Biz önemli ölçüde arka plan azaltmak için daha önce yayınlanmış RiboTag yöntemi geliştirdik. Bu bir analiz açısından basit ve çok daha az maliyetli bir mutant sistemi gibi karmaşık modellere uygulama yapar. Deneysel hayvan üretimi dışında, RiboTag yöntemi ribozom ilişkili mRNA'ları analiz etmek için diğer yöntemlere göre çok daha kolay ve daha basittir.
Tüm RNA deneyleri gibi, sıkı RNase serbest koşullar başarı için temeldir. RNA ile sınırlı deneyiminiz varsa, önce temel bir RNA çıkarma işlemi gerçekleştirerek koşullarınızı kontrol edin ve sonra devam edin. Prosedürü gösteren Lauren Chukrallah, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.
Homojenizasyon tamponu hazırlamak için, pH 7.4'te bir azı dişi tris 2.5 mililitre, bir azı dişi potasyum klorür beş mililitre, bir azı kaşığı magnezyum klorür 600 mikrolitre ve 50litrelik bir tüp mp40 500 mikrolitre ekleyin. Hacmi 50 mililitreye çıkarmak için tüpe diethyl pyrokarbonat ile işlenmiş su ekleyin ve tüm bileşenler dahil olana kadar karıştırın. Yüksek tuz yıkama tampon hazırlamak için, pH 7.4 bir azı dişi tris 2.5 mililitre ekleyin, bir molar potasyum klorür 15 mililitre, bir azı lı magnezyum klorür 600 mikrolitre, ve 50 mililitrelik bir tüp MP40 500 mikrolitre.
Diethyl pyrocarbonate ile işlenmiş su 50 mililitre hacmine getirin ve tüm bileşenleri dahil olana kadar karıştırın. Tüm numune tüplerini önceden tartın, ağırlığı kaydedin ve sıvı nitrojende önceden soğutun. Önceden soğutulmuş steril harç, havaneli ve kuru buz üzerinde spatula tartma.
Sonra kuru buz üzerinde, büyük parçalar halinde flaş dondurulmuş doku örnekleri kırmak ve ince bir toz içine yavaş yavaş öğütmek için önceden soğutulmuş steril harç ve havaneli kullanın. Önceden soğutulmuş spatula kullanarak, mümkün olduğunca kuru buz üzerinde tutmak için özen bir önceden soğutulmuş toplama tüpü içine harç toz kazıyın. Tüpü doku tozuyla tartın.
Tüpün ilk ağırlığını tüpün ağırlığından, içinde örnek olan tüpün ağırlığından çıkararak doku kütlesini hesaplayın. Lysis arabellek birimlerinin daha sonraki hesaplaması için bu değeri kaydedin. Homojenizasyon tampon dithiothreitol, RNase inhibitörü, Sikloheximid, heparin ve bir proteaz inhibitörü tablet içine ekleyerek lysis tampon hazırlayın.
Tüm bileşenler biraraya gelip kullanıma kadar buzda tutun. Her 100 miligram lık numune için bir mililitre likit arabellek ekleyin. Lysis tamponu eklemek için kullanılan aynı pipet ile, hücreleri parçalamak ve karıştırmak için yukarı ve aşağı lysate dikkatlice pipet.
Numune artık viskoz olana kadar genellikle 25-30 vuruş için pipetleme devam edin. 10 dakika boyunca buz üzerinde lyse için örnekleri ayarlayın. Daha sonra numuneleri önceden soğutulmuş bir santrifüjde 10,000 kez 10 dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün.
Tüpün alt kısmında büyük bir gevşek bulutlu pelet oluşur. Pelet rahatsız etmemeye dikkat, yeni bir tüp içine lysate toplamak ve her örnek için hacmi kaydedin. Numune bozulmasını önlemek için, numunelerin buzda veya mümkün olduğunda dört santigrat derecede depolayan kalan protokol boyunca serin kalmasını sağlayın.
Şimdi, uygun antikor bağlayıcı protein, protein G.Bir mililitre lysate ile birleştiğinde manyetik boncukların gerekli hacmini hesaplayın, mililitre başına 30 miligrama ulaşmak için 375 mikrolitre g boncuk kullanın. Boncuk çözeltisini manyetik bir tüp rafına 1,7 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Boncuk çözücüçıkarın ve boncuklar için taze lysis tampon eşit hacimli ekleyin.
Dört santigrat derecede 20 RPM'ye ayarlanmış bir tezgah üstü tüp rotatorda, tüpü yıkamak için beş dakika döndürün. Tüpü manyetik tüp rafına yerleştirin ve yıkama tamponunu çıkarın. Yıkamayı iki kez daha tekrarladıktan sonra, boncukları dengelemek için orijinal ses ekibe lysis tamponu ekleyin.
Kullanıma kadar dört santigrat derecede veya buz üzerinde saklayın. Her bir mililitre lysate için 50 mikrolitre liblibrated boncuk ekleyin ve bir saat boyunca dört derece santigrat döndürün. Sonra mıknatıs raf üzerine tüp yerleştirin ve taze bir tüp içine lysate toplamak.
Kullanılan boncukları atın. Lysate için, her bir mililitre için dengelendirilmiş boncuk 25 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca dört derece santigrat döndürün. Kalan dengede kalan protein G boncukları bir gecede dört santigrat derecede saklayın.
Sabahları, mıknatıs raf üzerine tüp yerleştirin ve taze bir tüp içine lysate toplamak. Kullanılan boncukları atın. Temizlenen lysate itibaren, örnek giriş kontrolü olarak 50 mikrolitre tutun.
Eksi 80 derecede saklayın. Temizlenmiş lysate her bir mililitre için, anti-HA antikor beş mikrogram ekleyin. Numune kaybını önlemek için, tüp kapağını laboratuvar filmi ile kapatın ve numuneleri 16 ila 18 saat dört santigrat derecede döndürün.
Temizlenmiş lysate her bir mililitre için, protein G boncuk 300 mikrolitre ekleyin. Tüp kapağını laboratuvar filmi ile yeniden kapatın ve dört santigrat derecede iki saat döndürün. Boncukların IPed lysate'den ayrılmasıiçin örnek tüpü mıknatıs rafına yerleştirin.
Pipet kapalı akış-lysate ve atmak, boncuk lar istinat. Boncuklar için yüksek tuz yıkama tampon 800 mikrolitre ekleyin. Tüpü 4 santigrat derecede 10 dakika rotator üzerine yerleştirin.
Örnek tüpü mıknatıs rafına yerleştirin ve boncukların yıkamadan ayrılmasına izin verin. Yıkamayı çıkarın ve atın. Boncuklar için yüksek tuz yıkama tampon başka 800 mikrolitre ekleyin.
Tüpü kapatın ve dört santigrat derecede beş dakika dönmesini bekleyin. Örnek tüpü mıknatıs rafına yerleştirin ve boncukların yıkamadan ayrılmasına izin verin. Yıkamayı çıkarın ve atın.
Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Yıkamadan sonra, boncuklara 14,2 molar beta-mercaptoethanol 3,5 mikrolitre ekleyin ve 15 saniye girdap ile karıştırın. Üreticinin talimatlarına göre ticari bir RNA arıtma kiti kullanarak RNA ayıklayın.
RNase serbest su 30 mikrolitre örnek elute. Numuneyi eksi 80 derecede saklayın. Bu çalışmada, çok az RNA, IP arka planını azaltmak ve orijinal HA etiketli ribozomal RNA'ları izole etmek için bu protokolün etkinliğini gösteren Cre veya Rpl22HA'dan yoksun örneklerden izole edilmiştir.
RNA izolasyon protokollerinde bir dizi antikor Cre ve Rpl22HA pozitif numunelerde test edildi. Bu sonuçlar, reaktif seçiminin IP verimliliği üzerinde önemli bir etkisi olabileceğini göstermektedir. Ribozom ilişkili RNA'yı izole etmek için RiboTag sisteminin etkinliği incelendi.
Hem yabani tip giriş hem de IP genotipleri için giriş konsantrasyonu IP konsantrasyonundan önemli ölçüde daha yüksekti ve giriş örneğinde daha fazla RNA olduğunu gösteriyordu. Toplam RNA havuzlarında, RNA bütünlük numarası değerlerinin 10'a yakın olması ve daha yüksek rin ile daha yüksek inferred numune bütünlüğü ve kalitesiile ilişkili olması beklenmektedir. IP örnekleri girişlerden daha düşük RIN'e sahip ken, RIN'ler hala kabul edilebilir bir aralıktaydı ve örnek genotip'e bağımlı değildi.
Bir kenara ıslah Giriş RNA özellikle downstream analizleri birden fazla tür için anahtardır. Laboratuvarımız için genellikle immünopresidasyon sonrası RNA dizilimi yapıyoruz.
Bu bize ribozom dernek için tüm transkript kubbe sorgulamak için izin verir. Alternatifler mikrodizi analizi veya kantitatif RT-PCR içerecektir. Bizim için bu sistem ribozomla ilişkili RNA'larda belirli RNA bağlayıcı proteinlerin mutasyonu ile ilgili değişiklikleri belirlememize olanak tanır.
