketleme karışımı, parafilm yeni bir dikdörtgen kapak, ve 1 saat süre ile 37 ° C&#39;de nem odasında inkübe edilir. </li><li> 1x durdurma tamponu yapmak için kit talimatlarını izleyin. Slayt TdT etiketleme karışımını uzaklaştırmak için bir temizleme laboratuar kullanın ve doku kesitinin 200-300 ul durdurma tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. Al<html> ternatively, bir Coplin kavanoza durdurma tamponu slayt batırmayın. </li><li> PBS slayt 2 x 2 dakika yıkayın. Bir laboratuar mümkün olduğunca slayt kadar PBS kaldırmak için mendil kullanın. </li></ol></li><li> Floresan etiketleme <ol><li> DNA kırıkları en dNTPs etiketlemek için floresan etiketleme çözümü hazırlamak için kit talimatlarını izleyin. Sürgü (bölüm başına 50 ul) üzerine pipetle çözeltisi, parafilm yeni bir dikdörtgen kapak ve 20 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. </li><li> Coplin kavanoza PBS içerisinde 2 dakika süre ile yıkayın kayar. Bir laboratuar slayt mümkün olduğunca PBS kaldırmak için mendil kullanın. </li><li> Slayt üzerine 1 mcg / ml PBS ve pipet Hoechst 33258 nükleer leke seyreltin (100-200 ul bölümünü kapsayacak yeterlidir). 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. </li><li> PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. </li><li> Antifade floresan montaj medya ile lamel ve tırnak cilası ile kenarları mühür. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Dijital Görüntü Alma <ol><li> DAPI, FITC, ve Texas Kırmızı filtreleri (veya eşdeğeri) ile geleneksel floresan mikroskop kullanılarak görüntü elde. Etiketleme başarılı oldu ve çekirdekler (bozulmamış veya parçalanmış) etiketli olduğunu doğrulamak için daha yüksek bir büyütme hedefi (20X veya 40X) kullanın. Bir 10X objektif TÜNEL pozitif puncta ölçülmesi için yeterlidir. </li><li> Bir görüntüde kombine üç ayrı yanlış renk kanalları gibi Hoechst boyama, TUNEL boyama ve autofluorescent sinyal görüntüleri toplayın. TÜNEL fluorofor etiketi ve kırmızı filtre, görüntü autofluorescent sinyali, yeşil ise tam tersidir. <ol><li> Sonraki eşikleme ve kantitatif için slaytlar arasındaki eşdeğer tüm görüntüleme ayarları saklayın. Her filtre, önceden ayarlanmış ve kayıt pozlama süreleri, kazanç ve binning için (hiçbir binning en iyisi); Otomatik pozlama veya kazanç ayarlarını kullanmayın. </li><li> En iyi niyet etme aralığını çekeceği pozlama ve kazanç ayarları bulmak için deneme-ve-hata kullanıntüm lekeli slaytlar arasında versiteler. Edinilen görüntülerde hiçbir doymuş piksel bu irade önyargı kantitatif olarak, olmadığından emin olun. </li></ol></li><li> Ilgi tüm kas grubunun görüntüleri çekmek. Bu arada &quot;dikişli&quot; olmak üzere birden çok görüntü gerektirebilir. </li></ol> 6. Görüntü Analizi <ol><li> TÜNEL boyama dijital görüntülerini analiz etmek piyasada mevcut görüntü analiz programları kullanın. Ticari yazılım kullanarak analiz burada gösterilmektedir. Alternatif olarak, NIH ücretsiz yazılım ImageJ TÜNEL boyama analiz etmek için kullanılabilir. </li><li> Hematoksilen ve eosin (H &amp; E) ile TÜNEL-lekeli bölümüne bitişik bir bölüm Leke ve geleneksel aydınlık mikroskop ile tam bölüm dijital görüntü almak. Sayısal olarak anatomik yapıları izlemek için bir anatomi atlası 5,18,19 ile birlikte bu H &amp; E görüntüyü kullanın. </li><li> TÜNEL kanalı kapalıyken, elle kullanırken, sayısal alanın anahat izHoechst ve rehberlik için otofloresansı kanalları. Bir maske içine izlenen alana dönüştürmek (seçilen piksel bir dizi analiz edilecek koordinatları). </li><li> TÜNEL kanalı açın. Görüntü analiz programı işlevini eşikleme yoğunluğu kullanarak, tüm otofloresans sinyalini dışlamak için alt eşiğini ayarlayın. </li><li> Çalışma kümesindeki tüm görüntüleri aynı eşik ayarlarını uygulayın. Maskeler içine eşiklenir seçimleri dönüştürün. </li><li> Her görüntü için, kas alanı maskesi ve maske TÜNEL birleştirir. Yeni kombinasyon maskesi sadece takip kas alanı içinde TÜNEL sinyalini temsil edecek. </li><li> Nesnelerin sayısını belirlemek ve takip kas alanı içinde TÜNEL sinyali alan nesne kombinasyon maske maske kantitatif gerçekleştirin. ImageJ Parçacık Analyzer işlevini kullanarak bu gerçekleştirin. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bir yöntem algılamak ve nicel olarak açıklanan fare iskelet kasında DNA hasarı ile ilişkili apoptozu analiz etmek. Prosedür doku hasadı, TUNEL boyama, dijital görüntü alımını ve görüntü analizi içerir. Ortak histolojik malzemeler ve aletler gereklidir, ve özel ticari TÜNEL kiti gereklidir. gerekli temel büyük ekipman öğeleri Kriyostaz, dijital görüntü özelliğine sahip epifluorescent mikroskop ve görüntü analizi için bir bilgisayar sistemi vardır. deneyci po...

Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) dUTP çentik uç etiketleme (TÜNEL) dUTP 3 bağlamak için TdT enzim kullanılarak işlemidir &#39;çift ve tek bükümlü DNA 12,23 sonları arasında sona erer. Apoptoz ve DNA hasarının tespiti için TÜNEL metodu ilk Gavrieli ve ark. 1,12,24 tarafından, 20 yıl kadar önce bildirildi. O zamandan beri değerlendirilir ve farklı doku hazırlıkları 7,23,27,40 optimize edilmiştir. TÜNEL nöronlar 6,14,29 ve 43,44 kardiyomiyositlerde ve iskemiye bağlı hücre ölümü, eksitotoksik nöronal hücre ölümünü 30,31 incelemek için kullanılan ve artrit tedavisinde 39 bir biyolojik olarak edilmiştir. Aynı zamanda, çeşitli insan kanserlerinde 2,3,15,32,37,38,42 bir prognostik faktör ve tümör hücre markeri olarak kullanılmıştır. Alternatif yöntemler DNA hasarı ve hücre ölümü tespiti için var, ama onlar, teknik zorlukları ve uyarılar var. Southern lekeleme quantif için kullanılabilmektedirY bir DNA tam doku lysate&#39;lerin 7,9-11 hasar, ancak bu yöntem hücre düzeyinde çözümlemesi sağlamak ve ölçmek için zor değildir. kuyrukluyıldız tahlil hücrelerinden 4,20,28,36 korunmuş çekirdekleri ayıklanan gerektiren bir alternatif hücre tabanlı bir yöntemdir. Kuyrukluyıldız tahlil kültüre izole hücreler üzerinde iyi çalışır rağmen, iskelet kas dokusunda 8,21 den sağlam çekirdekleri hazırlamak için çok daha zordur. Güney blot gibi, kuyrukluyıldız tahlil bütün kas dokusu homojenattan hücre türüne özgü bilgi vermemektedir. TÜNEL yöntemiyle için başka bir alternatif, tek kordonlu DNA 25,33,41 karşı veya DNA hasarına ve hücre ölümü yolları (örneğin, p53, H2AX ve Kaspaz) 13,17,22,40 katılmak proteinlerine karşı antikorlar kullanılarak immunohistokimyasal olup. Bu gibi antikor bazlı yöntemler, yüksek bir sinyal-arka oranını elde etmek için antikorların tam karakterizasyon ve mükemmel antikor özelliklerini gerektirir. Hatta zaman spectüpte antikorlar antijen alma prosedürleri 34,35 ile hedef proteinin denatürasyon gerektirebilir, mevcuttur. Burada tartışmak gibi, kabul edilemeyecek kadar yüksek otofloresans kas dokusu sonuçlarında antijen alma. Alternatif yöntemlerin aksine, TUNEL basit pozitif ve negatif kontroller, iyi doku penetrasyonu antijeni alma gerektirmez ve hücresel düzey çözünürlük ile test edilebilir bir yüksek sinyal ve düşük arka plan, mükemmel özgüllük ile DNA hasarı algılama ulaşır. Alternatif yöntemler, tipik olarak gece boyunca inkubasyon gerek duyması karşısında ek olarak, TÜNEL metodu, işlemin tamamlanması için yaklaşık 4 saat sürer. Biz Hsieh-Li ve arkadaşları 16 tarafından oluşturulan spinal müsküler atrofi (SMA) 10 bir fare modelinde iskelet kas hücresi ölümünü incelemek. Kas hücreleri apoptotik ölçmek için, farklı Skele genelinde sağlam çalışır doku hazırlanması, boyama ve kantitatif bir yöntem geliştirdikFarelerde farklı gelişimsel zaman noktalarında tal kas grupları. Biz piyasada mevcut TÜNEL-etiketleme kiti ve ticari olarak satılan görüntü analiz yazılımı kullanmak. Biz de başarıyla omurilik 10 immunofluorescent boyama birlikte TÜNEL tahlili kullandık. Burada tarif edilen yöntemler, iskelet kası, doku patolojisi, hastalığın mekanizmaları, yaşlanmanın mekanizmasını ve gelişim (uygulama öncesi ve sonrası), hücre ölümünü değerlendirmek isteyen araştırmacılar için yararlıdır. TÜNEL tekniği hücrelerinin sadece bir alt grubu, etkilenen ve hücresel düzeyde çözünürlüğü gereklidir modeli sistemlerinde DNA hasarı tamir ve hücre ölümünün çalışmalar için özellikle yararlıdır. Bu video diseksiyon, doku işleme, kesit ve fare iskelet kası flüoresan bazlı TÜNEL etiketleme tarif etmektedir. Aynı zamanda, yarı otomatik TÜNEL sinyal sayımı için bir yöntem tarif etmektedir.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td>For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &amp;deg;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Embedding medium for cryosectioning.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &amp;mu;m sections may be used.</td></tr><tr><td>Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Slides from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 &amp;deg;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td></tr><tr><td>Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td><td>Sigma</td><td>243361</td><td>Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td></tr><tr><td>Vectabond tissue adhesion reagent</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT fluorescein &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; apoptosis detection kit</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td></tr><tr><td>DNase/nuclease</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>DNase/nuclease buffer</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>DNase-free water</td><td>Quality Biologicals</td><td>351-029-131</td><td>Water from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>multiple</td><td>807</td><td>Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope with digital camera</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td></tr><tr><td>Vectashield antifade media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Antifade media from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>glass coverslips, No.1 thickness</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.</td></tr></tbody></table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Başarılı boyama ile, TÜNEL-pozitif sinyal yoğunluğu eşik ayarlayarak otofloresansı izole etmek yeterince parlak olmalıdır. Düşük büyütme TUNEL-pozitif nesneler iskelet kası (Şekil 1A) olarak parlak düzensiz parçaları görünebilir. Ilgili hücre ölümü türü apoptoz (Şekil 1B) ise, ancak daha yüksek bir büyütmede, klasik apoptotik morfolojisi olan bir TÜNEL pozitif amaçları, takip edilmelidir. pozitif kontrol (DNaz ilave edilir) bölümü (Şekil 1C...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method at JoVE.com

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Fare İskelet Kası Algılama ve DNA Hasar Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; TÜNEL Yöntemiyle

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

detection-analysis-dna-damage-mouse-skeletal-muscle-situ-using-tunel

Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.2K Görüntüleme.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

Video: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Gelişim Biyolojisi

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

Kas hastalığının yapısal temelini Incelemek için bir araç olarak bozulmamış Murine Iskelet kasının X-ışını kırması

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Farelerin Profaz Tutuklu Oositlerinde DNA Hasarının Belirlenmesi

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Yazar Spotlight: Memeli Oositlerinde ve Preimplantasyon Embriyolarında DNA Hasar Tepkisini Anlamak 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Biyoloji

CUT &#38; Tag Kullanarak Fare Miyoblastlarında Genomik Histon İşaretlerinin Profillenmesi

Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myoblast Research

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile the genomic locations of chromatin binding factors, histone marks, and histone variants. CUT&amp;Tag protocols function very well with mouse myoblasts and freshly isolated muscle stem cells (MuSCs). They can easily be applied to many other cell types as long as the cells can be immobilized by Concanavalin-A beads. Compared to CUT&amp;Tag, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are time-consuming experiments. ChIP assays require the pre-treatment of chromatin before the chromatic material can be used for immunoprecipitation. In cross-linking ChIP (X-ChIP), pre-treatment of chromatin involves cross-linking and sonication to fragment the chromatin. In the case of native ChIP (N-ChIP), the fragmented chromatins are normally achieved by Micrococcal nuclease (MNase) digestion. Both sonication and MNase digestion introduce some bias to the ChIP experiments. CUT&amp;Tag assays can be finished within fewer steps and require much fewer cells compared to ChIPs but provide more unbiased information on transcription factors or histone marks at various genomic locations. CUT&amp;Tag can function with as few as 5,000 cells. Due to its higher sensitivity and lower background signal than ChIPs, researchers can expect to obtain reliable peak data from merely several millions of reads after sequencing.

Yazar Spotlight: Kas Kök Hücre Çalışmalarında Zorluklar ve Yenilikler Arasında Gezinmek

Researchers new to the epigenetic field will find CUT&amp;Tag a significantly easier alternative to ChIP assays. CUT&amp;Tag has tremendously benefited the epigenetic studies on rare and primary cell populations, generating high-quality data from very few cells. This protocol describes performing H3K4me1 CUT&amp;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles.

Fare Miyoblast Araştırmalarında Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme (CUT &#38; Tag) Testinin Kullanılması

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile ...

Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle mass and strength in healthy individuals and in patient populations. There is a need for precision rehabilitation tools to test the safety and effectiveness of PRT to maintain and/or restore muscle mass and strength in preclinical studies on small and large animal models. The PRT methodology and device described in this article can be used to perform dosage-adjusted resistance training (DART). The DART device can be used as a standalone dynamometer to objectively assess the concentric contractile torque generated by the ankle dorsiflexors in mice or can be added to a pre-existing isokinetic dynamometry system. The DART device can be fabricated with a standard 3D printer based on the instructions and open-source 3D print files provided in this work. The article also describes the workflow for a study to compare contraction-induced muscle damage caused by a single bout of DART to muscle damage caused by a comparable bout of isometric contractions (ISOM) in a mouse model of limb-girdle muscular dystrophy type 2B/R2 (BLAJ mice). The data from eight BLAJ mice (four animals for each condition) suggest that less than 10% of the tibialis anterior (TA) muscle was damaged from a single bout of DART or ISOM, with DART being less damaging than ISOM.

The present protocol describes a unique technique called dosage-adjusted resistance training (DART), which can be incorporated into precision rehabilitation studies performed in small animals, such as mice.

Kas hasarı riski azaltılmış farelerde dozaj ayarlı direnç eğitimi

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle ...

Fare İskelet Kası Algılama ve DNA Hasar Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Kas hastalığının yapısal temelini Incelemek için bir araç olarak bozulmamış Murine Iskelet kasının X-ışını kırması

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Fare Miyoblast Araştırmalarında Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme (CUT & Tag) Testinin Kullanılması

Fare Miyoblast Araştırmalarında Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme (CUT & Tag) Testinin Kullanılması

Fare Miyoblast Araştırmalarında Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme (CUT & Tag) Testinin Kullanılması

Kas hasarı riski azaltılmış farelerde dozaj ayarlı direnç eğitimi