Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R03NS131908) ve Savunma Bakanlığı tarafından W81XWH-22-1-0517 Ödül No'lu Multipl Skleroz Araştırma Programı aracılığıyla desteklenmiştir. Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve tavsiyeler yazara aittir ve Savunma Bakanlığı tarafından onaylanması gerekmez. Bu çalışma aynı zamanda East Carolina Üniversitesi başlangıç fonları tarafından da desteklenmiştir.

Fareleri içeren tüm prosedürler, Doğu Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan deneysel kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışmada 8-10 haftalık yaşları arasında vahşi tip C57BL/6J dişi fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. EAE, daha önce yayınlanmış 12,13,14 raporlarını takiben indüklenmiştir.
1. Serum toplama
<ol><li>Deney faresini, MOG35-55 bağışıklaması yoluyla EAE'yi indükledikten sonra gerekli zaman noktasında (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) CO2 boğulması veya izofluran doz aşımı ile ötenazi yapın. NOT: Toplam fare sayısı ve serum toplanması için zaman noktaları, spesifik deneye göre değişebilir.</li>
	<li>Hayati belirtilerin yokluğu ayak parmağı veya kuyruk tutamağı ile onaylandıktan sonra, fareyi bir diseksiyon tepsisine dorsal yaslanma pozisyonuna getirin ve uzuvları pim veya bantla yerine sabitleyin. Hayvanın göğüs kafesini aydınlatmak için fare gövdesini LED ışık kaynağına yönlendirin ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Fare kürküne %70 etanol püskürtün ve herhangi bir organ ve ana damardan kaçınmaya dikkat ederek, disektör makasını kullanarak karın boyunca pelvisten ksifoide kadar 3-4 cm'lik bir orta hat kesisi yapın (Şekil 1A-C). Prosedürü kolaylaştırmak için, cildi ksifoid süreci boyunca tutmak için forseps kullanın.</li>
	<li>Diyaframı yanlamasına kesin ve ardından yaylı makas kullanarak göğüs kafesini her iki yan kenardan önden kesin, orta hatta sternuma ulaşmadan önce durun (Şekil 1D). Kalbi ortaya çıkarmak için fare kafasının üzerinde oluşturulan kaburga kanadını katlayın (Şekil 1E). NOT: Sternumun kesilmesinden kaçınılmalıdır çünkü bu, kemiğe bitişik olarak yatan ana torasik arterlere zarar verecek ve toplanabilecek kan hacmini azaltacaktır.</li>
	<li>1 mL'lik bir şırıngaya bağlı 25 G'lik bir iğneyi sol ventriküle sokun ve pistonu yavaşça geri çekerek kanı toplayın (Şekil 1F). İğne delinmesini kolaylaştırmak için, kalbi bir çift forseps'e karşı nazikçe destekleyin. NOT: Kan şırınganın içine hemen girmezse, iğne yavaşça döndürülmeli ve farklı bir açı test edilmelidir. Bununla birlikte, kalpte kanın dışarı sızabileceği gereksiz delikler oluşturmaktan kaçınmak için ilk denemede iğneyi düzgün bir şekilde yerleştirmek için çaba gösterilmelidir.</li>
	<li>Kanı 1,5 mL'lik steril bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca pıhtılaşmasına izin verin. Pıhtıyı 2000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyerek çıkarın. Serum fraksiyonunu temsil eden süpernatanı toplayın ve gelecekteki testler için tek kullanımlık alikotları -80 ° C'de kriyojenik tüplerde saklayın.</li>
</ol>2. ELISA testi
<ol><li>10 mg / mL'lik bir stok elde etmek için liyofilize MOG35-55 peptidini (Malzeme Tablosuna bakınız) suda yeniden süspanse edin. Deneye başlamadan önce, stoğu kaplama tamponunda 10 μg/mL'ye seyreltin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve nihai çözeltinin 100 μL/oyusunu 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin. Buharlaşmayı önlemek için plakayı yapışkan bir filmle kapatın ve plakayı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. NOT: Her numune için en az 2 kuyu hesaplanmalı ve boş bir kontrol için 2 ek kuyu da dahil edilmelidir.</li>
	<li>Paralel olarak, aynı sayıda oyuğu 10 μg / mL konsantrasyonda kaplama tamponunda çözülmüş 100 μL / kuyu sığır serum albümini (BSA) ile kaplayın. Bu ek kuyular arka plan kontrolleri olarak hizmet edecektir. NOT: Kaplama ve engelleme tamponları farklı bileşimlere sahip olduğundan, kontrol kuyularının BSA ile kaplanması tavsiye edilir. Diğer ensefalitojenik peptitlerin (PLP139-151 veya MBP84-104 gibi) BSA'ya alternatif olarak ilgisiz antijenler olarak kullanılabileceğini lütfen unutmayın.</li>
	<li>Ertesi gün, plakayı 3 kez% 0.05 Tween 20 (PBS-T) ile desteklenmiş 200 μL / kuyu fosfat tampon salin ile yıkayın. Daha sonra, PBS'de (Tween 20 olmadan) %3 BSA'dan yapılmış bir blokaj çözeltisinden 100 μL/kuyu ekleyin ve kapalı plakayı bir hibridizasyon fırınında 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Plakayı 200 μL/kuyu PBS-T ile 3 kez yıkayın. Her serum örneğini 1:100 oranında bloke edici solüsyon içinde seyreltin ve hem MOG35-55 hem de BSA kaplı kuyucuklara 100 μL / kuyu ekleyin. Boşluklar olarak belirlenen kuyucuklara aynı hacimde engelleme çözeltisi ekleyin. Plakayı kapalı olarak oda sıcaklığında 2 saat boyunca sürekli çalkalayarak (250 rpm) inkübe edin.</li>
	<li>Plakayı 200 μL/kuyu PBS-T ile 3 kez yıkayın. HRP ile konjuge ikincil antikoru (1:2000, Malzeme Tablosuna bakınız) PBS-T'de% 0.2 BSA'dan yapılmış bir çözelti içinde seyreltin ve tüm kuyucuklara 100 μL / kuyu ekleyin. Plakayı kapalı olarak oda sıcaklığında 1 saat boyunca sürekli çalkalayarak (250 rpm) inkübe edin.</li>
	<li>Plakayı 200 μL/kuyu PBS-T ile 3 kez yıkayın. Tüm kuyucuklara 100 μL/kuyu 3,3',5,5' tetrametilbenzidin (TMB) substratı (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve karanlıkta 1-5 dakika inkübe ederek mavi bir rengin gelişimini izleyin.<ol><li>100 μL/kuyu durdurma çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 450 nm dalga boyuna ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak her kuyucuktaki optik yoğunluğu (OD) ölçün. NOT: TMB substratı, kuyucuklara eklenmeden önce 30-60 dakika oda sıcaklığında dengelenmelidir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Veri analizi
<ol><li>Bir Excel elektronik tablosunu plakadan okunan OD değerleriyle doldurun. Her numune için çift kuyulardan (hem MOG35-55 hem de BSA kaplı) elde edilen OD değerlerinin ortalamasını alın.</li>
	<li>Her numune için, BSA kaplı kuyucukların ortalama değerini MOG35-55 kaplı kuyucukların değerinden çıkarın. Elde edilen arka plan düzeltilmiş değerler, farklı serum örneklerinde anti-MOG35-55 antikorlarının konsantrasyonu ile orantılı olacaktır. NOT: Boş kuyular, 0 civarında düzeltilmiş değerlerle sonuçlanmalıdır.</li>
	<li>İki deneysel koşul arasındaki ortalama OD değerlerini karşılaştırmak için Mann-Whitney U testi gibi parametrik olmayan bir istatistiksel test uygulayın. Her koşul için en az 3 bağımsız örnek ekleyin.</li>
</ol>

Otoimmün Demiyelinizasyonda Humoral Yanıtın İncelenmesi

<ol>
	<li>Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis.">Multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).</li><li>Baranzini, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+repertoire+diversity+and+clonal+expansion+in+multiple+sclerosis+brain+lesions.">B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions.</a> J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).</li><li>Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibodies+associated+with+myelin+damage+in+multiple+sclerosis.">Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+hypomethylation+programs+underpin+b+cell+activation+in+early+multiple+sclerosis.">Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).</li><li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+interferon+beta-1a+in+relapsing+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).</li><li>Montalban, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+placebo+in+primary+progressive+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).</li><li>Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+multiple+sclerosis:+Advantages+and+limitations+towards+better+therapies.">Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies.</a> Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).</li><li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis.">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).</li><li>Khare, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-specific+antibodies+from+multiple+sclerosis+patients+exacerbate+disease+in+a+humanized+mouse+model.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model.</a> J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).</li><li>Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+antibodies+recognize+glycosylated+epitopes+and+perturb+oligodendrocyte+physiology.">Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).</li><li>Flach, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody-boosted+t-cell+reactivation+in+the+target+organ+triggers+manifestation+of+autoimmune+cns+disease.">Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-1+regulates+b+cell+function+and+the+severity+of+autoimmune+experimental+encephalomyelitis.">Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+tau+methylation+patterns+and+synaptic+transcriptional+alterations+are+associated+with+neural+vulnerability+during+chronic+neuroinflammation.">Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation.</a> J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).</li><li>Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte-specific+argonaute+profiling+identifies+micrornas+associated+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).</li><li>Lanz, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+b+cells+in+multiple+sclerosis+bind+ebv+ebna1+and+glialcam.">Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam.</a> Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkar beyan etmezler.

Burada, MS patolojisinin ilgili bir hayvan modelinde humoral yanıtı doğru bir şekilde ölçmek için basit ve etkili bir ELISA tabanlı protokol bildirilmiştir. Bu yöntem, MOG35-55 / C57BL6J EAE paradigma12'deki otoantikorların serum seviyelerini kontrol etmede ataksin-1 proteininin yeni rolünü tanımlamak için yakın zamanda kullanılmıştır. Bu bağlamda, bu yöntemle tutarlı ve biyolojik olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için bir dizi faktör göz önünde bulundurulmalıdır.<...

Multipl skleroz (MS), immün hücrelerin beyin parankimine fokal infiltrasyonu, aksonları saran miyelin kılıflarının parçalanması, glia aktivasyonu ve nöronal kayıp ile karakterize merkezi sinir sisteminin (MSS) kronik otoimmün bir hastalığıdır1. Patojenik T hücrelerinin iyi bilinen rolüne ek olarak, çok sayıda kanıt, B hücrelerinin CNS'ye karşı otoimmün tepkiye aracılık etmede rol oynadığını vurgulamıştır. B hücreleri MS beyninde klonal genişlemeye uğrar ve demiyelinize lezyonlarda miyelin bileşenlerine karşı antikorlar tespit edilmiştir 2,3. Hastalık başlangıcında periferik B hücrelerinin seçici aktivasyonu yakın zamanda belgelenmiştir, bu da bu bağışıklık hücresi bölmesinin hastalığın başlangıcında da varsayılan bir rol oynadığını düşündürmektedir4. Anti-CD20 monoklonal antikorları gibi B hücresini tüketen tedavilerin başarısı, anormal B hücresi fonksiyonu ile otoimmün demiyelinizasyonarasındaki mekanik bağlantıyı daha da doğrulamaktadır 5,6. Moleküler açıdan bakıldığında, B hücreleri otoantijen sunumu, proinflamatuar sitokin sekresyonu ve otoreaktif antikor üretimi yoluyla hastalığa katkıda bulunabilir.
Karmaşık MS fenotipinin spesifik özelliklerini özetlemek için çoklu hayvan modelleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) en yaygın kullanılanıdır in vivo paradigma ve deney hayvanlarının miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG) ve miyelin bazik proteini (MBP) gibi miyelin proteinlerinden türetilen kısa peptitlerle aşılanmasına dayanır7. EAE ile aşılanmış hayvanlar, ensefalitojenik peptit8'e karşı sağlam bir humoral yanıt da dahil olmak üzere birçok yönden MS'e benzeyen demiyelinizan bir patoloji geliştirir. Bu nedenle, EAE çalışmaları, hastalık bağlamında B hücrelerinin ve otoantikorların fonksiyonunu incelemede etkili olmuştur. Örneğin, MS hastalarından izole edilen MOG'a özgü antikorların EAE modellerinde klinik seyri ağırlaştırabileceği gösterilmiştir9. Özellikle, insan MOG'unda 42. pozisyondaki prolin kalıntısının, otoantikor patojenitesini10 belirlemek için kritik olduğu gösterilmiştir. Daha yakın zamanlarda, MOG'a özgü otoantikorların sadece miyelin kaybına aracılık ederek değil, aynı zamanda CNS11 içindeki otoreaktif T hücrelerinin yeniden aktivasyonunu artırarak da hastalığı teşvik ettiği bulunmuştur. 
CNS otoimmünitesinde antikor yanıtlarının önemi göz önüne alındığında, bu makale, MOG35-55 peptid ile aşılanmış C57BL / 6J farelerde otoreaktif antikorların serum seviyelerini etkili bir şekilde ölçmek için ELISA tabanlı bir protokol sunmaktadır. Protokolün ilk bölümünde, intrakardiyak ponksiyon yoluyla serum toplama yöntemi anlatılacaktır. Daha sonra, ELISA testini kurma ve verileri elde etme prosedürleri detaylandırılacaktır. Son olarak, veri analizi ve yorumlanması tartışılacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N301</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive seals</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J female mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-500-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S111022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA coating buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421701</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Analysis spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1030-05</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AMPSILED21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-377-575&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MOG35-55 peptide</td>
			<td>EZBiolab</td>
			<td>cp7203</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-12-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96-well plates</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>445-0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of autoreactive antibodies in mice upon experimental autoimmune encephalomyelitis

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), otoimmün hastalık multipl sklerozu (MS) histopatolojik ve moleküler düzeyde özetleyen bir hastalık modelidir. EAE, immün yanıtı artırmak için spesifik adjuvanlarla birlikte kısa miyelin peptitlerinin deri altı enjeksiyonu yoluyla deney hayvanlarının aşılanmasıyla indüklenir. İnsan muadili gibi, EAE fareleri de demiyelinizan lezyonlar, merkezi sinir sistemine (CNS) bağışıklık hücresi infiltrasyonu, glia aktivasyonu ve nöronal hasar geliştirir. Tutarlı bir kanıt grubu, hem MS hem de EAE'nin etiyolojisinde B hücre disfonksiyonu için mekanik bir rolü desteklemektedir. B hücreleri, antijen sunan hücrelerin yanı sıra birincil proinflamatuar sitokinler ve otoantikor kaynağı olarak da hizmet edebilir. EAE'de, hastalığı indüklemek için kullanılan miyelin peptitlerine karşı antikorlar üretilir. Bu tür otoantikorların, CNS'ye miyelin kaybına veya patojenik T hücresi reaktivasyonuna aracılık ettiği gösterilmiştir. Bu makale, miyelin oligodendrosit glikoprotein 35-55 (MOG35-55) peptidi ile aşılanmış C57BL/6J farelerinin serumundaki otoantikorları ölçmek için etkili bir ELISA tabanlı protokolü açıklamaktadır. Önerilen yöntem, otoimmün demiyelinizasyon bağlamında anormal humoral yanıtın özgüllüğünü ve büyüklüğünü araştırmak için güçlü bir araç olarak hizmet eder.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by focal infiltration of immune cells into the brain parenchyma, breakdown of myelin sheaths wrapping axons, glia activation, and neuronal loss1. In addition to the well-established role of pathogenic T cells, multiple lines of evidence have highlighted the involvement of B cells in mediating the autoimmune response against the CNS. B cells undergo clonal expansion in the MS brain and antibodies against myelin components have been detected within demyelinated lesions2,3. The selective activation of peripheral B cells at disease onset has been recently documented, suggesting a putative role for this immune cell compartment in disease initiation as well4. The success of B cell-depleting therapies such as anti-CD20 monoclonal antibodies further corroborates the mechanistic connection between aberrant B cell functioning and autoimmune demyelination5,6. From a molecular standpoint, B cells can contribute to disease via autoantigen presentation, pro-inflammatory cytokine secretion, and autoreactive antibody production.
Multiple animal models have been developed to recapitulate specific features of the complex MS phenotype. Among them, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most widely used in vivo paradigm and relies on the immunization of experimental animals with short peptides derived from myelin proteins such as myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) and myelin basic protein (MBP)7. EAE immunized animals develop a demyelinating pathology that resembles MS in many aspects, including a robust humoral response against the encephalitogenic peptide8. For this reason, EAE studies have been instrumental in dissecting the function of B cells and autoantibodies in the context of disease. For instance, it was demonstrated that MOG-specific antibodies isolated from MS patients can aggravate the clinical course in EAE models9. Notably, the proline residue at position 42 in human MOG was shown to be critical for determining autoantibody pathogenicity10. More recently, MOG-specific autoantibodies have been found to promote disease not only by mediating myelin loss but also via boosting the reactivation of autoreactive T cells within the CNS11. 
Considering the importance of antibody responses in CNS autoimmunity, this article presents an ELISA-based protocol to efficiently measure the serum levels of autoreactive antibodies in C57BL/6J mice EAE immunized with MOG35-55 peptide. In the first part of the protocol, the method to collect serum via intracardiac puncture will be described. Subsequently, the procedures to set up the ELISA assay and acquire the data will be detailed. Lastly, data analysis and interpretation will be discussed.

Yazar Spotlight: Multipl Skleroz Araştırmalarında B Hücresi Yanıtlarını İncelemek İçin Yeni Test

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

So the focus of our laboratory is to understand the molecular basis of multiple sclerosis, a immune disease of the central nervous system that is characterized by demyelination, neuroinflammation, and axonal injury. So this protocol represent an economical and flexible alternatives to commercial kits. Our can be easily adjusted to test B-cell antibody responses against different EEA peptides.My lab is devoted to further understanding the connection between neuroinflammation and neurodegeneration in chronic neurological diseases such as multiple sclerosis.

Mevcut ELISA testinin sağlamlığını göstermek için, yöntem, tam Freund adjuvanında (CFA) 100 μg MOG35-55 peptid ile bağışıklamadan 20 gün sonra (dpi) bir C57BL / 6J dişi fare kohortundan izole edilen serum numuneleri üzerinde test edildi (CFA) doğrulanmış bir EAE indüksiyon protokolünü takiben 12,13,14. Hayvanlar ayrıca 0. ve 2. günlerde 400 ng boğmaca toksini aldı. Sahte aşılanmış hayvanlardan alı...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan hastalığı ile güçlü bir humoral otoimmün yanıtı paylaşan bir multipl skleroz (MS) hayvan modelidir. Burada, EAE ile aşılanmış farelerin serumundaki otoantikorları ölçmek için basit ve esnek bir ELISA protokolü bildiriyoruz.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological ...

Bu nedenle laboratuvarımızın odak noktası, demiyelinizasyon, nöroinflamasyon ve aksonal yaralanma ile karakterize merkezi sinir sisteminin bir bağışıklık hastalığı olan multipl sklerozun moleküler temelini anlamaktır. Dolayısıyla bu protokol, ticari kitlere ekonomik ve esnek bir alternatif sunar. Farklı EEA peptitlerine karşı B hücresi antikor tepkilerini test etmek için kolayca ayarlanabilir.Laboratuvarım, multipl skleroz gibi kronik nörolojik hastalıklarda nöroinflamasyon ve nörodejenerasyon arasındaki bağlantıyı daha iyi anlamaya adanmıştır.

quantification-autoreactive-antibodies-mice-upon-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

499 Görüntüleme.  East Carolina University. Bu nedenle laboratuvarımızın odak noktası, demiyelinizasyon, nöroinflamasyon ve aksonal yaralanma ile karakterize merkezi sinir sisteminin bir bağışıklık hastalığı olan multipl sklerozun moleküler temelini anlamaktır. Dolayısıyla bu protokol, ticari kitlere ekonomik ve esnek bir alternatif sunar. Farklı EEA peptitlerine karşı B hücresi antikor tepkilerini test etmek için kolayca ayarlanabilir.Laboratuvarım, multipl skleroz gibi kronik nörolojik hastalıklarda n?...

Video: Yazar Spotlight: Multipl Skleroz Araştırmalarında B Hücresi Yanıtlarını İncelemek İçin Yeni Test

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological and molecular levels. EAE is induced by immunizing experimental animals via subcutaneous injection of short myelin peptides together with specific adjuvants to boost the immune response. Like the human counterpart, EAE mice develop demyelinating lesions, immune cell infiltration into the central nervous system (CNS), glia activation and neuronal injury. A consistent body of evidence also supports a mechanistic role for B cell dysfunction in the etiology of both MS and EAE. B cells can serve as antigen-presenting cells as well as a primary source of pro-inflammatory cytokines and autoantibodies. In EAE, antibodies are generated against the myelin peptides that were employed to induce the disease. Such autoantibodies have been shown to mediate either myelin loss or pathogenic T cell reactivation into the CNS. This article describes an efficient ELISA-based protocol to quantify autoantibodies in the serum of C57BL/6J mice immunized with the myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55) peptide. The proposed method serves as a powerful tool to investigate the specificity and magnitude of the aberrant humoral response in the context of autoimmune demyelination.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis (MS), which shares with the human disease a robust humoral autoimmune response. Here, we report a simple and flexible ELISA protocol to quantify autoantibodies in the serum of EAE immunized mice.

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Serum Collection via Intracardiac Puncture in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Immunized Mice

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit (EAE) Aşılanmış Farelerde İntrakardiyak Delinme Yoluyla Serum Toplanması

Quantification of Autoantibodies in the Serum of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Immunized Mice Using ELISA

Begin by re-suspending the lyophilized MOG 35 55 peptide in water. Dilute the peptide stock to 10 micrograms per milliliter in coating buffer before the experiment. Now pipette 100 microliters of the final solution into wells of a 96 well plate.Simultaneously coat an equal number of wells with 100 microliters of BSA dissolved in coating buffer. Seal the plate with an adhesive film to prevent evaporation and incubate the plate overnight at four degrees Celsius. The next day, perform three washes of the plate with 200 microliters of PBS supplemented with 0.5%tween 20.Subsequently add 100 microliters per well of a blocking solution composed of 3%BSA in PBS. Incubate the sealed plate for one hour at 37 degrees Celsius in a hybridization oven. After incubation, wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST.Dilute each serum sample obtained from the blood of EAE immunized mice in blocking solution and add 100 microliters per well to both MOG 35 55 and BSA coated wells. Add the same volume of blocking solution to designated blank wells. Incubate the sealed plate for two hours at room temperature with constant shaking.After incubation, remove the plate from the incubator and rinse the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Dilute the HRP conjugated secondary antibody in a solution consisting of 0.2%BSA in PBST and add 100 microliters to each well. Incubate the sealed plate for one hour at room temperature maintaining constant shaking.Wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Add 100 microliters of three, three prime, five, five prime tetramethyl benzidine substrate to each well. Incubate in the dark for one to five minutes monitoring the development of a blue color.Add 100 microliters of stop solution to each well. Then use a plate reader set at a wavelength of 450 nanometers to measure the optical density in each well. The optical density values of the EAE samples were significantly higher than the control samples indicating a robust immunoglobulin G response against the MOG peptide.