Wir danken Dr. Caroline Burns vom Boston Children's Hospital für die großzügige Bereitstellung des transgenen Zebrafischs. Wir danken Frau Elizabeth Ibanez für ihre Hilfe bei der Haltung von Zebrafischen an der UT Dallas. Wir schätzen auch alle konstruktiven Kommentare von D-Inkubator-Mitgliedern an der UT Dallas. Diese Arbeit wurde von NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) und dem UT Dallas STARS-Programm (Y.D.) unterstützt.

Die Genehmigung für diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Texas in Dallas unter der Protokollnummer #20-07 erteilt. Für die vorliegende Studie wurden Tg(myl7:nucGFP)- transgene Zebrafischlarven12 verwendet. Die gesamte Datenerfassung und Bildnachbearbeitung erfolgte mit Open-Source-Software oder Plattformen mit Forschungs- oder Bildungslizenzen. Die Ressourcen sind auf begründete Anfrage bei den Autoren erhältlich.
1. Zebrafischzucht und Embryonen-Mikroinjektion
Dauer: 2 Tage
<ol><li>Pflegen und züchten Sie erwachsene Zebrafische durch Standardpflege- und Zuchtverfahren. Detaillierte Methoden finden Sie im vorherigen Bericht13.</li>
	<li>Führen Sie die Mikroinjektion gemäß dem festgelegten Protokoll14 durch. Für die vorliegende Studie wurde die Mikroinjektion im 1-2-Zell-Stadium (Zygote) durchgeführt. HINWEIS: Es ist wichtig, dieses Stadium für eine effektive Mikroinjektion genau zu identifizieren und die Konsistenz der Entwicklung sicherzustellen. Während des Ein-Zell-Stadiums bildet sich eine kleine Kuppel auf dem Eigelb, und dieses Stadium dauert typischerweise etwa 12 Minuten. Beim Übergang zum Zwei-Zell-Stadium werden zwei benachbarte Kuppeln sichtbar, und dieses Stadium dauert etwa 45 Minuten nach der Befruchtung15. Detailliertere Informationen zum Systemaufbau finden Sie in anderen Berichten oder Protokollen 12,16,17.</li>
</ol>2. Vorbereitung und Montage von Zebrafischembryonen/-larven
Dauer: 7 Tage
<ol><li>Embryonen 1 Tag nach der Befruchtung (dpf) in E3-Wasser mit 0,2 mM 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) (siehe Materialtabelle) übertragen, um die Bildung von Pigmenten zu verhindern.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium täglich durch frisches E3-Wasser mit PTU bis zur LSM-Bildgebung.</li>
	<li>Bilden Sie Embryonen oder Larven mit dem Stereomikroskop ab, um ihre Entwicklung zu den gewünschten Zeitpunkten zwischen 0 und 7 dpf aufzuzeichnen.</li>
	<li>Bereiten Sie segmentierte Röhrchen aus fluoriertem Ethylenpropylen (FEP) mit 2 mm Innendurchmesser für die Einbettung von Zebrafischlarven unter das LSM-System12 vor. HINWEIS: Das FEP-Rohr wird verwendet, um die Probe mit Brechungsindex-passenden Materialien zu sichern, die dem umgebenden Medium, wie z. B. Wasser, sehr ähnlich sind.</li>
	<li>Ab 3 dpf den Fisch in eine 150 mg/l Tricain (MS-222)-Lösung (siehe Materialtabelle) umfüllen, um die Fische vor der Bildgebung zu immobilisieren.</li>
	<li>0,8 % niedrigschmelzende Agarose mit 150 mg/l Tricain zubereiten und mit einer Transferpipette den betäubten Fisch in die Agarose bringen, sobald sie auf Raumtemperatur abgekühlt ist18.</li>
	<li>Verwenden Sie eine andere Transferpipette, um den Fisch mit Agarose in FEP-Röhrchen zu montieren (Abbildung 1). HINWEIS: Um die minimale Belastung in den sich entwickelnden Embryonen zu ermitteln, wurden Untersuchungen der Herzaktivität vor und nach der Fixierung, wie z. B. der Herzfrequenz, unter mikroskopischer Beobachtung durchgeführt. Diese Bewertungen zielten darauf ab, signifikante Unterschiede vor und nach der Tricainanästhesie zu identifizieren. Eine zusätzliche Untersuchung der Haut und Muskulatur auf Unregelmäßigkeiten in der Herzstruktur, wie z.B. Ödeme, könnte auch nach der Fixation durchgeführt werden. Die Konzentration von Tricain spielt auch in der kardialen Bildgebung eine entscheidende Rolle19, und daher wurde in diesem Projekt die Tricainlösung mit einer Konzentration von 150 mg/L für die Darstellung der Kontraktion bei Zebrafischlarven verwendet. Während die vorliegende retrospektive Synchronisation es uns ermöglicht, die unregelmäßigen Herzschläge20 zu behandeln, befindet sich eine umfassende Lösung für die 4D-Bildgebung von Herzrhythmusstörungen und die Langzeitbildgebung bei Zebrafischen noch in der Entwicklung.</li>
</ol>3. Einrichtung und Konfiguration des Light-Sheet-Imaging-Systems
Dauer: 3-14 Tage
<ol><li>Aufbau eines internen LSM-Systems auf Basis einer Zylinderlinse unter Verwendung von diodengepumpten Festkörperlasersystemen (DPSS) mit kontinuierlicher Welle bei bestimmten Wellenlängen wie 473 nm und 532 nm als Beleuchtungsquellen (Abbildung 2A).</li>
	<li>Passen Sie die LabVIEW-Steuercodes (siehe Materialtabelle) für die Synchronisation des translatorischen Probentisches, der Lichtblattbeleuchtung und der Belichtung der sCMOS-Kamera an, um Bildsequenzen zu erfassen. HINWEIS: Detailliertere Informationen zum Systemaufbau finden Sie in anderen Berichten oder Protokollen 12,16,17. Wir ermutigen Forschungsgruppen, nach Kooperationsmöglichkeiten mit Labors zu suchen, die über fundiertes Fachwissen in der optischen Bildgebung während des Systembaus verfügen.</li>
</ol>4. Vorbereitung und Datenerfassung von Zebrafisch-Aufnahmen
Zeit: 1 Tag
<ol><li>Kalibrieren Sie die räumliche Auflösung des LSM-Systems und minimieren Sie Opazitätsschwankungen in unterschiedlichen Tiefen durch Messung von Fluoreszenzperlen.<ol><li>Zunächst werden fluoreszierende Kügelchen (siehe Materialtabelle) mit einem Durchmesser von 0,53 μm unter Verwendung von 0,8 % niedrigschmelzender Agarose auf eine Konzentration von 1: 1,5 x 105 verdünnt und die Lösung in das segmentierte FEP-Röhrchen überführt.</li>
		<li>Zweitens verwenden Sie das LSM-System, um die Beads abzubilden und die Punktstreufunktion (PSF) über die gesamte Probe zu messen, um die räumliche Auflösung und Systemausrichtung zu validieren12. HINWEIS: In diesem System zeigt die Analyse repräsentativer Ergebnisse für die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) laterale und axiale Auflösungen von 1,26 ± 0,15 bzw. 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 Perlen). Dies deutet auf eine konsistente räumliche Auflösung über die gesamte Abbildungstiefe hin.</li>
	</ol></li>
	<li>Befestigen Sie das FEP-Röhrchen mit montierter Zebrafischlarve sicher am motorisierten 6-Achsen-Probentisch (x, y, z, Pitch, Yaw und Roll) und tauchen Sie die Röhrchen in die mit E3-Wasser gefüllte Probenkammer. Um die Lichtstreuung durch den Dottersack zu vermeiden und die Position des Herzens besser zu lokalisieren, drehen Sie die Zebrafischlarve, um ein Bild von der ventralen Seite aufzunehmen (Abbildung 2B). In diesem Fall würden die meisten aufgenommenen Bilder sowohl den Ventrikel als auch den Vorhof enthalten (Abbildung 2C). HINWEIS: Da die aktuellen Bildgebungsverfahren in der Regel weniger als eine Stunde pro Fisch dauerten und in einer Umgebung mit kontrollierter Raumtemperatur durchgeführt wurden, werden die Kammertemperaturregelung und die Regulierung des Sauerstoffgehalts für dieses Projekt als optional angesehen. Für längerfristige zeitraffergestützte Bildgebungsstudien, insbesondere solche, die sich auf Entwicklungsprozesse konzentrieren, wird jedoch eine kontinuierliche Temperaturüberwachung und -regelung bei 27 °C in der Probenkammer empfohlen, um die physiologische Umgebung des Zebrafischs zu gewährleisten und mögliche Entwicklungsanomalien zu verhindern.</li>
	<li>Schließen Sie den motorisierten Probentisch an die Workstation an und konfigurieren Sie alle erforderlichen Parameter, einschließlich des gewünschten Bewegungsmodus.</li>
	<li>Stellen Sie eine Verbindung zwischen der sCMOS-Kamera und der Workstation her. Passen Sie alle wesentlichen Einstellungen an, wie z. B. eine Belichtungszeit von 5 ms und den gewünschten Bereich of Interest.</li>
	<li>Konfigurieren Sie die Anzahl der Bildsequenzen und Frames innerhalb des benutzerdefinierten LabVIEW-Steuerungsprogramms.</li>
	<li>Schalten Sie den Laser ein und starten Sie die LSM-Bildgebung der Probe. Pflegen Sie den Prozess, bis alle Bildsequenzen erfolgreich aufgezeichnet wurden.</li>
	<li>Nehmen Sie 300 Bilder als 2D-Bildsequenz auf, um 3-5 Herzzyklen der Larve mit einer Bildrate von 200 Bildern/Sekunde abzudecken. Die Aufnahme erfasst die Kontraktilität des Herzens in der selektiven Ebene, die vom Lichtblatt beleuchtet wird.</li>
	<li>Bewegen Sie die Larve in Schrittweite von 1 μm über die Lichtblattbeleuchtung, um die Probe virtuell zu schneiden. HINWEIS: Die Schrittweite des Abtasttisches sollte basierend auf der axialen Auflösung des Lichtblattsystems gemäß dem Nyquist-Shannon-Abtasttheorem12 eingestellt werden.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 7, um eine weitere Bildsequenz des neuen Probenschnitts aufzunehmen, bis das gesamte Herz bedeckt ist. In der Regel gewährleisten 100-200 Bildsequenzen mit einer Schrittweite von 1 μm die Abdeckung des gesamten Herzens einer Zebrafischlarve (Abbildung 2D). HINWEIS: Die Schritte 4.7 bis 4.9 werden vom LabVIEW-Programm gesteuert und automatisch vom LSM-System ausgeführt (Abbildung 3). Angesichts der großen Menge an erzeugten Bilddaten empfiehlt sich eine standardisierte Namenskonvention für Bildsequenzen. Legen Sie beispielsweise Ordner mit Namen wie "z-1", "z-2" usw. fest, um Daten über verschiedene Bildsequenzen hinweg zu kategorisieren. Innerhalb jeder Sequenz sollten die Bilder fortlaufend benannt werden (z. B. "1", "2", ...), um unterschiedliche Zeitpunkte zu kennzeichnen. Die Gesamtzeit für das Aufstellen von Fischen, das Einstellen des Aufnahmewinkels und das Sammeln aller Daten für eine Zebrafischlarve beträgt etwa 1 h.</li>
</ol>5. 4D-Bildrekonstruktion mit paralleler Berechnung
Zeit: 1 Tag HINWEIS: Der von unserer Gruppe entwickelte 4D-Rekonstruktionsalgorithmus und die Beispieldaten sind öffentlich zugänglich21. Diese Methode ermöglicht es, das 4D-Herzbild aus den in den vorherigen Schritten gesammelten Bildsequenzen zu rekonstruieren (Tabelle 1).
<ol><li>Öffnen Sie die Datei test_Parallel.m in MATLAB (siehe Materialtabelle). Geben Sie den Speicherort des Ordners an, in dem die Rohbildsequenzen in der Variablen "baseDir" gespeichert werden.</li>
	<li>Weisen Sie die Variable "numOfSlice" mit der Gesamtzahl der Bildsequenzen (typischerweise 100-150) und die Variable "numOfImage" mit der Anzahl der Bilder (typischerweise 300-500) in jeder Sequenz zu.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Bildsequenz, die die mittlere Ebene des Zebrafischherzens zeigt (z. B. die 51. Sequenz von insgesamt 101 Sequenzen). Identifizieren Sie die Bildnummern der ersten und vierten Systole in dieser Sequenz und weisen Sie sie den Variablen systolicPoint_1st und systolicPoint_4th zu.</li>
	<li>Klicken Sie auf Ausführen , um den Vorgang zu starten. HINWEIS: Die Länge des Herzzyklus in jeder Bildsequenz wird zunächst vom MATLAB-Programm durch einen Vergleich der Ähnlichkeit (Summe der quadrierten Unterschiede) zwischen Bildern zu verschiedenen Zeitpunkten ermittelt. Anschließend wird der Herzzyklus anhand des Durchschnitts der Zykluslängen aus allen Bildsequenzen geschätzt. Als nächstes werden die Startpunkte von Bildsequenzen an verschiedenen axialen Positionen vom Programm durch einen iterativen Vergleich der Bildähnlichkeit von der ersten Bildsequenz bis zur letzten Bildsequenz ausgerichtet.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Ergebnisse im Ausgabeordner. Das Programm speichert die Bilder als ".tif"-Dateien mit Zeitstempeln. Jede ".tif"-Datei ist ein 3D-Herzbild zu einem bestimmten Zeitpunkt. Das Zeitintervall zwischen zwei 3D-Bildern entspricht der eingestellten Belichtungszeit. HINWEIS: Rekonstruieren Sie die aufgenommenen Bilder aus den vorherigen Schritten, um die 4D-Herzkontraktionen (3D räumlich + 1D zeitlich) darzustellen. Um die Kompetenz bei Hochdurchsatzuntersuchungen während der retrospektiven Synchronisation zu verbessern, ermöglicht dieser Ansatz gleichzeitige Rechenoperationen auf einer GPU, indem mehrere CPU-Kerne über die MATLAB-Toolbox für paralleles Computing genutzt und Bilder in das gpuArray-Format umgewandelt werden.</li>
</ol>6. 3D Zellsegmentierung und Zellverfolgung
Zeit: 1 Tag
<ol><li>Laden Sie das 3DeeCellTracker-Paket herunter (siehe Materialtabelle) und richten Sie die Python-Umgebung22 ein.</li>
	<li>Laden Sie die ITK-SNAP-Annotationssoftware23 herunter (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie sie, um das 3D-Herzbild in zwei ausgewählten Zeitpunkten, einem an der ventrikulären Diastole und dem anderen an der ventrikulären Systole, manuell zu beschriften, um die Trainings- und Validierungsdatensätze zu erstellen. HINWEIS: Möglicherweise ist auch eine andere Etikettierungssoftware anwendbar.</li>
	<li>Führen Sie in Python das Trainingsprogramm 3DeeCellTracker aus und initialisieren Sie die Parameter noise_level(in diesem Fall 100), folder_path und Modell in der Funktion TrainingUNet3D , um das vordefinierte 3D-U-Net-Modell festzulegen.</li>
	<li>Verwenden Sie in MATLAB das Programm imageDimConverter.m , um den Trainings- und Validierungsdatensatz in das richtige Format zum Laden zu konvertieren und umzubenennen.</li>
	<li>Laden Sie in Python die Trainings- und Validierungsdatasets mithilfe der Funktionen trainer.load_dataset() und trainer.draw_dataset().</li>
	<li>Führen Sie in Python den ersten Teil des Tracking-Programms 3DeeCellTracker aus und initialisieren Sie die Parameter. HINWEIS: Dazu gehören die Definition von Bildparametern zur Charakterisierung von Bildabmessungen, Segmentierungsparameter zur Auswahl des für die Zellsegmentierung verwendeten maschinellen Lernmodells und Tracking-Parameter zur Auswahl der vortrainierten tiefen neuronalen Netzwerkmodelle, die für die Zellregistrierung verwendet werden. Für den erstmaligen Einsatz wird der Einsatz des U-Net-Modells für die Zellsegmentierung und FFN+ PR-GLS für die Zellregistrierung empfohlen. Es wird benötigt, um Daten, Modelle und Ergebnisse in Ordnern zu speichern, die in diesem Schritt automatisch erstellt werden.</li>
	<li>Verwenden Sie in MATLAB das Programm imageDimConverter.m , um alle 3D-Herzbilder in das richtige Format zu konvertieren und umzubenennen und sie in den im letzten Schritt erstellten Datenordner zu übertragen.</li>
	<li>Führen Sie in Python den zweiten Teil des 3DeeCellTracker-Programms aus, um die Segmentierung zu starten.</li>
	<li>Sobald das erste 3D-Bild segmentiert ist, vergleichen Sie das Segmentierungsergebnis mit dem Rohbild und führen Sie eine manuelle Korrektur durch, wenn eine falsche Segmentierung gefunden wird. Verschieben Sie die korrigierte Segmentierung in den erstellten Ordner "/manual_vol1".</li>
	<li>Führen Sie in Python den dritten Teil des 3DeeCellTracker-Programms aus, um alle Bilder zu segmentieren.</li>
	<li>Verwenden Sie Amira (siehe Materialtabelle), um eine visuelle Bewertung der Tracking-Ergebnisse durchzuführen, indem Sie die Positionen der verfolgten Zellen mit den entsprechenden Rohbildern vergleichen. Wenn die Testergebnisse nicht zufriedenstellend sind, beginnen Sie das Verfahren ab Schritt 6.6 erneut, verwenden Sie ein alternatives Machine Learning-Modell für die Segmentierung oder Zellregistrierung und starten Sie dann den Nachverfolgungsprozess erneut. HINWEIS: Nach der Segmentierung werden die Daten der Zellenbeschriftungen standardmäßig als 8-Bit-Bild (0 bis 255) gespeichert, was bedeutet, dass nur 256 Skalen als Beschriftungen für die Zellenklassifizierung bereitgestellt werden. Es gibt zwei Lösungen, um dieses Problem zu beheben, wenn zusätzliche Klassen benötigt werden. Eine Lösung besteht darin, das Format der Daten von Zellbeschriftungen als 16-Bit-Bild im Tracking-Programm einzustellen, was zu einer exponentiellen Erhöhung der Verarbeitungszeit führt, im vorliegenden Fall mehr als zwei Tage. Die andere Lösung besteht darin, das Programm "separateTrackingResults.py" zu verwenden, um die Zellenbeschriftungen nachzubearbeiten, wodurch Zellen mit denselben Beschriftungen basierend auf ihrer physischen Position getrennt und jeder Zelle eine andere Beschriftung zugewiesen wird. Dieser Vorgang dauert in diesem Fall etwa 10 Minuten.</li>
</ol>7. Kardiale Kontraktilitätsanalyse im Virtual-Reality-Modus
Zeit: 1 Tag
<ol><li>Erfassen Sie das Ergebnis der Zellverfolgung aus den vorherigen Schritten.</li>
	<li>Validieren Sie die Daten manuell und wählen Sie Zellen mit konsistenter Bildintensität über alle Volumina hinweg aus (ca. 500 von ca. 600 Zellen).</li>
	<li>Verwenden Sie das Skript cellLabelsToObj.ipynb 21 , um ein Oberflächennetz für jede einzelne Zelle mit der 3D-Slicer-Software24 zu erzeugen (siehe Materialtabelle) und weisen Sie jeder Zelle einen eindeutigen Farbcode zu.</li>
	<li>Exportieren Sie jedes 3D-Modell, das aus allen Zellen zu einem einzigen Zeitpunkt besteht, als eine einzelne .obj-Datei, die aus mehreren Unterobjekten besteht, begleitet von einer .mtl-Datei zur Beschreibung der Zellenbeschriftung.</li>
	<li>Importieren Sie die Modelle in Unity mit der Bildungslizenz, einer Entwicklungs-Engine, die für Extended Reality verwendet wird.</li>
	<li>Wenden Sie die benutzerdefinierten Skripte, die aus in C# geschriebenen Funktionen bestehen, auf die Modelle und Benutzeroberflächenelemente an, um eine 4D-Visualisierung und interaktive Analyse zu ermöglichen. Führen Sie die VR-Interaktion nach Schritt 7.7 durch.</li>
	<li>Interagieren Sie mit den Modellen in der virtuellen Realität (VR) mit den folgenden Funktionen (Abbildung 4):<ol><li>Zellenauswahl: Wählen Sie bis zu zwei Zellen gleichzeitig aus und zeigen Sie deren Trajektorien, Geschwindigkeiten, Volumina, Oberflächen und relative Entfernungen an.</li>
		<li>Zeitpunktauswahl: Wählen Sie einen bestimmten Zeitpunkt in den Daten aus, um die Ausgaben der ausgewählten Zellen zu analysieren, z. B. bei t = 0 ms während der Diastole oder bei t = 200 ms während der Systole.</li>
		<li>Zeitpause: Frieren Sie das dynamische Modell ein, um sich auf die ausgewählten Zellen und ihre Ausgaben zu konzentrieren.</li>
		<li>Kontrast: Modulieren Sie den Kontrast zwischen den ausgewählten Zellen und den umgebenden Zellen im Modell.</li>
	</ol></li>
</ol>

Analyse der Herzkontraktion von Zebrafischen mit Virtual-Reality-Interaktion

<ol>
	<li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging.">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li><li>Liu, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development.">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circ. 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Methods. 10 (7), 599-600 (2013).</li><li>Messerschmidt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+to+capture+4-dimensional+images+of+the+effects+of+modulating+shear+stress+on+the+developing+zebrafish+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart.</a> J Vis Exp. 138, e57763 (2018).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+light-sheet+imaging+and+interactive+analysis+of+cardiac+contractility+in+Zebrafish+larvae.">4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae.</a> Zenodo. , (2023).</li><li>Wen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3deecelltracker,+a+deep+learning-based+pipeline+for+segmenting+and+tracking+cells+in+3d+time+lapse+images.">3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images.</a> Elife. 10, e59187 (2021).</li><li>Yushkevich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=User-guided+3D+active+contour+segmentation+of+anatomical+structures:+significantly+improved+efficiency+and+reliability.">User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability.</a> Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).</li><li>Fedorov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Slicer+as+an+image+computing+platform+for+the+quantitative+imaging+network.">3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network.</a> Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).</li><li>Naderi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning-based+framework+for+cardiac+function+assessment+in+embryonic+zebrafish+from+heart+beating+videos.">Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos.</a> Comput. Biol. Med. 135, 104565 (2021).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+light-sheet+for+rapid+imaging+of+cardiopulmonary+system.">Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system.</a> JCI Insight. 3 (16), e121396 (2018).</li><li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research.">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).</li><li>Coelho-Filho, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cardiomyocyte+hypertrophy+by+cardiac+magnetic+resonance:+implications+on+early+cardiac+remodeling.">Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling.</a> Circulation. 128 (11), 1225 (2013).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+segmentation+and+cardiac+mechanics+analysis+of+evolving+zebrafish+using+deep+learning.">Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning.</a> Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291 (2021).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), e97180 (2017).</li><li>Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+reality+for+interactive+medical+analysis.">Virtual reality for interactive medical analysis.</a> Front. Virtual Real. 3, 782854 (2022).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+reality+for+biomedicine.">Extended reality for biomedicine.</a> Nat. Rev. Methods Prim. 3 (1), 1-1 (2023).</li></ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Die Integration des Zebrafischmodells mit ingenieurwissenschaftlichen Methoden birgt ein immenses Potenzial für die In-vivo-Erforschung von Myokardinfarkt, Arrhythmien und angeborenen Herzfehlern. Durch die Nutzung ihrer optischen Transparenz, ihrer Regenerationsfähigkeit und ihrer genetischen und physiologischen Ähnlichkeiten mit dem Menschen wurden Zebrafischembryonen und -larven in der Forschung ausgiebig genutzt 1,2,4<...

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist aufgrund seiner optischen Transparenz, genetischen Lenkbarkeit und Regenerationsfähigkeit ein weit verbreiteter Modellorganismus zur Untersuchung der kardialen Entwicklung, Physiologie und Reparatur 1,2,3,4. Während sich strukturelle und funktionelle Veränderungen beim Myokardinfarkt auf den Herzauswurf und die Hämodynamik auswirken, behindern technische Einschränkungen weiterhin die Fähigkeit, den dynamischen Prozess während der kardialen Regeneration mit der hohen raumzeitlichen Auflösung zu untersuchen. Beispielsweise haben herkömmliche bildgebende Verfahren wie die konfokale Mikroskopie Einschränkungen in Bezug auf die Bildgebungstiefe, die zeitliche Auflösung oder die Phototoxizität, um die dynamischen Veränderungen zu erfassen und die kontraktile Funktion des Herzens während mehrerer Herzzyklen zu beurteilen5.
Die Lichtblattmikroskopie stellt eine hochmoderne Bildgebungsmethode dar, die diese Probleme erfolgreich löst, indem sie den Laser schnell über den Ventrikel und den Vorhof des Herzens streicht und so detaillierte Bilder mit verbesserter räumlich-zeitlicher Auflösung und vernachlässigbaren Photobleich- und phototoxischen Effekten erzielt 6,7,8,9,10,11.
Dieses Protokoll führt eine umfassende Bildgebungsstrategie ein, die den Aufbau von LSM-Systemen, 4D-Bildrekonstruktion, 3D-Zellverfolgung und interaktive Analyse umfasst, um die Dynamik von Kardiomyozyten im gesamten Herzen während mehrerer Herzzyklen zu erfassen und zu analysieren12. Das maßgeschneiderte Bildgebungssystem und die Computermethodik ermöglichen es, die Myokardmikrostruktur und die kontraktile Funktion auf Einzelzellebene in transgenen Tg(myl7:nucGFP)- Zebrafischlarven zu verfolgen. Darüber hinaus wurden niedermolekulare Verbindungen mittels Mikroinjektion in die Embryonen eingebracht, um arzneimittelinduzierte Herzschäden und anschließende Regeneration zu beurteilen. Diese ganzheitliche Strategie bietet einen Einstiegspunkt, um in vivo strukturelle, funktionelle und mechanische Eigenschaften des Myokards auf Einzelzellebene während der Herzentwicklung und -regeneration zu untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RESOURCE</td>
			<td>SOURCE/Reference</td>
			<td>IDENTIFIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish</td>
			<td>Burns Lab in Boston Children&#39;s Hospital</td>
			<td>ZDB-TGCONSTRCT-070117-49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks Inc.</td>
			<td>R2023a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>2017 SP1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>4.6.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>The Python Software Foundation</td>
			<td>3.9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-ImageJ</td>
			<td>Schneider et al.18</td>
			<td>1.54f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DeeCellTracker</td>
			<td>Chentao Wen et al.15</td>
			<td>v0.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unity</td>
			<td>Unity Software Inc.</td>
			<td>2020.3.2f1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2021.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Slicer</td>
			<td>Andriy Fedorov et al.17</td>
			<td>5.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITK SNAP</td>
			<td>Paul A Yushkevich et al.16</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-sheet system</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACY254-050-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Illumination objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00045</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Detection objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2M585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized XYZ stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3/M-Z8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-axis tilt stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GN2/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation stepper motor</td>
			<td>Pololu</td>
			<td>1474</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-0556-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473nm DPSS Laser</td>
			<td>Laserglow</td>
			<td>R471003GX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow</td>
			<td>R531003FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector and vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PV850</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2522B-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Pulled Glass Pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TIP10LT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tip for gel loading</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virtual reality hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VR headset</td>
			<td>Meta</td>
			<td>Quest 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mg/L PTU solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X E3 working solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Agarose</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10g/L Tricaine stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>SYNC-M-GR-US02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150mg/L Tricaine working solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10g/L Tricaine stock solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X E3 stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>-</td>
			<td>KCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>-</td>
			<td>CaCL2 x 2H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>-</td>
			<td>MgSO4 x 7H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X E3 working solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X E3 stock solution</td>
			<td>Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Methylene Blue (optional)&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>C16H18ClN3S</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d light-sheet imaging of zebrafish cardiac contraction

Der Zebrafisch ist ein faszinierender Modellorganismus, der für seine bemerkenswerte kardiale Regenerationsfähigkeit bekannt ist. Die Untersuchung des kontrahierenden Herzens in vivo ist unerlässlich, um Einblicke in strukturelle und funktionelle Veränderungen als Reaktion auf Verletzungen zu gewinnen. Es bleibt jedoch eine Herausforderung, hochauflösende und schnelle 4-dimensionale (4D, 3D räumliche + 1D zeitliche) Bilder des Zebrafischherzens zur Beurteilung der Herzarchitektur und Kontraktilität des Herzens zu erhalten. In diesem Zusammenhang werden ein hauseigenes Lichtblattmikroskop (LSM) und kundenspezifische Computeranalysen eingesetzt, um diese technischen Einschränkungen zu überwinden. Diese Strategie, die LSM-Systemkonstruktion, retrospektive Synchronisation, Einzelzellverfolgung und benutzergesteuerte Analyse umfasst, ermöglicht es, die Mikrostruktur und die kontraktile Funktion über das gesamte Herz mit Einzelzellauflösung in den transgenen Tg(myl7:nucGFP)- Zebrafischlarven zu untersuchen. Darüber hinaus sind wir in der Lage, Mikroinjektionen von niedermolekularen Verbindungen zu integrieren, um Herzverletzungen auf präzise und kontrollierte Weise zu induzieren. Insgesamt ermöglicht dieser Rahmen die Verfolgung physiologischer und pathophysiologischer Veränderungen sowie der regionalen Mechanik auf Einzelzellebene während der kardialen Morphogenese und Regeneration.

The zebrafish (Danio rerio) is a widely used model organism for studying cardiac development, physiology, and repair due to its optical transparency, genetic tractability, and regenerative capacity1,2,3,4. Upon myocardial infarction, while structural and functional changes impact the cardiac ejection and hemodynamics, technical limitations continue to hinder the ability to investigate the dynamic process during cardiac regeneration with the high spatiotemporal resolution. For example, conventional imaging methods, such as confocal microscopy, have limitations in terms of imaging depth, temporal resolution, or phototoxicity for capturing the dynamic changes and assessing cardiac contractile function during multiple cardiac cycles5.
Light-sheet microscopy represents a state-of-the-art imaging method that successfully addresses these issues by quickly sweeping the laser across the heart&#39;s ventricle and atrium, achieving detailed images with enhanced spatiotemporal resolution and negligible photo-bleaching and photo-toxic effects6,7,8,9,10,11.
This protocol introduces a comprehensive imaging strategy that includes LSM system construction, 4D image reconstruction, 3D cell tracking, and interactive analysis to capture and analyze the dynamics of cardiomyocytes across the entire heart during multiple cardiac cycles12. The customized imaging system and computational methodology allow&#160;one to track the myocardial microstructure and contractile function at the single-cell level in transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Furthermore, small molecule compounds were delivered into the embryos using microinjection to assess drug-induced cardiac injury and subsequent regeneration. This holistic strategy provides an entry point to in vivo investigate structural, functional, and mechanical properties of myocardium at the single-cell level during cardiac development and regeneration.

Autor im Rampenlicht: Hochauflösende 4D-Lichtblatt-Bildgebung und Virtual Reality im Zebrafisch zur Einzelzellanalyse der Herzfunktion

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

Our research uses 4D light-sheet imaging to explore cardiac contractile function in zebrafish, aiming to understand the dynamics of cardiac contraction at the single-cell level. One of the foremost experimental challenges is achieving high spatial terminal resolution, dynamic imaging of cardiac function while observing natural heart rhythms. Our study fills the gap in analyzing intricate 4D cardiac dynamic at single-cell resolution.We utilize GPU-based parallel computation, virtual reality, and advance cell tracking to interpret light-sheet imaging data. Our novel virtual reality platform offers an interactive approach to assess regional cardiac contractions, providing manipulative functionalities for more in-depth analysis. By facilitating user-directed analysis of cardiac contraction, our protocol could lead to an enhanced understanding of cardiac development and disease.

Das aktuelle Protokoll besteht aus drei Hauptschritten: Zebrafischpräparation und Mikroinjektion, Lichtblattbildgebung und 4D-Bildrekonstruktion sowie Zellverfolgung und VR-Interaktion. Erwachsene Zebrafische durften sich paaren, die befruchteten Eier wurden gesammelt und bei Bedarf Mikroinjektionen für die vorgeschlagenen Experimente durchgeführt (Abbildung 1). Dieser Schritt bietet einen Einstiegspunkt für die Erforschung von Zebrafischanwendungen bei der Untersuchung der kardialen Ent...

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Dieses Protokoll verwendet Lichtblatt-Bildgebung, um die kontraktile Funktion des Herzens in Zebrafischlarven zu untersuchen und Einblicke in die Herzmechanik durch Zellverfolgung und interaktive Analyse zu gewinnen.

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

Unsere Forschung verwendet 4D-Lichtblatt-Bildgebung, um die kontraktile Funktion des Herzens im Zebrafisch zu untersuchen, mit dem Ziel, die Dynamik der Herzkontraktion auf Einzelzellebene zu verstehen. Eine der größten experimentellen Herausforderungen besteht darin, eine hohe räumliche terminale Auflösung und dynamische Bildgebung der Herzfunktion bei gleichzeitiger Beobachtung des natürlichen Herzrhythmus zu erreichen. Unsere Studie schließt die Lücke bei der Analyse komplizierter 4D-Herzdynamik mit Einzelzellauflösung.Wir verwenden GPU-basierte parallele Berechnungen, virtuelle Realität und fortschrittliches Zelltracking, um Lichtblatt-Bildgebungsdaten zu interpretieren. Unsere neuartige Virtual-Reality-Plattform bietet einen interaktiven Ansatz zur Beurteilung regionaler Herzkontraktionen und bietet manipulative Funktionen für eine tiefergehende Analyse. Durch die Erleichterung der benutzergesteuerten Analyse der Herzkontraktion könnte unser Protokoll zu einem besseren Verständnis der Herzentwicklung und -erkrankung führen.

4d-light-sheet-imaging-of-zebrafish-cardiac-contraction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

865 Aufrufe.  The University of Texas at Dallas. Unsere Forschung verwendet 4D-Lichtblatt-Bildgebung, um die kontraktile Funktion des Herzens im Zebrafisch zu untersuchen, mit dem Ziel, die Dynamik der Herzkontraktion auf Einzelzellebene zu verstehen. Eine der größten experimentellen Herausforderungen besteht darin, eine hohe räumliche terminale Auflösung und dynamische Bildgebung der Herzfunktion bei gleichzeitiger Beobachtung des natürlichen Herzrhythmus zu erreichen. Unsere Studie schließt die Lücke bei der Analyse komplizierter 4...

Serie: Autor im Rampenlicht: Hochauflösende 4D-Lichtblatt-Bildgebung und Virtual Reality im Zebrafisch zur Einzelzellanalyse der Herzfunktion

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.