Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82130113), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82204765), Sichuan Doğa Bilimleri Vakfı (2022NSFSC1470), Sichuan İli Doktora Sonrası Özel Finansman Projesi (TB2023020) ve Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi (BSH2021030) Xinglin Scholars Araştırma Teşvik Programı tarafından finanse edilmiştir. Bu fonlar deney ekipmanı, deney materyali ve yayın ücretleri açısından destek sağlamaktadır.

1. Hazırlık
<ol><li>Numune hazırlama<ol><li>3 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 0,25 g (kuru ağırlık) APB'yi tartmak için 1/10.000 hassasiyet terazisi kullanın, 2,5 mL metanol ekleyin ve ardından 30 dakika boyunca sonikasyon yapın (güç 240 W, frekans 40 kHz).</li>
		<li>5 dakika boyunca 1,2 x g'da santrifüjleme yapın, süpernatanı toplayın ve 0,22 μm gözenek boyutuna sahip bir membran filtreden süzün.</li>
	</ol></li>
	<li>Deney materyallerinin hazırlanması<ol><li>İki boyutlu mobil fazı hazırlayın, organik faz B fazı olarak asetonitril kullanın ve sulu faz A olarak %0.1 formik asit ultra saf suyu yapılandırın.</li>
		<li>İki fazlı filtrasyon (0.22 μm) gerçekleştirin ve 15 dakika boyunca bir ultrason makinesi (40 kHz) kullanarak sonikasyon yapın. Kabarcıkları çıkarmak için değiştirilen mobil fazı temizleyin. Bu deneyde 1 boyutlu kolon olarak C18 kolonu kullanılmış, 2 boyutlu kolon olarak hidrofilik kolon kullanılmış ve kolon alete monte edilmiştir.</li>
	</ol></li>
	<li>Uygun şönt oranının ayarlanması<ol><li>2D-LC cihaz çıkış hattını bir tişört üzerinden kütle girişine ve tişörtün diğer ucunu şönt bir hatta bağlayın. Kütle spektrumuna akış hızının 0.3-0.5 mL/dk olduğundan emin olmak için akış hızını uygun bir değere ayarlayın. NOT: 2D-LC'nin ikinci boyutu genellikle 2 mL/dk'nın üzerine ayarlandığından, bu akış hızı MS için çok büyüktür, bu nedenle bir bölme yapmak gerekir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 2D-LC işlemi
<ol><li>Instrument 1 Online simgesine çift tıklayın, kimyasal iş istasyonu otomatik olarak 1260 LC ile iletişim kuracak ve iş istasyonuna girecektir.</li>
	<li>2D-LC yöntemi parametre ayarı için, normalde varsayılan olarak girilecek olan istenen arayüzü çağırmak için Görünüm menüsünden Yöntem ve Kontrolü Çalıştır ekranını seçin. Enjektör modülüne tıklayın, Yöntem'e sağ tıklayın, 1D pompanın enjeksiyon hacmini, akış hızını ve mobil faz zaman gradyanını ayarlayın.</li>
	<li>Durdurma Zamanı altına örnek çalışma süresini girin. Enstrüman ana menüsüne tıklayın ve açılır menüden 2D-LC Metodu'na tıklayın. 2D-LC modunda Kapsamlı'yı seçin. Modülasyon zamanında 2 dakika, 2D Gradyan Durdurma zamanında 1,9 dakika girin. Akış Ayarlarını 2 mL olarak ayarlayın. 2D Gradyanı düzenleyin ve dalga boylarına ayarlayın. Yöntemi düzenledikten sonra, yeni yöntemi adlandırmak için Yöntem menüsünde Yöntemi Farklı Kaydet'i seçin ve ardından Tamam'ı tıklatın. NOT: Harici transfer pompası, akış hızının manuel olarak ayarlanmasını gerektirir.</li>
</ol>3. MS işlemi
<ol><li>Vakum pompasının anahtarını AÇIN. Argon silindiri ana valfini ve basınç bölücü valfini açın ve basıncı yaklaşık 0,3 MPa'ya ayarlayın. Nitrojen valfini açın.</li>
	<li>Deney koşulları için yeterli vakum sağlamak için en az 8 saat bekleyin. Analizden önce argon ve nitrojenin hava basıncının yeterince yüksek olduğunu kontrol edin.</li>
	<li>MS kontrol yazılımını başlatmak için, yazılım panelindeki Isıtma SEI Kaynağına tıklayın ve ısıtıcı sıcaklığı (350 °C), kılıf akış hızı (35 arb), yardımcı hava akış hızı (15 arb), püskürtme voltajı (pozitif modda 3,8 KV, negatif modda -2,5 KV) ve kılcal sıcaklık (275 °C) dahil olmak üzere MS parametrelerini girin. İyon kaynağını etkinleştirmek için Uygula düğmesine tıklayın.</li>
	<li>MS yöntemini ayarlamak için, alım süresini, polariteyi, kütle aralığını, aktarım değeri numarasını, aktarım değeri süresini ve daha fazlasını yapılandırmak için değerler girin. MS Çalışma Süresini Ayarlayın (dk): 93.00. ScanEvent Ayrıntılarını Ayarlayın: ITMS + c norm o (100.0-1200.0), CV=0.0v. ITMS + c normu Dep MS/MS, (1)'den en yoğun iyon: Aktivasyon Tipi: CID, Min. Gerekli Sinyal: 500, İzolasyon Genişliği: 2.00, Normalleştirilmiş Coll. Enerji: 35.0, Varsayılan Şarj Durumu: 3, Aktivasyon S: 0.250, Aktivasyon Süresi: 93.000. Veriye bağlı ayarları yapmak için, devre dışı, Nötr kaybı üstte: 3, Ürün üstte: 3 olarak ayrı polarite ayarları kullanın. Ayarları cihaz yöntemi olarak yapılandırmak için Kaydet'e tıklayın. NOT: Çalışma süresinin sonu 2D-LC ile tutarlıdır.</li>
	<li>Sıra tablosunu açmak için Sıra Ayarı düğmesine tıklayın. Forma numune türünü, dosya adını, yolunu, numune kimliğini, cihaz yöntemini, konumu, enjeksiyon miktarını ve diğer bilgileri girin.</li>
	<li>Tıkla İndirim Dizi listesini kaydetmek için düğmesine basın, ardından Analizi Başlat MS alımını ayarlamak ve başlatmak için düğmesine basın. 2D-LC cihazında Kontrolü Çalıştır'a tıklayın ve Çalıştırma Yöntemi'ni seçin. Aynı zamanda, MS cihazı da Çalıştır düğmesine tıklar. NOT: Bu deneyde 2D-LC ve MS aynı yazılım tarafından kontrol edilmediğinden, her iki cihazda da ayrı ayrı kurulmaları gerekir.</li>
</ol>4. Moleküler ağ çalışması
<ol><li>Veri hazırlama: 2D-HPLC-MS ham kütle spektral verilerini dışa aktarın ve ikincil kütle spektral verilerini ProteoWizard'ın Msconvert'i aracılığıyla mzXML veya mzML verilerine dönüştürün. (http://proteowizard.sourceforge.net/).</li>
	<li>Veri yüklemek için resmi web sitesinden WinSCP yazılımını indirin ve mzML verilerini FTP protokolü aracılığıyla GNPS tarafından oluşturulan hesaba yükleyin. Kurulum tamamlandıktan sonra WinSCP'yi başlatın.</li>
	<li>GNPS FTP sunucusuna bağlanın: WinSCP arayüzünde, Oturum yapılandırma sayfasında, aşağıdaki bağlantı bilgilerini doldurun: Dosya protokolü: FTP'yi seçin. Ana Bilgisayar Adı için: massive.ucsd.edu. girin, bağlantı noktası numarası için: Varsayılan 22'yi koruyun.</li>
	<li>Hesap numarasını ve şifreyi girin. Yukarıdaki bilgileri doldurduktan sonra GNPS FTP sunucusuna bağlantı kurmak için Giriş Yap butonuna tıklayınız.</li>
	<li>Bir web tarayıcısı açarak ve GNPS web sitesini ziyaret ederek moleküler ağlar oluşturun (https://gnps.ucsd.edu/). Yeni kullanıcıların bir hesaba kaydolması ve ardından oturum açması gerekir.</li>
	<li>GNPS web sitesinin ana arayüzünde, üst gezinme çubuğundaki Görevler sekmesine tıklayın ve açılır menüden Yeni Bir Görev Oluştur'u seçin. Görev oluşturma sayfasında, Dosya Ekle düğmesine tıklayın, ardından veri dosyasını seçin ve yükleyin. (örneğin, mzML biçimi).</li>
	<li>Görev Parametreleri sekmesinde, MN'yi oluşturan çeşitli parametreleri ayarlayın. Bu parametreler arasında tepe çıkarma algoritması, tepe aşırı hareket değeri, benzerlik hesaplama yöntemi vb. bulunur. Gerektiği gibi uygun parametre ayarlarını yapın. Görevi çalıştırmak için sayfanın alt kısmındaki Analizi Başlat düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Görev çalıştıktan sonra, oluşturulan görevi görev listesinde bulun ve analiz sonuçlarını görüntülemek için Hizmet Adı'na tıklayın. Web sitesi MN diyagramları, ikameler, simbiyotik ağlar ve diğer ilgili bilgileri sağlar.</li>
</ol>

Tibet Tıbbi Bitkisi APB'nin Moleküler Ağ ile 2D-HPLC-MS Kullanılarak Analiz Edilmesi

<ol>
	<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+Tibetan+and+traditional+Chinese+medicine+body+constitutions:+A+cross-sectional+study+of+Tibetan+college+students+in+the+Tibet+Autonomous+Region.">Correlation between Tibetan and traditional Chinese medicine body constitutions: A cross-sectional study of Tibetan college students in the Tibet Autonomous Region.</a> J Tradl Chinese Med Sci. 5 (3), 215-221 (2018).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+identification+of+compound+structure+in+Tibetan+medicine+using+ion+trap+mass+spectrometry+and+multiple-stage+fragmentation+analysis.">Standardized identification of compound structure in Tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis.</a> J Vis Exp. (193), 65054 (2023).</li><li>Kumar, P. R., Dinesh, S. R., Rini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCMS-a+review+and+a+recent+update.">LCMS-a review and a recent update.</a> J Pharm Pharm Sci. 5, 377-391 (2016).</li><li>Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+identification+and+quantitative+analysis+of+the+phytochemicals+of+traditional+Chinese+medicine+by+LC-MS/MS.">Strategy for the identification and quantitative analysis of the phytochemicals of traditional Chinese medicine by LC-MS/MS.</a> Acta Pharm Sinica. 55 (7), 1494-1503 (2020).</li><li>Iguiniz, M., Heinisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+liquid+chromatography+in+pharmaceutical+analysis.+Instrumental+aspects,+trends+and+applications.">Two-dimensional liquid chromatography in pharmaceutical analysis. Instrumental aspects, trends and applications.</a> J Pharma Biomed Anal. 145, 482-503 (2017).</li><li>Ye, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+progress+of+2D-LC+in+analysis+and+quality+control+of+traditional+Chinese+medicine.">Application progress of 2D-LC in analysis and quality control of traditional Chinese medicine.</a> Chem Reag. 44 (8), 1103-1110 (2022).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+comprehensive+two-dimensional+hydrophilic+interaction+chromatography+x+reversed-phase+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+phenolic+acids+in+Salvia+miltiorrhiza.">Online comprehensive two-dimensional hydrophilic interaction chromatography x reversed-phase liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry for the analysis of phenolic acids in Salvia miltiorrhiza.</a> J Chromatogr A. 1536, 216-227 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+characterization+of+phenolic+and+diterpenoid+constituents+in+Danshen+(Salvia+miltiorrhiza)+by+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass.">Qualitative and quantitative characterization of phenolic and diterpenoid constituents in Danshen (Salvia miltiorrhiza) by comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass.</a> J Chromatogr. 1427, 79-89 (2016).</li><li>Wang, J., Ren, X., Wen, C., Xu, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+characterization+of+unknown+impurities+in+rutin+tablets+using+trap-free+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+ion+trap/time-of-flight+mass+spectrometry.">Separation and characterization of unknown impurities in rutin tablets using trap-free two-dimensional liquid chromatography coupled with ion trap/time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (10), e8739 (2020).</li><li>Ma, L. J., Ma, N., Cao, J. L., Wan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+influence+of+different+drying+methods+on+chemical+components+of+Panax+notoginseng+leaves+by+heart-cutting+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+orbitrap+high-resolution+mass+spectrometry.">Characterizing the influence of different drying methods on chemical components of Panax notoginseng leaves by heart-cutting two-dimensional liquid chromatography coupled to orbitrap high-resolution mass spectrometry.</a> Food Chem. 369, 130965 (2022).</li><li>Wong, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+profiling+of+Glycyrrhiza+glabra+extract+with+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography-mass+spectrometry+using+multi-segmented+shift+gradients+in+the+second+dimension:+Expanding+the+metabolic+coverage.">Untargeted profiling of Glycyrrhiza glabra extract with comprehensive two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry using multi-segmented shift gradients in the second dimension: Expanding the metabolic coverage.</a> Electrophoresis. 39 (15), 1993-2000 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensively+qualitative+and+quantitative+analysis+of+ginsenosides+in+Panax+notoginseng+leaves+by+online+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+with+deeply+optimized+dilution+and+modulation+system.">Comprehensively qualitative and quantitative analysis of ginsenosides in Panax notoginseng leaves by online two-dimensional liquid chromatography coupled to hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry with deeply optimized dilution and modulation system.</a> Anal Chim Acta. 1079, 237-251 (2019).</li><li>Nothias, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature-based+molecular+networking+in+the+GNPS+analysis+environment.">Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment.</a> Nat methods. 17 (9), 905-908 (2020).</li><li>Qin, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS/MS-based+molecular+networking:+an+efficient+approach+for+natural+products+Dereplication.">MS/MS-based molecular networking: an efficient approach for natural products Dereplication.</a> Molecules. 28 (1), 157 (2023).</li><li>Qu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multidimensional+chromatography-mass+spectrometry+and+feature-based+molecular+networking+methods+for+the+systematic+characterization+of+compounds+in+the+supercritical+fluid+extract+of+Tripterygium+wilfordii+Hook+F.">Combining multidimensional chromatography-mass spectrometry and feature-based molecular networking methods for the systematic characterization of compounds in the supercritical fluid extract of Tripterygium wilfordii Hook F.</a> Analyst. 148 (1), 61-73 (2023).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+analytical+strategy+integrating+offline+two-dimensional+liquid+chromatography+with+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+and+molecular+networking:+Comprehensive+characterization+of+HuangLian+JieDu+Decoction+as+a+case+study.">An enhanced analytical strategy integrating offline two-dimensional liquid chromatography with high-resolution accurate mass spectrometry and molecular networking: Comprehensive characterization of HuangLian JieDu Decoction as a case study.</a> J Sep Sci. 45 (14), 2734-2745 (2022).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+Sanguisorba+officinalis+using+offline+two-dimensional+mixed-mode+liquid+chromatography+&#215;+reversed-phase+liquid+chromatography,+tandem+high-resolution+mass+spectrometry,+and+molecular+network.">Comprehensive profiling of Sanguisorba officinalis using offline two-dimensional mixed-mode liquid chromatography &#215; reversed-phase liquid chromatography, tandem high-resolution mass spectrometry, and molecular network.</a> J Sep Sci. 45 (10), 1727-1736 (2022).</li><li>Chen, Y., Montero, L., Luo, J., Li, J., Schmitz, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+new+at-column+dilution+(ACD)+modulator+for+the+two-dimensional+RP&#215;+HILIC+analysis+of+Buddleja+davidii.">Application of the new at-column dilution (ACD) modulator for the two-dimensional RP&#215; HILIC analysis of Buddleja davidii.</a> Anal Bioanal Chem. 412 (7), 1483-1495 (2020).</li><li>Zhou, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+action+and+toxicity+of+Aconite+and+its+main+components.">Pharmacological action and toxicity of Aconite and its main components.</a> Acta Pharm Sinica. (05), 394-400 (1983).</li><li>Shao, X., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+role+of+14-Benzoylaconine+in+rheumatoid+arthritis.">Progress in the role of 14-Benzoylaconine in rheumatoid arthritis.</a> Chinese J Pharmacol Toxicol. 33 (10), 917 (2019).</li><li>Hao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Study on the chemical constituents of the alkaloids from the root of Aconitum flavum HandMazz and its anti-tumor activities. , (2015).</li><li>Han, X., Hou, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+the+pharmacological+effects+and+toxicity+of+Aconitine.">Research progress on the pharmacological effects and toxicity of Aconitine.</a> J China Prescrip Drug. 12 (12), 149-150 (2014).</li></ol>

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Bu deneyin ana odak noktası, iki boyutlu sıvı faz ayrımı çerçevesinde kısmi bir yöntemin optimizasyonuydu. Bunu başarmak için, yeni bir kolon içi seyreltme modülatörü, iki boyutlu sıvı kromatografisi (2D-LC) sistemine sorunsuz bir şekilde entegre edildi. Bu teknik düzenleme, APB olarak bilinen Tibet tıbbında bulunan kimyasal bileşenlerin profilini çıkarma yetkinliğini önemli ölçüde artırdığı için büyük önem taşıyordu. 2D-HPLC-MS teknolojisinin dahil edilmesi, APB'nin karmaşık bile...

Tibet tıbbı, Tibet tıbbi uygulamalarının ilkelerine bağlı kalarak geleneksel Çin tıbbının ayrılmaz bir parçasıdır ve hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için kullanılır1. Bununla birlikte, Tibet bitkisel tıbbı, içerikte önemli dalgalanmalarla karakterize edilen karmaşık bitki kimyasal bileşenleri içerir. Temel biyoaktif elementlerin sınırlı anlaşılması, Tibet tıbbının modernizasyonunda bir darboğaz haline gelmiştir2. Kromatografinin güçlü ayırma gücünü kütle spektrometresinin (MS) yüksek hassasiyeti ile birleştiren sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) uygulaması, doğal tıp analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır3. Bununla birlikte, tek bir ayırma mekanizmasının sınırlandırılması nedeniyle, oldukça benzer yapılara sahip bileşenler, tek boyutlu sıvı kromatografisi ayırmada koelüte olma eğilimindedir. Sonraki kütle spektrometrik analizinde, yüksek bolluklu bileşenlerin neden olduğu iyon baskılanması nedeniyle düşük bolluklu ko-elüte bileşenlerin tespit edilmesi zordur4.
İki boyutlu yüksek performanslı sıvı kromatografisi anlamına gelen 2D-HPLC, bir çift sütun kullanarak farklı ayırma mekanizmalarını uyumlu bir şekilde birleştiren yeni bir kromatografik yöntemi temsil eder. Bu, normal faz kromatografisinin ters fazlı sıvı kromatografisi ile füzyonunu veya değişimini ve ters fazlı sıvı kromatografisi5 ile hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisini içerir. Bu tamamlayıcı kromatografik özelliklerin birleştirilmesiyle, karmaşık numune matrislerinin6 neden olduğu zorlukların etkin bir şekilde ele alındığı gelişmiş ayırma kabiliyeti elde edilir. Ayrıca, iki boyutlu kromatografiyi MS ile birleştirerek, 2D-HPLC'nin güçlü ayırma yeteneği ve MS'in yüksek hassasiyetli algılama yeteneği tamamen entegre edilebilir ve karmaşık ilaç sistemlerinin ve bunların temel bileşenlerinin incelenmesi için destek sağlar 7,8,9.
Tibet tıbbı genellikle, aktif bileşenlerin tipik olarak karmaşık bileşimlerde ve minimum konsantrasyonlarda bulunduğu çok yönlü bir dizi bileşen ve işlevsellik içerir. Sağlam bir ayırma sistemi olarak 2D-LC'yi ve son derece hassas bir dedektör olarak MS'i entegre ederek, karmaşık numunelerin ayırma ve tanımlama açısından ortaya çıkardığı zorluklar daha etkili bir şekilde ele alınabilir 10,11,12. Bu birleşme, Tibet tıbbının kimyasal bileşiminin araştırılmasına önemli ölçüde katkıda bulunur.
Geleneksel LC-MS veya 2D-LC-MS olup olmadığına bakılmaksızın, çok miktarda bilgi elde edilebilir. Bununla birlikte, bu büyük miktarda bilgiden karmaşık sistem bileşenlerinin yapısal bilgilerini çıkarmak her zaman önemli bir zorluk olmuştur. Bu nedenle, araştırmacılar MS verilerini taramak ve madenciliği yapmak için çeşitli yöntemler geliştirdiler. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), 2D-LC-MS kütle spektrometresi verilerinin yüklenebildiği bir MS/MS veri organizasyonu ve görselleştirme platformudur13. Her spektrum bir vektör olarak kabul edilir ve kosinüs benzerliği kullanılarak diğer tüm spektrumlarla karşılaştırılır. İki spektrum arasındaki benzerlik bir eşiği aştığında, bir moleküler ağa (MN) bağlanırlar. Bu, bilinen bileşiklerin hızlı bir şekilde tanımlanması ve çeşitli bilinmeyen doğal ürünlerin belirlenmesi için kullanılabilir14.
Tibet tıbbının genellikle birden fazla işlevi vardır, ancak karmaşık bileşimi ve önemli konsantrasyon farklılıkları, işlev ve maddi temel arasındaki ilişkiyi etkili bir şekilde açıklamayı zorlaştırır15. Tibet tıbbının derinlemesine incelenmesi, mümkün olduğu kadar çok bileşenin sistematik karakterizasyonunu gerektirir. Bu çalışma çerçevesinde, 2D-HPLC-MS teknolojisi ve MN teknolojisini kullanarak Tibet tıbbının karmaşık kimyasal bileşenlerini sistematik olarak incelemenin stratejisini ve sürecini göstermek için Tibet tıbbında APB'yi araştırma nesnesi olarak kullanmayı amaçlıyoruz. 2D kromatografik sistemin yapımında, APB16'nın karmaşık bileşenlerinin daha etkili bir şekilde ayrılmasını sağlamak için ters fazlı sıvı kromatografisi ve hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisini önemli ayırma mekanizmalarıyla birleştirdik. Ek olarak, iki boyut arasındaki çözücü uyumsuzluğunun üstesinden gelmek için, bir kolon içi seyreltme modülasyon modu benimsenmiştir. 2D-LC'nin güçlü ayırma kabiliyeti ile MS'in yüksek hassasiyetli algılama kabiliyeti birleştirilerek, APB'deki karmaşık bileşenlerin spektral bilgileri daha etkili ve kapsamlı bir şekilde elde edilir. Ayrıca, ağ ve büyük spektral bilgilerin MN teknolojisi ile görselleştirilmesi yoluyla, APB'nin bileşenleri sistematik olarak analiz edilir. Bu çalışmada gösterilen strateji ve sürecin, Tibet tıbbı kaynaklarını ilerletmek ve Tibet bitkileri için kalite kontrol standartlarını iyileştirmek için büyük önem taşıyan Tibet tıbbının maddi temeli üzerine araştırmaları teşvik ederek diğer Tibet ilaçlarının incelenmesine uygulanması beklenmektedir17. Genel deneysel süreç Şekil 1'de gösterilmiştir.
Burada sunulan deneyde, Agilent iki boyutlu sıvı kromatografisi (2D-LC) sistemine18 yeni bir kolon içi seyreltme modülatörü tanıtıldı. Bağımsız bir dağıtım pompası eklenerek, analizin akış yolu değiştirildi ve bu da 2D-LC analizinin yüksek bir ortogonalliği ile sonuçlandı. İki boyut arasındaki bağlantı ve geçiş, Şekil 2'de gösterildiği gibi iki adet altı vana ile gerçekleştirilir. Birinci boyutta bir örnek döngüsü doldurulduğunda, ikinci boyutta başka bir örnek döngüsü analiz edilir. Bu, 1D döngünün doldurma süresinin ve 2D'nin çalışma süresinin eşit olduğu anlamına gelir. Bu, ikinci boyutta İkili pompa tarafından üretilen hızlı gradyanı gerektirir. Atık suyun tamamı analiz edildiğinde hiçbir pik kaybı olmaz. Bu, özellikle bilinmeyen numunelerin analizi için yararlıdır. Veri analizi için birleştirilmesi gereken çok sayıda 2D kromatogram ile sonuçlanır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>F22M81203</td>
			<td>Mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aconitum pendulum</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Herb medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2198-90001</td>
			<td>Liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringes</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>3ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid phase injection bottle</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1.5ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ XL Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LTQ21991</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microporous membranes&#160;</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate XB-C18,5 &#956;m,2.1 x 200 mm</td>
			<td>Welch</td>
			<td>00201-31015</td>
			<td>Reversed-phase column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>UGT20DEC048Y</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAmide,3 &#956;m,100A</td>
			<td>Dalian Mondi Technology</td>
			<td>D2019110601</td>
			<td>Hydrophilic column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d-hplc-ms technology combined with molecular network for the identification of components in tibetan medicine aconitum pendulum

Bu çalışmada, Tibet şifalı bitkisi APB'nin karmaşık kimyasal bileşimini çözmek için moleküler ağ ile birlikte 2D-HPLC-MS teknolojisini kullanan kapsamlı bir yaklaşım kullanılmıştır. 2D-HPLC'nin uygulanmasıyla, karmaşık karışımların gelişmiş bir şekilde ayrılması sağlandı ve bu da sonraki analizler için tek tek bileşiklerin izolasyonunu sağladı. Moleküler ağ yaklaşımı, bu bileşikler arasındaki yapısal ilişkilerin aydınlatılmasına daha fazla yardımcı oldu ve potansiyel biyoaktif moleküllerin belirlenmesine katkıda bulundu. Bu entegre strateji, tesis içinde bulunan çok çeşitli kimyasal bileşenleri verimli bir şekilde tanımladı. Bulgular, diğerlerinin yanı sıra alkaloidler de dahil olmak üzere APB içinde çeşitli kimyasal bileşenler ortaya çıkardı. Bu araştırma, yalnızca bu geleneksel Tibet tıbbının fitokimyasal profilinin anlaşılmasını ilerletmekle kalmıyor, aynı zamanda potansiyel terapötik özellikleri hakkında değerli bilgiler sağlıyor. 2D-HPLC-MS ve moleküler ağın entegrasyonu, bitkisel ilaçlardaki karmaşık kimyasal bileşimleri sistematik olarak araştırmak ve tanımlamak için güçlü bir araç olduğunu kanıtlıyor ve doğal ürün keşfi alanında daha fazla araştırma ve geliştirmenin önünü açıyor.

Tibetan medicine is an integral part of traditional Chinese medicine, adhering to the principles of Tibetan medical practices, and is used for disease prevention and treatment1. However, Tibetan herbal medicine contains complex plant chemical constituents characterized by significant fluctuations in content. Limited understanding of the fundamental bioactive elements has become a bottleneck in the modernization of Tibetan medicine2. The application of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), combining the strong separation power of chromatography with the high sensitivity of mass spectrometry (MS), has been widely used in natural medicine analysis3. However, due to the limitation of a single separation mechanism, components with highly similar structures tend to coelute in one-dimensional liquid chromatography separation. In subsequent mass spectrometric analysis, the low-abundance co-eluted components are difficult to detect due to ion suppression caused by high-abundance components4.
2D-HPLC, which stands for two-dimensional high-performance liquid chromatography, represents a novel chromatographic method that harmoniously combines different separation mechanisms using a pair of columns. This includes the fusion or alternation of normal-phase chromatography with reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with reversed-phase liquid chromatography5. By merging these complementary chromatographic properties, the enhanced separation capability is achieved, effectively addressing the challenges caused by complex sample matrices6. Furthermore, by coupling two-dimensional chromatography with MS, the powerful separation ability of 2D-HPLC and the high sensitivity detection capability of MS can be fully integrated, providing support for the study of complex drug systems and their fundamental constituents7,8,9.
Tibetan medicine commonly features a multifaceted array of components and functionalities, where active ingredients typically exist in intricate compositions and at minimal concentrations. By integrating 2D-LC as a robust separation system and MS as an exceedingly sensitive detector, the challenges posed by intricate samples in terms of separation and identification can be more effectively addressed10,11,12. This amalgamation substantially contributes to advancing the exploration of the chemical composition of Tibetan medicine.
Regardless of whether it is traditional LC-MS or 2D-LC-MS, a vast amount of information can be obtained. However, extracting structural information of complex system components from this massive amount of information has always been a significant challenge. Therefore, researchers have developed various methods for screening and mining MS data. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) is an MS/MS data organization and visualization platform where 2D-LC-MS mass spectrometry data can be uploaded13. Each spectrum is considered as a vector and compared to all other spectra using cosine similarity. When the similarity between two spectra exceeds a threshold, they are connected in a molecular network (MN). This can be used for the rapid identification of known compounds and the determination of various unknown natural products14.
Tibetan medicine usually has multiple functions, but its complex composition and significant concentration differences make it difficult to effectively elucidate the relationship between function and material basis15. An in-depth study of Tibetan medicine requires the systematic characterization of as many components as possible. In the framework of this study, we intend to use APB in Tibetan medicine as the research object to demonstrate the strategy and process of systematically studying the complex chemical components of Tibetan medicine using 2D-HPLC-MS technology and MN technology. In the construction of the 2D chromatographic system, we combined reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with significant separation mechanisms to achieve more effective separation of the complex components of APB16. In addition, to overcome solvent incompatibility between the two dimensions, an at-column dilution modulation mode was adopted. By combining the powerful separation capability of 2D-LC with the high sensitivity detection capability of MS, the spectral information of the complex components in APB is obtained more effectively and comprehensively. Furthermore, through the network and visualization of massive spectral information by MN technology, the components of APB are systematically analyzed. The strategy and process demonstrated in this study are expected to be applied to the study of other Tibetan medicines, promoting research on the material basis of Tibetan medicine, which is of great significance for advancing Tibetan medicine resources and improving quality control standards for Tibetan herbs17. The overall experimental process is shown in Figure 1.
In the experiment presented here, a new at-column dilution modulator was introduced into the Agilent two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) system18. By adding an independent delivery pump, the flow path of the analysis was changed, resulting in a high orthogonality of the 2D-LC analysis. The coupling and switching between the two dimensions are accomplished by two six-port valves, as shown in Figure 2. When one sample loop is filled in the first dimension, another sample loop is analyzed in the second dimension. This means that the filling time of the 1D loop and the running time of the 2D are equal. This requires the fast gradient generated by the Binary pump in the second dimension. No peaks are lost when the entire effluent is analyzed. This is particularly helpful for the analysis of unknown samples. It results in a large number of 2D chromatograms that need to be combined for data analysis.

Yazar Spotlight: Doğal Tıp Analizinde 2D-HPLC-MS ve Moleküler Ağların Entegre Edilmesi

Tibet Tıbbında Bileşenlerin Tanımlanması için Moleküler Ağ ile Birleştirilmiş 2D-HPLC-MS Teknolojisi Aconitum sarkacı

In this study, we employed a comprehensive approach utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with molecular networking to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant APB. We want to establish a more efficient method for identifying the chemical composition of natural medicines. The main challenging of the current experiments is that the mass spectrometry section is not equipped with high-resolution mass spectrometry, resulting in the detection of different components.2D-LC-MS enables more accurate identification and the quantification of the compounds. Complex mixtures based on sample separation, combined with molecular network technology, it can be better process complex data information and it improves the efficiency and the accuracy of any size. Our laboratory will focus applying existing technologies to get the separation of natural, medicinal, chemical components.

APB, MN yöntemi ile birlikte 2D-HPLC-MS teknolojisinin fizibilitesini doğrulamak için bir model organizma olarak kullanıldı. MS ham verilerini, parametreler varsayılan olarak ayarlanmış şekilde MN'ye aktararak bir MN oluşturuldu. MN, eksiksiz bir LC-MS-MS deneyinde tespit edilen tüm moleküler iyonları ve bu moleküler iyonlar arasındaki kimyasal ilişkileri görselleştiren görsel bir hesaplama stratejisidir13.
MN, MS-MS'ye girdikten sonra bileşik taraf?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Integrating 2D-HPLC-MS and Molecular Networking in Natural Medicine Analysis at JoVE.com

Bu çalışma, Tibet şifalı bitkisi Aconitum sarkacı Busch'un (APB) karmaşık kimyasal bileşimini çözmek için moleküler ağ ile birlikte iki boyutlu yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (2D-HPLC-MS) teknolojisini kullanmaktadır. Makale, bitkisel ilaçların karmaşık kimyasal bileşenlerinin sistematik olarak araştırılması ve tanımlanması için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate ...

Bu çalışmada, Tibet şifalı bitkisi APB'nin karmaşık kimyasal bileşimini çözmek için moleküler ağ ile birlikte 2D-HPLC-MS teknolojisini kullanan kapsamlı bir yaklaşım kullandık. Doğal ilaçların kimyasal bileşimini tanımlamak için daha verimli bir yöntem oluşturmak istiyoruz. Mevcut deneylerin temel zorluğu, kütle spektrometresi bölümünün yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile donatılmamış olmasıdır, bu da farklı bileşenlerin tespit edilmesine neden olur.2D-LC-MS, bileşiklerin daha doğru bir şekilde tanımlanmasını ve miktarının belirlenmesini sağlar. Moleküler ağ teknolojisi ile birlikte numune ayırmaya dayalı karmaşık karışımlar, karmaşık veri bilgilerini daha iyi işleyebilir ve her boyutun verimliliğini ve doğruluğunu artırır. Laboratuvarımız, doğal, tıbbi, kimyasal bileşenlerin ayrılmasını sağlamak için mevcut teknolojilerin uygulanmasına odaklanacaktır.

2d-hplc-ms-technology-combined-with-molecular-network-for

Research

JoVE Journal

Medicine

2D-HPLC-MS Technology Combined with Molecular Network for the Identification of Components in Tibetan Medicine Aconitum pendulum

292 Görüntüleme.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. Bu çalışmada, Tibet şifalı bitkisi APB'nin karmaşık kimyasal bileşimini çözmek için moleküler ağ ile birlikte 2D-HPLC-MS teknolojisini kullanan kapsamlı bir yaklaşım kullandık. Doğal ilaçların kimyasal bileşimini tanımlamak için daha verimli bir yöntem oluşturmak istiyoruz. Mevcut deneylerin temel zorluğu, kütle spektrometresi bölümünün yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile donatılmamış olmasıdır, bu da farklı bileşenlerin tespit edilmesine...

Video: Yazar Spotlight: Doğal Tıp Analizinde 2D-HPLC-MS ve Moleküler Ağların Entegre Edilmesi

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant APB. Through the implementation of 2D-HPLC, enhanced separation of complex mixtures was achieved, enabling the isolation of individual compounds for subsequent analysis. The molecular network approach further aided in elucidating structural relationships among these compounds, contributing to the determination of potential bioactive molecules. This integrated strategy efficiently identified a wide array of chemical components present within the plant. The findings revealed a diverse spectrum of chemical constituents within APB, including alkaloids, among others. This research not only advances understanding of the phytochemical profile of this traditional Tibetan medicine but also provides valuable insights into its potential therapeutic properties. The integration of 2D-HPLC-MS and molecular network proves to be a powerful tool for systematically exploring and identifying complex chemical compositions in herbal medicines, paving the way for further research and development in the field of natural product discovery.

This study utilizes two-dimensional high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (2D-HPLC-MS) technology in conjunction with molecular networking to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant Aconitum pendulum Busch (APB). The article provides a detailed protocol for the systematic exploration and identification of complex chemical components of herbal medicines.

Tıp

Sample Preparation for 2D-HPLC-MS of Aconitum pendulum

Begin sample preparation by weighing the aconitum pendulum bush, or APB. Using a one by 10, 000 sensitivity balance, weigh 0.25 grams of dry APB in a three milliliter micro centrifuge tube. Add 2.5 milliliters of methanol to it and then sonicate for 30 minutes at a power of 240 watts and a frequency of 40 kilohertz.Centrifuge the sonicated sample at 1.2G for five minutes, and collect the supernatant. Filter it through a 0.22 micron membrane filter. Next, prepare the two-dimensional mobile phase by using acetyl nitrile as the organic phase or phase B, and ultra pure water containing 0.1%formic acid as the aqueous phase or phase A.After performing two-phase filtration through the 0.22 micron filter, subject the mobile phases to ultrasonic sonication at 40 kilohertz for 15 minutes.Purge the replaced mobile phase to remove the bubbles. Select a C18 column as the 1D column and a hydrophilic column as the 2D column, and mount them to the instrument. To adjust the appropriate shunt ratio, connect the 2D-LC instrument outline through a T to the mass inlet and the other end of the T to a shunted line.Adjust the flow rate to a suitable value to ensure the appropriate flow rate for the mass spectrum.

Aconitum sarkacının 2D-HPLC-MS için Numune Hazırlama

Implementing 2D-Liquid Chromatography on Aconitum pendulum Samples for Enhanced Compound Separation

To begin the 2D liquid chromatography, or 2DLC, double-click the instrument one online icon, and the chemical workstation will automatically communicate with the 1260LC and enter the workstation. For the 2DLC method parameter setting, click on the Injector module, right-click Method and set the injection volume, flow rate, and mobile phase time gradient of the 1D pump. Enter the sample runtime under Stop Time.Click on the main menu instrument and click 2DLC Method on the dropdown menu. Select Comprehensive in 2DLC mode. Enter two minutes at modulation time and 1.9 minutes at 2D gradient stop time.Set flow settings to two milliliters. Edit 2D gradient and set wavelengths. After editing the method, select Save Method As on the method menu to name the new method, and click OK.

Gelişmiş Bileşik Ayırma için Aconitum sarkaç Numunelerinde 2D-Sıvı Kromatografisinin Uygulanması

Mass Spectrometry Following the 2D-LC Operation on Aconitum pendulum Samples

To begin, turn on the switch of the vacuum pump. Open the argon cylinder main valve and the pressure divider valve, and adjust the pressure to about 0.3 megapascals. To set up the MS method, enter the runtime in minutes to 93.00 and enter values to configure acquisition time, polarity, mass range, transfer value number, transfer value duration, and more.Set up scan event details according to the values displayed on the screen. To set data dependent settings, use separate polarity settings as disabled. Set neutral loss within top to three, and product mass list within top to three.Save to configure the settings as the instrument method. Click the sequence setup button to open the sequence table. Enter the sample type, file name, path, sample id, instrument method, location, injection amount, and other information in the form.Save the information to record the sequence listing. Then click the start analysis button to set up and start MS acquisition.

Aconitum sarkaç Örneklerinde 2D-LC İşlemini Takiben Kütle Spektrometresi

Integration of Molecular Network Operation to 2D-HPLC-MS for the Analysis of Aconitum pendulum Samples

To begin the data preparation, export 2D HPLC-MS raw mass spectral data. Next to connect to the GNPS FTP server in the WINSCP interface on the Session Configuration page, fill in the connection information. After filling in the information, click the Start button to establish a connection to the GNPS FTP server.Create molecular networks by opening a web browser and visiting the GNPS website. New users need to sign up for an account and then log in. On the main interface of the GNPS website, click Create Molecular Network under Data Analysis.On the Task Creation page, click the select Input Files button, then select and upload the data file. In the Workflow Option tabs, set the various parameters that generate the molecular network or MN.These parameters include the peak extraction algorithm, peak over travel value, similarity calculation method, and so on. After making the appropriate parameter settings as needed, click the Submit button at the bottom of the page to run the task.After the task runs, find the created tasks in the Jobs tab and click the workflow name to view the analysis results. The website provides MN diagrams, substitutes, symbiotic networks, and other related information. Four of the alkaloid components in the APB samples identified by the MN were aconitine, 14-benzoylaconine, 14-O-acetylneoline and hypaconitine.The four compounds had the same parent nucleus. Aconitine, 14-benzyl aconine, 14-benzoylaconine, and hypaconitine were similar, and only the substituents were different.