Biz Ryan Maneri (Oystercatcher Productions, LLC), diseksiyon video düzenleme ile ilgili yardım için prosedür ve Rodney McPhail (Biyolojik Bilimler Bölümü, Purdue University) çekim için teşekkür etmek istiyorum. Suter laboratuarında Araştırma Purdue Üniversitesi&#39;nde NIH (R01 NS049233) ve Bindley Bioscience Merkezi hibe DMS tarafından desteklenmektedir

Çözümler <ul><li> L15-ASW hücre kültür ortamı (1l) <ul><li> 1 torba toz L15 </li><li> 800 ml H 2 O ultra saf eklemek </li><li> NaCl 400 mm </li><li> MgSO 4 27 mM </li><li> MgCl 2 28 mM </li><li> 4 mM L-Glutamine </li><li> Gentamisin 50 mg / ml </li><li> Hepes 5 mm </li><li> PH 7.9 &#39;a ayarlayın </li><li> Damla damla CaCl 2 9.3 mM ekle (çökeltileri eğer stop) </li><li> 1 lt H 2 O ultra saf ekle </li><li> Ozmometre (buhar basıncı, Wescor # 5520) ozmolarite (950-1000 mg / kg) </li><li> Filtre 0.22 mikron pozitif basınçlı filtrasyon ünitesi (Millipore SVGV010RS Filtreler) kullanarak </li><li> 1 ay kadar 4 ° C&#39;de muhafaza </li></ul></li><li> Poli-L-lisin (70-150 kD) 200 mg / ml stok solüsyonu steril H 2 O ultra saf -20 ° C&#39;de muhafaza </li><li> 0.5 M MgCl 2 çözümü </li></ul> 1. Gün: Aplysia karın ganglion diseksiyonu Enzimatik disosiasyon çözüm hazırlanması <ol><li> Eppendorf tüp Dispase enzim (LS02111 Worthington, Kedi): 9-10 mg tartılır </li><li> Ul 900, L15-ASW kültür ortamı ve steril H 2 O ultrapure 100 ul </li><li> Mix ve yerde oda sıcaklığında (RT) </li></ol> Karın ganglion diseksiyonu <ol><li> 0.5 M MgCl 2 çözeltisi ile 50 ml şırınga doldurun. </li><li> Tanktan bir hayvanın, hayvan mürekkep savunma tepkisini önlemek için nazikçe. </li><li> Sol sağ, kaudal tarafında bir diseksiyon tahtada yan Aplysia (strafor kurulu), rostral tarafında yerleştirin. </li><li> Sadece başın arkasında hayvan iğne takın ve vücut boşluğuna tüm MgCl 2 çözüm enjekte. </li><li> Yavaşça vücut boşluğuna boyunca MgCl 2 çözüm dağıtmak için hayvan ovmak tamamen anestezi hayvan için birkaç dakika bekleyin. </li><li> Diseksiyonu kuruluna hayvanın baş ve kuyruk iki iğne ile sabitleyin. </li><li> Forseps tarafında büyük bir açılım yapmak için büyük baş ve kuyruk doğru makas ile deri ve kas tabakası ile kesim, cilt kaldırmak için kullanın. </li><li> Fırça gibi yumurtalık altında karın ganglion bulun. Karın ganglion önünde yaklaşık 1 cm bağlantı sinirleri tutmak için forseps kullanımı, forseps konumdan önünde ve karın ganglion arkasında diseksiyon makas ile sinirler kesilir. </li><li> 22 Dispase çözüm ve 15-16 saat boyunca inkübe içine yerleştirin ganglion ° C sıcaklık kontrollü su banyosu. </li></ol> 2. Gün: Aplysia çanta hücreleri Kaplama Poli-lizin kaplı lamelleri hazırlanması <ol><li> Bir akış tezgah, 4 ml L15-ASW orta her doldurma, ganglion diseksiyonu için çalışma yemekleri olarak üç 35mm Petri yemekler hazırlamak. Dispase çözüm karın ganglion sindirim 15.5 saat sonra çalışma yemekler aktarın. </li><li> Forseps almak asit temizleme # 1.5 lamelleri (22x22 mm) etanol içinde saklanan, alkol kaldırmak ve Bunsen beki üzerinde kısaca onlara alevli lamelleri sterilize. Lamelleri kültür yemeklerinin içine yerleştirmeden önce onları kısa bir süre soğumasını bekleyin. </li><li> Bunsen beki üzerinde sarı bir ucu (alev sadece kısa bir süre plastik erime önlemek için!) Eğilme, kavisli bir kaplama ucu hazırlayın. </li><li> 20 mcg / ml poli-lizin çözüm uygun miktarda steril H 2 O ultrapure ile 200 mg / ml stok solüsyonu seyreltilmesi ile hazırlayın. </li><li> 20 mg / ml poli-lizin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe 500 ul her lamel örtün. </li><li> 500 ul steril H 2 O ultra saf her her lamel 3-5 kez yıkayın. </li><li> Lamelleri gelen suyu çıkarın; L15-ASW kültür ortamı 4 ml her çanağı doldurmak. </li></ol> Çanta hücreleri Fototerapisi <ol><li> Diseksiyon mikroskobu altında, daha önce% 95 etanol (Şekil 1 satır 1) ile temizlenmelidir yarım kullanarak diseksiyon makas ve forseps karın ganglion kesti. </li><li> Çanta hücre küme ve hemiganglion hücreleri (Şekil 1 satır 2) arasındaki kesin ganglion, sinir uzantıları çanta hücrelerinin diğer tarafında kalan (Şekil 1 satır 3) kesip bir yarısında. Bir defada ganglion bir yarım çalışın; tabak içinde, diğer yarısı terk edilirken ilk küme hücre kaplama. </li><li> Iki forseps (veya bir forseps ve diseksiyon makas), çanta hücre kümesi etrafındaki bağ dokusu kılıf bir kenara iterek sürüm çanta hücre kümesi. Gerekirse bağ dokusu diseksiyon makas ile kesin. Bu işlem sırasında sıkmak ve çanta hücre kümesi çok fazla dokunmamaya dikkat edin. </li><li> En bağ dokusu çıkarılır, b transferbükük sarı ucu ile yeni bir çalışma çanak içine ag hücre kümesi önceden hazırlanmış. Sarı ucu torba hücre kümesi içinde sıkışıp veya hava / orta arayüzü sıkışmış izin vermeyin dikkatli olun. </li><li> Bireysel çanta hücreleri çıkarmak için sarı ucu ile küme Karışım. Ucu ve küme pipetleme bunu. Düşük kesme kuvvetleri ile başlayın ve gerektiğinde kuvvetini artırmak. Her zaman çok fazla hücre öldürmeden nöronların kaldırmak için gereken en düşük güç kullanmayın. </li><li> 3-5 sağlıklı çanta hücreleri toplamak ve poli-lizin kaplı lamel ile bir çanak aktarabilirsiniz. Ölü hücreleri (onlar merkezinde siyah / şeffaf) ve bağ dokusu enkaz toplayıp kaçının. </li><li> 6. adımı tekrarlayın. ve 15-25 canlı nöronlar hakkında her lamel merkezi haline bir yer. Yanı sıra, ölü hücreleri veya enkaz aktarılıyorsa, toplayıp ya da sağlıklı hücreleri uzak üfleme istenmeyen malzeme çıkarmak. Bu süreç, her iki kümeleri için yaklaşık 2-3 saat sürer. </li><li> Daha sonra RT en az 2 saat akışını bankta kültür yemekleri tutmak (istenmeyen titreşimi önlemek için akışı tezgah üfleyici tutmak) hücreleri takmak için izin bitirdi. </li><li> Yemekler, 14 ° C, gece ya da daha sonra kullanmak kadar bir inkübatör içine yerleştirin. Büyüme konileri, 4-10 saat içinde gelişebilir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="Şekil 1. Aplysia californica karın ganglion şematik. Çanta hücre kümeleri elde etmek için burada kesmek için Renk hatları göstermektedir." /> Şekil 1. Aplysia californica karın ganglion şematik. Çanta hücre kümeleri elde etmek için burada kesmek için Renk hatları göstermektedir. 3. Gün: Aplysia çanta hücreleri canlı görüntüleme için oda kurma Görüntüleme odasının Meclisi <ol><li> Çanta hücreleri canlı hücre görüntüleme deneyleri için kullanmadan önce, bir düşük güç mikroskobu hücreler inceleyin. Hücrelerin sağlıklı büyüme konileri gelişmiş değil varsa, oda sıcaklığında 1-2 saat için taze orta ve terk kaynağı. </li><li> Taze L15-ASW orta plakalar tedarik için eski orta yarısından fazlası (~ 2 ml), bir vakum hattı ile kaldırmak ve 2 ml yeni L15-ASW petri başına orta eklemek. Tamamen bu lamel hücreleri çıkarmak gibi bir defada çanak tüm orta kaldırmak için önemlidir. </li><li> Çanta hücre görüntüleme için, biz, bir sandviç gibi görüntüleme odasında iki lamelleri ve iki plastik ayırıcılar monte. Sandviç üst lamel, orta ve reaktiflerin kolay değişimi sağlamak için kısa kesilir. Montaj sırasında yerinden oynatmamaya hücreleri engellemek için her zaman bağlı çanta hücreleri ile lamelleri L15-ASW orta batmış olmalıdır. </li><li> Odanın hazırlamak için, kesilmiş ~ 2mm elmas kalem (cam kesici) ve cetvel ile # 1 lamelleri 22x22 mm sağ tarafında. </li><li> 1 ml şırınga kullanarak, yüksek vakum gres kısa lamel iki taraf için geçerlidir ve her iki tarafındaki plastik ayırıcılar eklemek. Hem ayırıcılar üst vakum gres yağı uygulayın. </li><li> Bir coverglass çanta hücreleri içeren petri lamel ve ara montaj, yer ve tersine çevirin. Aynı hizaya getirin ve yavaşça iki Q-ipuçları ters ucu ile alt üst lamel lamel sopa bastırın. </li><li> Forseps kullanarak, yavaşça dışarı sızdıran orta olmadan petri sandviç montaj dışarı çıkarın. Gerekirse, iki lamelleri hizalayın ve bir Kimwipe fazla orta silin. Sandviç, mikroskop lamı sahibinin alt kısmında üzerine yerleştirin ve klipler kullanarak bakım kapağı takın. </li><li> Q-ipuçları ile sandviç üst tarafında merkezinde temiz bir cam temizleyicisi (Sparkle cam temizleyici olarak kullanılır) sildi. Ikinci, kuru bir Q-tip ile cam temizleyici çizgileri önlemek için hızlı bir şekilde kurulayın. Alt lamel için de aynı işlemi yapın. Temizlik lamelleri çizgileri ücretsiz yüksek kaliteli görüntüleme için önemlidir. </li></ol> Çanta hücreleri mikroskop Aplysia çanta nöronal hücre kültürleri düşük yoğunluklu olduğundan mikroskop hücreleri arasında geçiş kolaylaştırmak için kurulum aşamasında konumlandırma fonksiyonları varsa, bu en iyi olur. Çanta hücreleri kolayca görüntüleme deneyler sırasında sahnede birkaç saat oda sıcaklığında tutulmalıdır. Buharlaşmasını önlemek için düzenli aralıklarla Exchange orta.

<ol>
	<li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons.">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li><li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule,+apCAM,+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling.">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li><li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones.">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li><li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering.">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li></ol>

Aplysia çanta hücre nöronlar olmayan çok az sayıda nöron hücreleri ile bir serum serbest nöronal hücre kültürü sistemi sağlar. Bu nöronlar, bir dizi önemli hücre biyolojik soruları çözmek için uygun çok geniş bir büyüme konileri oluşturur. Çanta hücre nöronlar birkaç saat içinde kolayca manipüle ve oda sıcaklığında az görüntülü olabilir. Floresan kullanarak bir F-aktin ve mikrotübül polimerizasyon ve translokasyon dinamiklerinin kantitatif çeşitli parametreler analiz edebilir speckle Mikroskobu (FS...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>#1 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>48366067</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#1.5 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>2870-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm Petri dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Falcon</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filters for medium filtration</td>
<td>Tool</td>
<td>Millipore</td>
<td>SVGV010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High vacuum grease</td>
<td>Tool</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Osmometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Wescor</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic shims</td>
<td>Tool</td>
<td>Small Parts Inc </td>
<td>SHSP-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>C79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15 medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41300-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8540</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>5958-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>6070-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-lysine (70-150 kD) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt </td>
<td>7581</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutral Protease (Dispase)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Worthington</td>
<td>LS02111</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

neuronal cell cultures from aplysia for high-resolution imaging of growth cones

Nöronal büyüme konileri, ortamda, rehberlik ipuçları tespit ve uygun hedef hücre doğru yönlü hareket içine bu bilgileri transduce akson ucunda son derece hareketli yapılardır. Rehberlik bilgileri tam olarak hücre yüzeyi altında yatan dinamik sitoskeletal ağlara iletilir anlamak için, bir canlı hücre protein dinamiği yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte görüntüleme için uygun bir model sistem gerekiyor. Tipik omurgalı büyüme konileri kantitatif F-aktin ve mikrotübül dinamiklerini analiz etmek için çok küçük. Deniz tavşan Aplysia californica Nöronlar, omurgalı nöronlar 5-10 kat daha büyük oda sıcaklığında kolayca saklanabilir ve mikromanipülasyon ve biyofiziksel ölçümler için çok sağlam hücreler. Onların büyüme konileri çok sitoplazmik bölge ve iyi tanımlanmış bir iskelet sistemi tanımlamıştır. Nöronal hücre gövdeleri büyüme konisinin motilite ve rehberlik eğitimi için probların çeşitli microinjected olabilir. Mevcut protokolde, karın ganglion, çanta hücresi nöronların kültür ve büyüme konileri canlı hücre görüntüleme için bir görüntüleme odası kurma diseksiyonu için bir prosedür ortaya koymaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones at JoVE.com

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Aplysia californica nöronların büyüme konisinin motilite ve rehberlik yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mükemmel bir büyük kültür büyüme konileri gelişir. Burada, diseksiyon ve Aplysia çanta hücresi nöronların kaplama gibi canlı hücre görüntüleme için bir oda kurmak için bir protokol mevcut.

Büyüme Konileri Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için Aplysia Nöronal Hücre Kültürleri

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

neuronal-cell-cultures-from-aplysia-for-high-resolution-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Görüntüleme.  Purdue University. Aplysia californica nöronların büyüme konisinin motilite ve rehberlik yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mükemmel bir büyük kültür büyüme konileri gelişir. Burada, diseksiyon ve Aplysia çanta hücresi nöronların kaplama gibi canlı hücre görüntüleme için bir oda kurmak için bir protokol mevcut.

Video: Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Biyoloji

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

Rat splenositlerin T Hücre Büyüme Faktörü hazırlanması

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

Hazırlanması Aplysia Duyusal-motor Nöronal Hücre Kültürleri

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Tek Hücrelerde Zebra balığı Segmentasyon Clock Görüntüleme Dağınık Presomitic Mesoderm Hücre Kültürleri Üretimi

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Büyüme Konileri

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...