HMDS buhar biriktirme konusundaki yardımı için NanoLab TuE'den Stacey Martina'ya teşekkür ederiz. Bu araştırma, TU/e'deki Karmaşık Moleküler Sistemler Enstitüsü (ICMS) ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) Yerçekimi programı IMAGINE tarafından finanse edildi! (Proje numarası 24.005.009).

Kombinatoryal Plug Üretimi için Mikroakışkan Bir Cihazın Kurulumu

F. E., TheraMe için serbest çalışan bir kişidir! AG. Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu yazıda, tapa adı verilen yağda su bölmelerinde kombinatoryal kitaplıkların otomatik olarak oluşturulması için PDMS tabanlı bir mikroakışkan cihazın üretimi ve çalıştırılması için bir dizi protokol sunulmuştur. Mikroakışkanların damlacık teknolojisi ile kombinasyonu, küçük miktarda reaktifi çok sayıda bölmede kapsüllemek için güçlü bir teknik sağlar, bu nedenle büyük ölçekli kombinatoryal tarama için yollar açar.
Daha önce, her biri kendi avantajları ve sınırlamaları olan mikroakışkanlar kullanarak kimyasal olarak farklı bölmeler oluşturmak için çeşitli teknolojiler tanımlanmıştır. Kulesa ve ark.50, mikrotitre plakaları kullanarak damlacıklar halinde barkodlu hücreleri kapsüllemek ve bu damlacıkları bir elektrik alanı kullanarak birleştirerek bir kombinatoryal kütüphane oluşturmak için bir strateji tanımladı. Böyle bir yaklaşım çok sayıda damlacık kombinasyonu oluşturabilse de, iş akışında manuel işleme adımlarına duyulan ihtiyaçla sınırlıdır. Tomasi ve ark.51 , sferoid (serbest yüzen hücre agregaları) içeren bir damlacığı bir uyaran damlacığı ile birleştirmek için bir mikroakışkan platform geliştirdi ve böylece küresel mikro çevrenin manipülasyonuna izin verdi. Bu yöntem, hücre-hücre etkileşimleri ve ilaçların etkisi gibi önemli olayların incelenmesine izin verir, ancak nispeten düşük verimdir. Eduati ve ark.46 ve Utharala ve ark.47 , otomatik bir şekilde yüksek verimli kombinatoryal kütüphaneler oluşturabilen mikroakışkan valf tabanlı bir platform geliştirdi. Bununla birlikte, bu çalışmalarda, valfler bir Braille cihazı kullanılarak çalıştırılır, bu da mikrovalf ile mikroakışkan çip arasında hantal hizalama adımları gerektirir. Bu belgede açıklanan sistemin önemli bir özelliği, giriş kanallarındaki sıvı akışını düzenlemek için pnömatik PDMS valflerinin uygulanmasıdır. Bu valfler PDMS tabanlı olduğundan, mikroakışkan çipin üretim adımlarına oldukça sorunsuz bir şekilde dahil edilebilirler. Ek olarak, harici bir gaz kaynağı aracılığıyla basınç uygulanarak harekete geçirilebildiklerinden, giriş kanallarındaki sıvıların akışını kontrol etmek için nispeten basit bir seçenektir. Son olarak, bu valflerin basınçlandırma ve basınçsızlaştırma süresi ve sırası programlanabilir, böylece farklı tapa popülasyonlarının üretimi yüksek verimli bir şekilde otomatikleştirilebilir. Bir diğer önemli özellik, reaktiflerin girişten enjeksiyonu için sabit basınç rejimlerinin kullanılmasıdır, bu da sabit bir akış hızı rejiminde ortaya çıkan herhangi bir basınç birikimini hafifletmek için atık kanallarının dahil edilmesinden vazgeçilmesine izin verir. Bu, cihaz tasarımını basitleştirir, atık kanalının valflerini kontrol etmek için ek valf ve donanım ihtiyacını azaltır ve reaktif israfını en aza indirir.
PDMS'li cihazların imalatı nispeten basit olsa da, bu tür cihazların uygulanması, pnömatik solenoid valfler (PDMS valflerinin çalıştırılmasını kontrol etmek için), basınç pompaları (giriş ve yağ reaktiflerinin akışını kontrol etmek için) ve yazılım programları (solenoid valfleri düzenlemek için) gibi kapsamlı donanım gereçlerinin kullanılmasını gerektirir. Önemli bir yatırımı temsil etseler de, böyle bir kurulum, cihazın başarılı bir şekilde çalışması için tutarlılık ve güvenilirlik sağlar. Ek olarak, bu protokolde özetlenen donanım bileşenleri ve mimarisi modüler bir şekilde kurulur. Bu nedenle, bazı modüller için maliyetleri azaltmak veya belirli bir ihtiyaca göre uyarlamak için alternatifler kullanılabilir. Örneğin, fayda, bütçe, kullanılabilirlik ve rahatlığa dayalı olarak kullanılabilecek çeşitli pompalar vardır 52,53,54. Hassas giriş reaktifleri23 için sıvı rezervuarları ve sıcaklık regülatörleri gibi ek bileşenler dahil edilebilir. Ayrıca, bu tasarım belirli bilimsel ihtiyaçları karşılamak için büyütülebilir veya küçültülebilir. Örneğin, bu yazıda, tapa üretmek için sekiz benzersiz reaktifin birleştirilmesine izin veren sekiz girişli bir prototip açıklanmaktadır. Bu, daha fazla sayıda girişe ve bunların daha büyük kombinasyonlarına izin veren 16 girişli bir cihaza yükseltilebilir. Sonuç olarak, girişleri ele almak için ekstra kontrol kanallarına ve solenoid valflere ihtiyaç duyacaktır, ancak böyle bir prototip, daha büyük ve daha çeşitli kombinatoryal kütüphanelerin oluşturulmasına izin verir. Son olarak, bu yazıda, her bir tıkaç popülasyonu, mikroakışkan cihazın sekiz sulu girişinden üçünün açılmasıyla üretilir. Böyle bir konfigürasyon için, yağ reaktifleri için yaklaşık 200 mbar ve sulu reaktifler için 400 mbar'lık bir basıncın, yalnızca valf aktivasyonu ile yönlendirilen bir tapa üretim rejimine karşılık geldiği gözlenmiştir. Yağ(lar)a daha yüksek basınçlar uygulandığında, bujilerin kopması gözlendi ve daha düşük basınçların uygulanması, bujilerin kaynaşmasına yol açtı. Tapa üretimi için en uygun basınç rejimi, bir tapa oluşumuna katkıda bulunan girişlerin sayısı, sıvıların doğası ve viskozitesi ve kanalların boyutları gibi çok çeşitli faktörlere bağlıdır ve gerektiğinde ve gerektiğinde optimize edilmelidir.
Sabit basınç rejiminde çalışmanın dezavantajlarından biri, farklı viskozitelere sahip sıvıların sabit basınç altında farklı akış hızlarına sahip olmasıdır. Bu nedenle, girişlerden akan sulu reaktiflerin karşılaştırılabilir viskozitelerde olduğundan emin olunmalıdır. Farklı viskozitelerdeki sıvıların kullanılması, yalnızca giriş kanallarındaki sıvı akışını değil, aynı zamanda T-bağlantısındaki tıkaç oluşumunu da etkileyecek ve böylece tapa popülasyonlarının bileşimini tehlikeye atacaktır. Diğer bir dezavantaj, bir tıkaç popülasyonunun T-bağlantısındaki artık reaktiflerden kirlenmesidir. Cihaz, farklı fiş popülasyonlarının üretimi arasında geçiş yaptığında, her popülasyonun dizisindeki ilk/son fiş, önceki veya sonraki popülasyon tarafından kontamine olma eğilimindedir. Bu, her popülasyonun ekstra kopyalarını üreterek ve analiz sırasında kontamine fişi indirgeyerek üstesinden gelinebilir. Son olarak, fabrikasyon ve/veya dış kaynaklardaki tutarsızlıklardan (basınç dalgalanmaları) kaynaklanan bireysel cihazlar arasında farklılık potansiyeli de vardır. Bu sorun, tek bir mikroakışkan çipin birden çok kez yeniden kullanılmasıyla ve bu tutarsızlıkların etkisini en aza indirmek için tek bir çip üzerinde bir kombinatoryal kitaplığın tam çalışmasının gerçekleştirilmesini sağlayarak azaltılabilir.
Bu yazıda sunulan mikroakışkan cihaz ve beraberindeki operasyonel protokoller seti, kantitatif bir kombinatoryal fiş kütüphanesinin üretimini göstermek için kullanılmıştır. Bu nedenle bu platform, yüksek verimli bir şekilde farklı fiş popülasyonlarının kombinatoryal kitaplıklarını hızlı bir şekilde oluşturabilir. Sonuç olarak, bu tür teknolojiler, hasta biyopsi numuneleri üzerinde kombinatoryal ilaç taraması dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli tarama amaçları için kullanılabilir - bu sayede bir biyopsiden alınan az sayıda hücre çok sayıda damlacık halinde dağıtılabilir ve belirli bir hasta numunesi için bireysel tedaviyi optimize etmek için büyük bir anti-kanser ilacı kombinasyonu ile tedavi edilebilir - ve bu nedenle kişiselleştirilmiş kanser tedavisini hızlandırır46, 48,55.

Mikroakışkanlar, mikrokanallardaki küçük miktarlardaki sıvıların manipülasyonuna izinverir 1. Tipik mikroakışkan cihazların çalışma ölçeği, kimyasal ve biyolojik reaksiyonların minyatürleştirilmesine izin veren ve böylece bu tür reaksiyonların nispeten küçük miktarlarda reaktiflerle gerçekleştirilmesini sağlayan onlarca ila yüzlerce mikrometredir. Başlangıçta, mikroakışkan cihazlar silikon2 ve cam3 gibi malzemelerle üretildi. Hala kullanımda olmalarına rağmen4, solvent uyumluluğu, yüksek üretim maliyeti ve sıvı akışı 5,6 kontrollerinin entegrasyonundaki zorluklar gibi bazı sorunlar ortaya çıkarmaktadırlar. Yumuşak litografi olarak adlandırılan PDMS tabanlı üretim metodolojileri, cihazların7 hızlı prototiplenmesi için ucuz bir alternatif ve karmaşık çokkatmanlı cihazlar 8 üretmek için bir yol sunar. PDMS cihazlarına valflerin ve pompaların eklenmesi, 9,10 cihazlarındaki sıvıların yönlendirilmesini ve hızını kontrol etme yeteneği sağlar. Mikro valfleri geri dönüşümlü veya geri dönüşümsüz bir şekilde tasarlamak ve harekete geçirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir - örneğin, termal olarak çalıştırılan11 silikon ve alüminyumdan yapılmış bimetalik valfler veya bir silikon nitrür membranı12 saptırmak için bir elektrokimyasal reaksiyondan üretilen gazı kullanarak. Gu ve ark. akışı düzenlemek için mikro kanallara basınç uygulamak için bir Braille ekranının mekanik pimlerinin kullanımını göstermektedir13. Popülerlik kazanan bir mikro valf seti, Stephen Quake14 grubunun öncülük ettiği pnömatik PDMS tabanlı valflerdir. Tipik olarak, bu tür valfler iki ortogonal mikro kanaldan oluşur - bir akış kanalı ve bir kontrol kanalı. Kontrol kanalının basınçlandırılması üzerine, ince bir PDMS membranı akış kanalına sapar, onu kapatır ve böylece sıvı akışını kesintiye uğratır. Basıncı düşürüldükten sonra, membran gevşer, böylece akış kanalını açar ve sıvı akışının yeniden başlamasına izin verir. PDMS valfleri böylece sağlam ve geri dönüşümlü bir şekilde akış regülasyonuna izin verir, çünkü kontrol kanalı birden çok kez basınçlandırılabilir ve basınçsız hale getirilebilir15. Ek olarak, bu tür valfler basınç uygulanarak harekete geçirilebildiğinden, dijital kontrol ve otomasyon için yollar açarlar16. Ayrıca, aynı malzemeden oldukları için, yumuşak litografi teknikleri 8,17,18 kullanılarak PDMS tabanlı cihazların imalatına sorunsuz bir şekilde entegre edilebilirler. Bu özellikler, PDMS valflerini mikroakışkan cihazlarda akış regülasyonu için çekici bir seçim haline getirir. Thorsen ve ark. yirmi kontrol kanalı ile yaklaşık bin giriş akış kanalını ele almak için bir akışkan çoklayıcı - bir pnömatik valf dizisi - tasarlamak için bu tür valflerin prensibini kullandı19. Bu ilke, sıvıları çip içi mikroakışkan kemostatlara seçici olarak yönlendirmek için genişletilmiştir, böylece her reaktörde 20,21,22,23 aynı anda benzersiz reaksiyonlar gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu tür mikro reaktörler, sınırlı reaktiflerin kullanımını optimize etmede yararlı olsa da, çoklu reaksiyonları paralelleştiremez ve yüksek verimli çalışmalar için yeterli değildir.
Damlacık mikroakışkanları, mikroakışkan cihazlarda karışmayan, çok fazlı sıvı akışının manipülasyonu yoluyla damlacıkların üretimini içeren bir mikroakışkan alt kategorisidir24. Damlacık oluşumu, karışmayan bir sıvının eklenmesiyle sürekli bir sıvının parçalanmasını içerir, bu da arayüzey enerjisindeki kararsızlık ve bir emülsiyon oluşumu nedeniyle bir sıkışma ile sonuçlanır25. Yüzey aktif maddeler, arayüzey enerjilerini stabilize ederek emülsiyonlar mikrokanaldan ayrıldığında yuvarlak damlacıkların oluşumuna yardımcı olur26. Tıkaç adı verilen daha büyük damlacıklar daha az kararlıdır ve her iki tarafta bir veya daha fazla karışmayan sıvı ile aralıklı bir dizi sulu bölme olarak bir tutma bölmesinde (bir boru uzunluğu gibi) toplanabilir27. Minyatürleştirme ve bölümlere ayırmaya ek olarak, damlacık mikroakışkanları, her biri bir nanoreaktör28 görevi gören çok sayıda monodispers damlacık üretilebildiğinden, biyolojik reaksiyonların artan verimini de sunar. Damlacıklar, bir kez üretildikten sonra,bölme 29,30, füzyon31,32, sıralama33,34 ve daha yüksek dereceli yapılarabirleştirme 35,36 gibi daha ileri manipülasyonlara da tabi tutulabilir. Damlacık mikroakışkanları, PCR37'den tek hücreli transkriptomiklere38, ilaç keşfinden 39,40'a kadar virolojiye 41'e, yeni nesil dizilemeden 42'ten kimyasal senteze43'e kadar birçok bilimsel alanda ve teknolojide devrim yarattı.
PDMS tabanlı yumuşak litografi ve mikro valflerin damlacık teknolojisi ile entegrasyonu, mikro kanallardaki sıvı akışının düzenlenmesine ve ardından damlacık içerikleri üzerinde kontrole izin veren güçlü bir kombinasyondur. Kanalların açılıp kapanmasına bağlı olarak, her biri belirli bir bileşime sahip farklı damlacık popülasyonları üretmek mümkündür. Böyle bir platform, biyokimyasal reaksiyonları minyatürleştirebilir, bölümlere ayırabilir ve paralelleştirebilir ve bu nedenle kombinatoryal tarama için yararlı bir teknik olabilir44. Kombinatoryal tarama, bilinen bileşime sahip bireysel popülasyonlardan oluşan kütüphaneler üretmek için seçilen reaktiflerin on binlerce kombinasyonunu oluşturmak için yüksek verimli bir yöntemdir. Bakteriyel büyüme inhibisyonu için ilaçlar ve antibiyotikler arasındaki sinerjik etkileri keşfetmek için kombinatoryal tarama kullanılmıştır45. Kanser tedavisi alanında, belirli bir hasta için anti-kanser ilaçlarının kombinasyonlarını test etmek ve böylece kişiselleştirilmiş tedaviyi ilerletmek için kombinatoryal tarama kullanılmıştır46,47. Mathur ve ark. yüksek verimli ilaç taramasında transkriptom değişikliklerini değerlendirmek için kombinatoryal bir DNA barkodlama yaklaşımını entegre ederek bu teknolojiyi geliştirmişlerdir48. Bu nedenle, kombinatoryal tarama güçlü ancak yeni ortaya çıkan bir teknolojidir ve bu tür tarama prosedürlerini yürütmek ve kolaylaştırmak için çeşitli mikroakışkan teknolojilerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.
Bu el yazmasının amacı, yağda su tapalarının kombinatoryal bir kütüphanesi oluşturabilen iki katmanlı bir mikroakışkan cihazın üretimi için eksiksiz bir protokol seti sunmak ve böyle bir cihazın çalışması için gereken donanım ve yazılımı tanımlamaktır. Sıvı akışı, basınç kontrollü PDMS tabanlı pnömatik valfler kullanılarak düzenlenir ve bunlar da özel bir LabVIEW programı tarafından kontrol edilir. Cihazdaki reaktiflerin akışı, piyasada bulunan basınç pompaları kullanılarak sağlanır. Her biri sulu bir reaktif içeren üç girişin içeriğinden bir tapanın oluşturulduğu sekiz girişli bir prototip sunulmaktadır. Sulu faz, sürekli bir yağ fazı ile buluşur ve tapalar, 0.33 Hz frekanslı bir T-bağlantısında üretilir. Sistemin işleyişi, üç farklı floresan tıkaç popülasyonu içeren nicel bir kütüphane üretilerek gösterilmiştir. Bu teknoloji ve protokol seti, yüksek verimli tarama amaçları için kombinatoryal kütüphanelerin üretimini hızlandırmaya yardımcı olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1,3,3 tetramethyldisiloxane</td>
			<td>Merck Life Science NV</td>
			<td>MFCD00008256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Boom Labs</td>
			<td>BOOMSKEUZW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>Eindhoven University of Technology</td>
			<td>https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40XT 11D</td>
			<td>Merck Life Science NV&#160;</td>
			<td>212299</td>
			<td>&#160;Positive photoresist&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF developer</td>
			<td>Merck Life Science NV</td>
			<td>10055824960</td>
			<td>Developer for positive photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch, Rapid Core</td>
			<td>World Precision Instruments Germany, GMBH</td>
			<td>504529</td>
			<td>0.75 mm ID, W/Plunge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue food dye</td>
			<td>PME</td>
			<td>FC1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module&#160;</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH&#160;</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller&#160;</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH&#160;</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-40</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>F9755-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent flow unit</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system&#160;</td>
			<td>Fluigent&#160;</td>
			<td>MFCS-EZ&#160;</td>
			<td>0 - 2 bar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Merck Life Science NV</td>
			<td>MFCD00005050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate&#160;</td>
			<td>Torrey Pines Scientific&#160;</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments&#160;</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Boom Labs</td>
			<td>BOOMSKEUZE3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW (Software Version 20)</td>
			<td>Eindhoven University of Technology</td>
			<td>https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_ 
			VERSION_1</td>
			<td>All files have been saved for LabVIEW version 20. It is advised to use this version or higher to open the files.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs&#160;</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>LS23</td>
			<td>23 ga, 0.5&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors&#160;</td>
			<td>Cole Parmer&#160;</td>
			<td>45505-32&#160;</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex PTFE tubing</td>
			<td>Avator/VWR</td>
			<td>48634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides,&#160; Plain</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2947-75X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>330760-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr DEV 600</td>
			<td>Micro resist Technology</td>
			<td>R815100</td>
			<td>Developer for negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Eindhoven University of Technology (Adapted from Merten Lab, EPFL)</td>
			<td>https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td></td>
			<td>1x 8 valve array, Normally closed valves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td></td>
			<td>&#60;1-0-0&#62;, 100 mm diameter, 525 &#956;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades&#160;</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td></td>
			<td>1 mm ID, 3 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater&#160;</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation&#160;</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Olympus Corporation&#160;</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Kayakli Advanced Materials</td>
			<td>Y311075 1000L1GL</td>
			<td>Negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>B Braun Injekt - F Fine Dosage Syringe</td>
			<td>10303002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-LED exposure system</td>
			<td>Idonus</td>
			<td>UV-EXP150S-SYS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>&#160;Vacuumbrand GmbH&#160;</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales&#160;</td>
			<td>Sartorius&#160;</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bilayer microfluidic device for combinatorial plug production

Damlacık mikroakışkanları, kimyasal olarak farklı nanolitre bölmelerde çok sayıda reaksiyonun yürütülmesine izin veren çok yönlü bir araçtır. Bu tür sistemler, tek hücrelerin inkübasyonundan PCR reaksiyonlarının uygulanmasına, genomikten kimyasal senteze kadar çeşitli biyokimyasal reaksiyonları kapsüllemek için kullanılmıştır. Mikroakışkan kanalların düzenleyici valflerle bağlanması, açılmaları ve kapanmaları üzerinde kontrol sağlar, böylece benzersiz bileşimlere sahip bir damlacık popülasyonundan oluşan büyük ölçekli kombinatoryal kütüphanelerin hızlı üretimini sağlar. Bu yazıda, tapa adı verilen yağda su emülsiyonlarının kombinatoryal kütüphanelerini oluşturmak için kullanılabilen, basınçla çalışan, PDMS tabanlı iki katmanlı bir mikroakışkan cihazın üretimi ve çalıştırılması için protokoller sunulmaktadır. Yazılım programlarını ve mikroakışkan donanımı birleştirerek, cihazdaki istenen sıvıların akışı, kombinatoryal fiş kütüphaneleri oluşturmak ve bileşen fiş popülasyonlarının bileşimini ve miktarını kontrol etmek için kontrol edilebilir ve manipüle edilebilir. Bu protokoller, özellikle kanser hastası biyopsilerinden elde edilen hücrelerdeki ilaç yanıtını incelemek için kombinatoryal ekranlar oluşturma sürecini hızlandıracaktır.

Microfluidics allows for the manipulation of small amounts of fluids in microchannels1. The scale of operation of typical microfluidic devices is tens to hundreds of micrometers which allows the miniaturization of chemical and biological reactions, thereby enabling such reactions to be carried out with relatively small quantities of reagents. Initially, microfluidic devices were fabricated with materials such as silicon2 and glass3. Although they are still in use4, they pose certain issues, such as solvent compatibility, high cost of manufacture, and difficulties in integrating controls for fluid flow5,6. PDMS-based fabrication methodologies, termed soft-lithography, offer an inexpensive alternative for the rapid prototyping of devices7 and an avenue to fabricate complex multilayered devices8. The addition of valves and pumps to PDMS devices allows for the ability to control the routing and speed of fluids in devices9,10. Several methods to design and actuate microvalves in a reversible or irreversible manner have been developed - for example, bimetallic valves made from silicon and aluminum, which are thermally actuated11 or using gas generated from an electrochemical reaction to deflect a silicon nitride membrane12. Gu et al.&#160;demonstrate the use of the mechanical pins of a Braille display to apply pressure on microchannels to regulate flow13. One set of microvalves that has gained popularity is the pneumatic PDMS-based valves pioneered by the group of Stephen Quake14. Typically, such valves are composed of two orthogonal microchannels - a flow channel and a control channel. Upon pressurization of the control channel, a thin PDMS membrane deflects upon the flow channel, closing it off and thereby interrupting fluid flow. Once depressurized, the membrane relaxes, thereby opening the flow channel and allowing the resumption of fluid flow. PDMS valves thereby allow flow regulation in a robust and reversible manner since the control channel can be pressurized and depressurized multiple times15. Additionally, since such valves can be actuated by the application of pressure, they open up avenues for digital control and automation16. Furthermore, as they are of the same material, they can be integrated seamlessly into the fabrication of PDMS-based devices using soft-lithography techniques8,17,18. These features make PDMS valves an attractive choice for flow regulation in microfluidic devices. Thorsen et al. used the principle of such valves to design a fluidic multiplexer - a combinatory array of pneumatic valves - to address nearly a thousand input flow channels with twenty control channels19. This principle has been extended to selectively route fluids to in-chip microfluidic chemostats such that unique reactions can be carried out simultaneously in each reactor20,21,22,23. However, such microreactors, while useful in optimizing the usage of limited reagents, cannot parallelize multiple reactions and are not sufficient for high-throughput studies.
Droplet microfluidics is a subcategory of microfluidics that involves the production of droplets through the manipulation of immiscible, multiphasic liquid flow in microfluidic devices24. Droplet formation involves the breakup of a continuous fluid by the introduction of an immiscible fluid, resulting in a pinch-off due to instability in the interfacial energy and in the formation of an emulsion25. Surfactants aid in the formation of rounded droplets when emulsions leave the microchannel by stabilizing the interfacial energies26. Larger droplets, called plugs, are less stable and can be collected in a holding compartment (such as a length of tubing) as an array of aqueous compartments spaced on either side by one or more immiscible liquids27. In addition to miniaturization and compartmentalization, droplet microfluidics also offers increased throughput of biological reactions, as a large number of monodisperse droplets can be produced - each serving as a nanoreactor28. Droplets, once generated, can also be subjected to further manipulations, such as splitting29,30, fusion31,32, sorting33,34, and assemblage into higher order structures35,36. Droplet microfluidics has revolutionized several scientific fields and technologies - from PCR37 to single-cell transcriptomics38, from drug-discovery39,40 to virology41, from next-generation sequencing42 to chemical synthesis43.
Integration of PDMS-based soft-lithography and microvalves with droplet technology is a potent combination that allows for the regulation of fluid flow in microchannels and subsequent control over droplet contents. Depending on the opening and closing of channels, it is possible to produce distinct populations of droplets, each with a specific composition. Such a platform could miniaturize, compartmentalize, and parallelize biochemical reactions and therefore be a useful technique for combinatorial screening44. Combinatorial screening is a high-throughput method to generate tens of thousands of combinations of selected reagents to produce libraries which consist of individual populations of known composition. Combinatorial screening has been used to discover synergistic effects between drugs and antibiotics for bacterial growth inhibition45. In the field of cancer therapy, combinatorial screening has been used to test combinations of anti-cancer drugs for a given patient thereby advancing personalized therapy46,47. Mathur et al. have built on this technology by integrating a combinatorial DNA barcoding approach to assess transcriptome changes in high-throughput drug screening48. Thus, combinatorial screening is a powerful yet nascent technology, and there is a need for developing diverse microfluidic technologies to execute and facilitate such screening procedures.
The goal of this manuscript is to present a complete set of protocols for the fabrication of a bilayer microfluidic device capable of generating a combinatorial library of water-in-oil plugs and describe the hardware and software needed for the operation of such a device. The fluid flow is regulated using pressure-controlled PDMS-based pneumatic valves, which are in turn controlled by a custom LabVIEW program. Flow of reagents in the device is achieved using commercially available pressure pumps. An eight-inlet prototype is presented wherein a plug is formed by the contents of three inlets, each containing an aqueous reagent. The aqueous phase meets a continuous oil phase, and plugs are produced at a T-junction with a frequency of 0.33 Hz. The functioning of the system is demonstrated by producing a quantitative library containing three distinct populations of fluorescent plugs. This technology and set of protocols will help to expedite the production of combinatorial libraries for high-throughput screening purposes.

Yazar Spotlight: Hesaplamalı ve Deneysel Yaklaşımları Hassas Onkolojiye Entegre Etme

Kombinatoryal Fiş Üretimi için İki Katmanlı Mikroakışkan Cihaz

We at the Systems Biology for Oncology Group use a combined computational and experimental approach to unravel the intricate mechanism shaping the tumor microenvironment. We use mathematical models based on clinical data and cancer biology to identify factors influencing individual response to therapy with the ultimate aim of improving precision oncology. Given the heterogeneous and dynamic nature of tumor response to therapy, perturbation biology has shown the potential to overcome the limitation of genomic biomarkers.Our approach involves subjecting receptive tumor cells to an extensive anti-cancer drug screen to identify phenotypic properties of tumors in order to determine more effective anti-cancer treatments. Microfluidics is a valuable technology which aids in the analysis of a small amount of sample such as tumor biopsy by distributing it into individual compartments such as droplets or plugs. It also allows in the control of the composition of each plug, thereby creating multiple populations of chemically distinct plugs.We present here a fully PDMS based device where fluid flow is regulated by pressure actuated quake valves, which allow for the quick, controlled, and programmable production of distinct plug populations. Furthermore, since the quake valves are also PDMS based, they can be integrated smoothly into device fabrication. Combining data obtained from eye throughput combinatorial screening of cancer cells with mathematical models will allow us to study signaling pathways regulating the tumor microenvironment behavior.This research will pave the way for new strategies for precision oncology providing the rationale to personalize treatment to individual patients.

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Integrating Computational and Experimental Approaches in Precision Oncology at JoVE.com

Yağda su emülsiyonlarında (tapalar) kombinatoryal kütüphanelerin üretimi için polidimetilsiloksan (PDMS) bazlı iki katmanlı bir cihazın imalatı burada sunulmaktadır. Fiş üretimini otomatikleştirmek için gerekli donanım ve yazılım protokolde detaylandırılmıştır ve kantitatif bir floresan fiş kütüphanesinin üretimi de gösterilmiştir.

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...

Onkoloji için Sistem Biyolojisi Grubu olarak, tümör mikro çevresini şekillendiren karmaşık mekanizmayı çözmek için birleşik hesaplamalı ve deneysel bir yaklaşım kullanıyoruz. Hassas onkolojiyi geliştirmek amacıyla tedaviye bireysel yanıtı etkileyen faktörleri belirlemek için klinik verilere ve kanser biyolojisine dayalı matematiksel modeller kullanıyoruz. Tümörün tedaviye yanıtının heterojen ve dinamik doğası göz önüne alındığında, pertürbasyon biyolojisi, genomik biyobelirteçlerin sınırlamasının üstesinden gelme potansiyelini göstermiştir.Yaklaşımımız, daha etkili anti-kanser tedavilerini belirlemek için tümörlerin fenotipik özelliklerini tanımlamak için alıcı tümör hücrelerini kapsamlı bir anti-kanser ilaç taramasına tabi tutmayı içerir. Mikroakışkanlar, tümör biyopsisi gibi küçük bir miktardaki numunenin damlacıklar veya tıkaçlar gibi ayrı bölmelere dağıtılarak analizine yardımcı olan değerli bir teknolojidir. Aynı zamanda, her bir fişin bileşiminin kontrolüne izin verir, böylece kimyasal olarak farklı fişlerin birden fazla popülasyonu oluşturur.Burada, sıvı akışının, farklı tapa popülasyonlarının hızlı, kontrollü ve programlanabilir üretimine izin veren, basınçla çalıştırılan deprem vanaları tarafından düzenlendiği tamamen PDMS tabanlı bir cihaz sunuyoruz. Ayrıca, deprem vanaları da PDMS tabanlı olduğundan, cihaz imalatına sorunsuz bir şekilde entegre edilebilirler. Kanser hücrelerinin göz verimi kombinatoryal taramasından elde edilen verilerin matematiksel modellerle birleştirilmesi, tümör mikroçevre davranışını düzenleyen sinyal yolaklarını incelememize olanak sağlayacaktır.Bu araştırma, hassas onkoloji için yeni stratejilerin önünü açacak ve tedaviyi bireysel hastalara göre kişiselleştirmek için gerekçe sağlayacaktır.

bilayer-microfluidic-device-for-combinatorial-plug-production

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

563 Görüntüleme.  Eindhoven University of Technology. Onkoloji için Sistem Biyolojisi Grubu olarak, tümör mikro çevresini şekillendiren karmaşık mekanizmayı çözmek için birleşik hesaplamalı ve deneysel bir yaklaşım kullanıyoruz. Hassas onkolojiyi geliştirmek amacıyla tedaviye bireysel yanıtı etkileyen faktörleri belirlemek için klinik verilere ve kanser biyolojisine dayalı matematiksel modeller kullanıyoruz. Tümörün tedaviye yanıtının heterojen ve dinamik doğası göz önüne alındığında, pertürbasyon biyoloji...

Video: Yazar Spotlight: Hesaplamalı ve Deneysel Yaklaşımları Hassas Onkolojiye Entegre Etme

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

Biyomühendislik

Production of a Combinatorial Plug Library from a Bilayer Microfluidic Device

To begin, cut a length of PTFE tubing for every control channel of the microfluidic device. Insert the pin of a 23-gauge half-inch lure stub at one end. Attach the lure stub to a male lure.Then, insert the connector into a length of polyurethane tubing. Connect the other end of the polyurethane tubing directly to a solenoid valve. Next, connect a 23-gauge, 0.5 inch lure stub at the end of a syringe.Fill the syringe with water. Attach the free end of the PTFE tubing to the syringe. Inject water until approximately halfway through the tubing.Now, disconnect the tubing from the syringe and insert the free end into a punched hole of the corresponding control channel. Repeat until each control channel is connected to the corresponding solenoid valve. Next, launch the main interface program.Press the Pressurize All Control Channels option to open the valves. This will push the fluid from the tubing into the control channels of the microfluidic device to fill it up. For each of the aqueous reagents, cut a segment of PTFE tubing long enough to connect the pumps to the microfluidic device inlets.Connect a 23-gauge, 0.5 inch lure stub to the end of a syringe. Fill a syringe with the required reagent. Inject the reagent into the tubing until the tubing is full.Insert the free end of the tubing into a corresponding inlet in the microfluidic chip. With the software, apply a pressure of 400 millibars to each of the inlet aqueous reagents. Sequentially, depressurize the control channels individually using the main interface program.Press the corresponding icons on the program in the box labeled Control Channels Manual Pressurization to actuate individual valves if necessary. After repeating the pressurization for the oil reagents, click on Depressurize All Control Channels to simultaneously depressurize the channels. Now, click on Pressurize All Control Channels to repressurize the control channels.And code the composition, sequence, and replicates of each plug population in a CSV file by marking the necessary control channels with a zero, if it's corresponding inlet needs to be open, or with a one if it needs to be closed. This will serve as input for the automatic experiment in the main interface program. Next, click on the folder icon in the Experiment File tab to load the CSV file.Input the relevant fields such as Iterations of Experiment, Time of Depressurization, and Time of Pressurization. Then, choose the inlet channels corresponding to barcode production in the Barcode Inlets section, along with the duration for which they need to be open. Alternatively, the barcodes can be hard coded into the input CSV file.Now, reduce the pressure of the inlet oil reagents from 400 millibar to 200 millibar. Next, connect a PTFE tubing to the outlet to collect the plugs. Use prefilled tubing to neutralize the difference in pressure at the outlet.Lastly, press Run Experiment to start the program and plug production. The valves were able to regulate fluid flow until approximately 800 millibar of input pressure. At 1200 millibars, the input pressure was too high for flow regulation.The flow rate of distilled water when injected at constant pressure dropped to zero. Upon depressurization, the flow rate recovered to the pre-actuation levels. However, under constant flow rate, the valve actuation did not result in complete inlet closure.To demonstrate the device functionality, a quantitative combinatorial library of plugs was generated.